Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS - продуцент моноклонального антитела к фактору некроза опухолей - альфа человека Советский патент 1989 года по МПК C12N15/00 A61K39/395 

Изобретение относится к гибредом- ноЙ технологии и может быть использо- вано для определения и иммуносорбтгии фактора некроза опуу-олей- человека (ФНО-oi,).

Цель изобретения - получение штамма, продуцирующего моноклональное антитело к ФИО-об изотипа G2b с повышенным титром в асците.

Штамм получают следугощим образом.

Мышей линии BaLb/c иммунизируют по двухнедельной схеме. 20 мкг реком- бинантного ФНО-оС(р ФИО-ос) в 0,15 М NaCl в смеси с равным объемом пс;лнего адьюванта Фрейнда дваяцты РПОДЯТ внутрибрюшинно с интервалом в 7 дней, За 3, 2 и 1 день до слияния 10 мкг

ФНО-ii вводят внутрибрюии П о ь 0,5 мл 0,15 М NaCK ГЪтбриди laniDO 1,2x10 клеток Селезенки иммунных Mitiueff и

клеток М1 елоьм мь.шп ХбЗ-АаЯ-653

проводят 50%-ui.jM раствором полиэти- ленгликоля мол.массы 4000, содержащего 5% диметилсульфоксида, в течение 1,5 KtiH. После г г.бридизации и отмывки от полиэтиленгл11коля клетки высевают в 9в-луноч1 ие панепи по 1 х 10 спленоиитов в лунку. Для культивирования и селекции гибридом используют среду 1М1)М (модифицированная Iskove s с. .да Дульбеккс; с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТО),

ел

Од

О

а

со

00

10 М гипоксантина, 4 х

аминоптерина и

,6 X тимиднна. Гибридные

продуценты клш ируют - цаза конечных разведений, высевая по 1 клетке в лунку, содержащую 4 х 10 клеток селезенки. После двух клониро- ваний практически 100% субклонов продуцируют AT к Р ФИО- . Продукция антитела сохраняется как минимум в-течение 15 пассажей н культуре.

Полученный штамм 7G1 депонирован под номером ВСКК(П) № 172D и характеризуется следун: ш;ртми признаками.

Культуральные признаки. Стандартные условия культивирования, Среда IMDM с 10% донорской телячьей сыво- ротки, 2 X 10 М Ь-г. 1утамина, 100 мкг/м пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,05 X 10 М меркаптоэтанолз, при 37 С и и атмосфере 5% СО . Для вы ращивания штамма используют стеклян- ную посуду, посевная доза 100-200 тыс клеток на 1 мл, клетки пассируют i раз в 2-3 дня,кратность рассева 1:6--1;8. Культура суспензионная,

Культивирование рганизме живот- ных. Для выращивания а цита пригодны мыши BALB/C. Мьшам за 7-30 дней до инъекции клеток шт,- ,. вводят внутри- брюшинно по 0,5 мл npucTai a, Клет1чИ инъецируют внутрибрюшйнио по 2-5 х X 10 клеток ь I мл среды If-ffiM. Лсцит формируется через 12-14 дней,

Биосинтез полезного продукта.Секреция моноклонального антитела (ММАТ) на 2-3 день культипрфования составля- ет 25-30 мкг/мл кулг,туральт1ой среды и 7-8 мг в 1 мл агпигной жидкости при определении и тмун;.ф|. рмснтн1 1м м т одом,

Характеристика полученигя о продукта. Штамм продуцирует моноклональное антитело IgG2b. Специфичность - ФНО-oi

Методы оценки сохранения специфичности; тест на свкзывяиие с иммобилизованным ФНО--оС (им)уцофермс нт- ный анализ).

