Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS-продуцент моноклонального антитела к фактору некроза опухолей-альфа человека Советский патент 1989 года по МПК C12N5/00 A61K39/395 

СП

О

vj

;О

31507791

; Изобретение относится к гибридом- нЛй технологии.

i Цель изобретения - получение гиб- ррдного штамма, продуцирующего монокло нальное антитело (мон AT) к фактору HiiKposa опухолей-альфа (ФНО-Ю чело- Bi Ka, обладающего биохимической однородностью и высокой специфичностью.

Штамм получают следующим образом. 10

Ньшей линии ВА1В/С иммунизируют по 2 -недельной схеме. 20 мкг Р в 0,15м NaCl в смеси с равным объемом пэлного адьюванта Фрейнда дважды вводит внутрибрюшинно с интервалом в 7 дней. За 3, 2 и 1 день до слияния 1 } мкг Р ФНО-о вводят внутрибрюшинно в 0,5 мл 0,15 М NaCl. Гибридизацию 1,2 X 10 клеток селезенки иммунных ьшeй и 4 X 10 клеток миеломы мыши }i.63-Ag8-653 проводят 50%-ным раство- IOM полиэтиленглиголя мол.массой 000, содержащего 5%-диметилсульфокси ;;a, в течение 1,5 мин. После гибридизации и отмьшки клеток от полиэтилен- гликоля клетки высевают в 96-луночные 1 анели по 1 X 10 спленоцитов в лунку Для культивирования и селекции гибридом используют среду 1ЩЦ4 (модифицированная Iskove S среда Дульбекко) добавлением 10%ной эмбриональной те.рячьей сыворотки 5

-Л

10

,-4

М гипоксантина,

Ъ т

4 X 10 М аминоптерина и 1,6 х 10 |гимидина. Гибриды-продуценты клонируют 2 раза методом конечных- разведений зысевая по 1- клетке в лунку, содер- 4 х 10 клеток селезенки. После Z клонирований практически 100% суб- лонов продуцируют мон AT к Р ФНО-с/. Тродукция антитела сохраняется как (минимум в течение 15 пассажей в куль гуре.

Гибридома получила условное назва- ие 13D10, штамм депонирован под номером ВСКК(П) 173D.

Культуральные признаки.

Стандартные условия культивирования. Среда IMDM с 10% донорской ;телячьей сьшоротки, 2х10 М глутамина ;100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/-мл :Стрептомицина, 0,05x10 М меркапто- этанола, , атмосфера 5%-ного COj

Для выращивания штамма используют :стеклянную посуду, посевная доза 100- :200 тыс.клеток/мл, клетки пассируют один раз в 2-3 дня, кратность рассева 1:6-1:8, культура суспензионная

Культивирование в организме животных. Для выращивания асцита пригодны

0

5 0

5

0

5

мыши BALB/C. Мышам за 7-30 дней до инъекции клеток штамма вводят внутрибрюшинно по 0,5 мл пристана. Клетки инъецируют внутрибрюшинно по 2-5x10 клеток/мл среды IMDM. Асцит формируется через 12-14 дней. Продуктивность щтамма. Секреция моноклонального антитела на 2-3-й день культивирования составляет 14-20 мкг/мл культуральной Среды и 5-7 мг/мл. асцитной жидкости при определении иммуноферментным методом.

Характеристика полученного продукта. Штамм продуцирует моноклональ- ное антитело IgGI. Специфичность - НФОчь.

Методы оценки сохранения специфичности: тест на связьшание-мон AT с им- мобилизированным ФНО-с (иммунофермен- тньй анализ).

Антиген сорбируют на пластине: 500 нг в 50 мкл 0,1 М бикарбонатного буфера, рН 9,6, в течение ночи при 4°С. После отмьшки наносят тестируемую культуральную среду, после инкубации и отмывки определяют количество сорбированных антител меченными перок- сидазой кроличьими антимышиными антителами. Все отмывки проводят бидисти- лированной водой. Контролем служит бычий сьшороточньй альбумин (БСА) в качестве антигена.

Криоконсервирование. Для длительного хранения клетки штамма замораживают в эмбриональной телячьей сьшоротке с добавлением 10% диметилсульфоксида. Режим- замораживания: 1°С/мин до . После замораживания клетки переносят в жидкий азот. Размораживание на водяной бане при 37 С. Жизнеспособность клеток после размораживания 55-60% по окрашиванию трипановым синими

Контаминация. Бактерии и в культуре, не обнаружены при длительном наблюдении и посевах.на питательные среды. Заражение микоплазмой не выявлено при окрашивании красителями на ДНК. и по характеру включения тнмиди- новой метки.