Антиген сорбируют на плястико: 500 нг в 50 мкл 0,1М бикарбонатного буфера, рН 9,6, ночь при °С, Затем после отмывки наносят тестируемую культуральную среду и после инкуба- Ц1Ш и отмывки определяют ко:п-гчество сорбированных антител меченньр-ш перок- сидазой кроличьими анти-мыгаииь т антителами. Все отмывки проводят Оидистил лированной водой. Контролем служит бычий сывороточный аль бумин н качест ве антигена.

Стабильность продукции. Продукция монАТ сохраняется как минимум до 15

п

-

Q

5

0

5

na(-:c fiA; и ill vitco. В ; Сци ji ii,;.:it штамм не пяссировалгя бол- ) раза.

Контаминация. Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды. Заражение м 1коплазмой не выявлено при окрашивании красителями на ДНК и по характеру вг.лючения тимидиновой метки.

Криоконсервирование. Для длительного хранения клетки штамма замораживают в эмбриональной телячьей сыворотке с добавлением 10% диметилсуль- фоксида. Режим замораживания: 1°С/мин до -70 С. После замораясивания клетки переносят в жидкий азот. Размораживание на подиной бане при 37°С. Жизнеспособность клеток после размораживания 65-70% по окрашиваншо трипано- вым синим.

Пример 1. Гибридомные клетки помещают в стеклянньш флакон объемом 50 мл по 1 X 10 клеток в 5 мл среды с 10% ЭТС, 2 мМ об-глютамина, 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина. 0,05 м11 меркаптоэтанола. Клет- 1Ш культивируют 2-3 дня при 37 С в атмосфере 5 СО. Полученный суперна- тант используют в качестве реагента в имтчунохимических реакпиях (как препарат монАТ).

Тест на определение специфичности взгимодейстиия монАТ с антигенами, икпчобилизованными на пластике.

Используемый метод: и ; :yкoфepмeнт- вый анализ.

Р ФНО-сС, Р и бычий сывороточный альбумин. (БСЛ) в количестве 0,5 мкг в 50 мкл 0,1 М карбонатного буфера рН 9,6, вносят в лунки 96-яче- ечных мякроплат и сорбируют ночь при , После отмывок в ячейки вносят по 50 мкл культуральной среды штамма 7G1 или разведенных 1:5000 в 0,01 М фосфатном буфере, рН 7,4, 0,15 М NaCl , 1% БСА (ЗФР-БСА) поликлональ- ных кроличьих антител, специфичных к Р ФИО-об. Панель инкубируют 2 ч при , затем отмывают 5 раз бидистилли- рованной водой и вносят по 50 мкл/лун- ку кроличьи противомышиные антитела, меченные пероксидазой, разведенные 1/2500 в ЗФР-БСА, и меченные пероксидазой противокроличьи антитела 1/2500 в ЗФР-БСА, После инкубации в течение 1 ч при 20 С плату отмывают и в лунки

добавляют субстрат - ортофенилеидиа- мингидрохлорид, 0,6 мг/мл в цитратно- фосфатном буфере рН 4,7, содержащем 0,03% . Реакцию останавливают через 10 мни М серной кислотой и учитывают на спектрофотометре с вертикальным лучом при длине волны 492 нм.

Результаты опыта по изучению специфичности связывания монАТ, продуцируемого клетками штамма 7G1, с антигенами, иммобилизИрованными на пластике, представлены в табл,1.

Результаты зтого примера свидетель ствуют о высокой специфичности монАТ, вырабатываемого клетками штамма 7G1, и показьтают возможность применения этого монАТ для определения Р ФИО-в с помощью иммуноферментного метода.

Данные табл.1 показьгоают, что монАТ 7G1 из культуральной среды гиб- рндомы взаимодействуют с ФНО-обпрак- тически одинаково с кроличьей антисывороткой в разведении 1:5000 (2563 и 2584 соответственно). Специфичность связывания монАТ с . при этом выше, чем у папиклональньк антител (по отношению к связыванию с БСА и ФИО- ji ) ,

П р и м е р 2. Сорбция Р ФНО-ос монАТ штамма 7G1.

К 1 мл Spa-сефарозы 4В добавляют 1 мл кроличьей антисыБоротки к иммуноглобулинам мьтш и инкубируют 1 ч при комнатной температуре. Несвязавшиеся антитела отмывают 0,05 М трис-НС1, 0,15 MNaCl., рН 7,4 (ТБР) рутем многократного центрифугирования, 0,3 мл полученного сорбента смешивают с 5 мг сульфатной фракции асцита гибридомы 7G1, инкубируют на горизонтальной качалке 1 ч при комнатной температуре, заполняют гелем микроколонку из пастеровской пипетки и промывают ее ТБР. Образцы Р ФИО- об и Р ФИО- р готовят на минимальной среде, модийшцированной Дульбекко (ДНЕМ) с 5% ЭТС, глютамином, меркаптоэтано- лом, пенициллином и стрептомицином (полная среда ДМЕМ). 0,5 мл образца пропускают через колонку в течение 15 мин, затем собирают и стерилизуют фильтрацией.

Биологическую активность факторов определяют по лизису клеток мыаиной фибробластоидной линии 1929 в присутствии актниомицина Д. Накануне теста клетки 1929 рассевают- по 50 тыс /лунк

в плоскодонн UJ 96-ячеё-чные михргтлаты в полной среде ,Q;;м. Образцы ФИО рас- титровывают в отдельном 1и7аншете в объеме 100 мкл, затем переносят п плату с,клетками 1929, добавляют актино- мицин D до концентрации 1 мкг/мл и помещают в термостат с температурой на 16-20 ч. Результаты учитывают после окрашивания клеток 0,2%-ным раствором генцианвиолета в 2%-ном ме- таноле в течение 10-12 мин. Оптическую плотность лунок измеряют при длине волны 540 нм на спектрофотометре с вертикальным лучом. Лизису клеток 1929 соответствует снижение оптической плотности лунок.

Результаты опыта по сорбции Р ФИО- oL монАТ штамма 7G1 представлены в табл.2.

Оптическая плотность окрашенных интактных клеток 1290.

25

0

5

0

0

5

Из данных табл.2, следует, что пропускание через колонку с монАТ 7G1 образца ФИО- об приводит к потере его цитотоксической активности, что подтверждает специфичность монАТ и возможность их применения для им- муносорбции.

П р и м е р 3. Определение проводят в соответствии с примером 1, но вместо культурапьной среды штамма 7G1 в лунки с сорбированным ФИО вносят соответствующие разведения асцита 7G1 на ЗФР-БСА.

Результаты показывают, что при разведении асцита 1:1000000 оптическая плотность в ИФА (А492х10) составляет 380 и, таким образом, титр асцита превышает 1:.1000000.

Использование гибридо -1ы 7G1 позво- 5 ляет получать монАТ изотипа G2b,4To создает преимущества по сравнению с монАТ изотипа G1 при очистке на аффинных колонках с протеином. А золотистого стафилококка, а также создает возможность экономии асцита при

определении ФИО.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Musmusculus ВСКК(Н) № 172D - продуцент моноклонального антитела к фактору некроза опухолей - альфа человека.

Таблица 1

Изобретение относится гибридомной технологии и может быть использовано для определения и иммуносорбции фактора некроза опухолей-α человека (ФНО-α). Цель изобретения - получение штамма, продуцирующего моноклональное антитело к ФНО-α изотипа G2B с повышенным титром в асците. Штамм 7G 1 получен путем иммунизации мышей линии BALB/C рекомбинантным ФНО-α. Далее гибридизуют клетки селезенки иммунных мышей и клетки миеломы мыши Х63-AG8-653 и затем проводят селекцию и клонирование. Полученный штамм депонирован под номером ВСКК(П) N 172D. Штамм продуцирует монАТ JGG2B, специфичность - ФНО-α. Титр асцита превышает 1:1000000. 2 табл.

А492 - оптическая плотность лунок при 492 нм.

15

Таблица 2