П Р и М е Р 1, Тест на определение специфичности взаимодействия мон AT с антигенами, иммобилизованными на пластине Р ФНО-, Р ФНО- и ВСА в количестве 0,5 мкг в 50 мкл 0,1 М карбонатного буфера рЯ 9,6 вносят в лунки 96-ячеечных микроплат и сорбируют в течение ночи при 4°С. После отмьшок в ячейки вносят по 50 мкл

культуральной среды штамма 13D10 или разведенных 1:5000 в 0,01 М фосфатном буфере, рН 7,4, 0,15 М NaCl, 1 % БСА (ЗРФ-БСА) поликлональных кроличьих , антител, специфичных к Р ФНО-о. Панель инкубируют 2 ч при 20°С, затем отмывают 5 раз бидистиллированной водой и вносят по 50 мкл/лунку кроличьи противомышиные антитела, меченные 10 пероксидазой, разведенные 1:2500 в ЗФР-БСА, и меченные пероксидазой профугирования. С 0,3 мл полученног о сорбента смешивают 5 мг сульфатной фракции асцита гибридомы 13D10, инкубируют на горизонтальной качалке 1 ч при комнатной температуре, заполняют гелем микроколонку из пастеровской пипетки и промывают ее ТБР. Образцы Р ФНО-о и Р ФНО-/Э готовят на минимальной среде, модифицированной Дуль- бекко.(DMEM) с 5% ЭТС, глютамином, меркаптоэталоном, пенициллином и стрептивокроличьи антитела 1:2500 в ЗФР-БСА. томицином (полная среда (DMEM). 0,5 мл

фугирования. С 0,3 мл полученног о сорбента смешивают 5 мг сульфатной фракции асцита гибридомы 13D10, инкубируют на горизонтальной качалке 1 ч при комнатной температуре, заполняют гелем микроколонку из пастеровской пипетки и промывают ее ТБР. Образцы Р ФНО-о и Р ФНО-/Э готовят на минимальной среде, модифицированной Дуль- бекко.(DMEM) с 5% ЭТС, глютамином, меркаптоэталоном, пенициллином и стреп

Изобретение относится к области гибридомной технологии. Цель изобретения - получение гибридного штамма, продуцирующего моноклональное антитело (мон АТ) к фактору некроза опухолей-альфа (ФНО-α) человека, обладающее биохимической однородностью и высокой специфичностью. Штамм депонирован под номером ВСКК/П/ N173Д. Штамм продуцирует мон АТ JGG1 - изотипа, связывающееся с ФНО-α человека. Содержание мон АТ в 1 мл культуральной среды и 1 мл асцитной жидкости составляет соответственно 14-20 мкг и 5-7 мг. Продукция антитела сохраняется как минимум в течение 15 пассажей в культуре. Мон АТ штамма гибридомы может быть использовано для иммуносорбции Р ФНО-α, а также для очистки последнего. 2 табл.

После инкубации в течение 1 ч при

20 С плату отмывают и в лунки добавля-15 чение 15 мин, затем собирают и стери- ют субстрат - ортофенилендиамин гид- лизуют фильтрацией через фильтр с диа- рохлорид 0,6 мкг/мл в цитратно-фос- метром пор 0,22 мкм. фатном буфере, рН 4,7, содержащем Биологическую активность факторов 0,03% HjOg. Реакцию останавливают че- определяют по лизису клеток мышиной рез 10 мин 1 М серной кислотой и учи- 20 фибробластоидной линии Ь)29 в присуттьшают на спектрофотометре с верти- .кальным лучом при длине волны 492 нм. Результаты опыта по изучению специфичности связывания мои AT, продуцируемого клетками штамма 13D10, с антигенами, иммобилизованными на пластине, представлены в табл.1.

Таблица 1

1 ПП ,

Результаты свидетельствуют о высокой специфичности мон AT, вырабатьшае- мого клетк ами штамма 13D10, и пока- зьшают возможность применения этого мон AT для определения Р ФИО-с с помощью иммуно-ферментного метода. Высокая константа аффинности мон AT штамма 13D10 создает дополнительные преимущества при использовании в имму- нофермрнтном анализе.

Пример 2. Сорбция Р ФИО-oi мон AT штамма 13D10. К 1 мл 5ра-сефа- розы 4В добавляют 1 мл кроличьей ан

тисьюоротки к иммуноглобулинам мыши и ., вуют о специфическом связывании бир- инкубируют 1 ч при комнатнЬй темпе- логической активности рекомбинантного ФНО-с мон AT штамма 13D10. Таким образом, мон AT штамма 13D10 может

ратуре Несвязавшиеся антитела ртмы- -вают 0,05 М трис-НС1,0,15 М NaCl, рН 7,4 (ТБР), путем многократного центрибыть использовано для иммуносорбции

образца пропускают через колонку в теS

ствии актиномицина, Накануне, теста клетки L929 рассеивают по 50 тыс/лунку в плоскодонные 6-ячеечные микроплаты в полной среде DMEM. ОБразцы ФИО раститровывают в отдельном планшете в объеме 100 мкл, затем переносят- в плату с клетками L929, добавляют актиномицин до концентрации 1

мкг/мл и помещают Б термостат с температурой 37°С на 16-20 ч. Результаты учитывают после окрашивания клеток 0,2%-ным раствором генцианвиолета в 2%-ном метаноле в течение 10-12 мин. Оптическую плотность лунок измеряют 5 при длине волны 540 нм на спектрофотометре с вертикальным лучом. Результаты опыта по сорбции Р ФНО-i/ мон AT штамма 13D10 представлены в табл.2.

0

40

Таблица 2

Рекомбинантный ФИО-0 445

Рекомбинантный ФНО- 316

1308

413

Данные этого примера свидетельстбыть использовано для иммуносорбции

715077918

с целый изучения биологических эффек- Формула изобретения тов Р ФНО-о(, а также для его очист- Штамм гибридных культивируемых ки. -клеток животных Mus Musculus ВСКК

5 (П) № 173D - продуцент моноклрнальОптическая плотность окрашенных ного антитела к фактору некроза опу- интактных клеток составляет 1290. холей-альфа человека.