Способ определения концентрации лактогенных рецепторов Советский патент 1992 года по МПК G01N33/04 

Ј

Использование биология, исследование компонентов молочных продуктов посредством рецепторного анализа с использованием меченых гормонов Сущность изобретения: из проб молока коров выделяют мембраны жировых глобул Рецепторный анализ проводят в присутствии меченого I ч и немеченого пролактина Последний используют в концентрации 0,84 120 нМ, инкубируют в буфере с рН 4,5-5,0 Центрифугируют полученную смесь измеряют зна чение радиоактивности полученного осадка Устанавливают количество связанного меченого прол актина и по нему опре деляют концентрацию лактогенных рецепторов. 2 ил. 3 табл

Изобретение относится к биологии - к способам исследования и анализа материалов путем определения их физико-химических свойств, в частности к способам исследования компонентов молочных продуктов посредством рецепторного анализатора с использованием меченых гормонов.

Известен способ определения концентрации лактогенж. рецепторов.

При этом способе рецепторный материал получают путем взятия ткани молочной железы у коров,

Недостатком этого способа является ограниченность количества рецепторного материала, трудоемкость его выделения и хирургическое вмешательство при взятии ткани молочной железы, приводящее к ее Травмированию.

Наиболее близким к предлагаемому является способ определения содержания лактогенных рецепторов.

Суть способа-прототипа заключается в том, что мембраны жировых шариков выде ляют из молока кроликов и подвергают ре- цепторному анализу путем добавления меченого I 25 и немеченого пролактина Смесь помещают в инкубационный буфер с рН 7,4-7,5 и выдерживают в течение 24 ч, затем мембраны отделяют от буфера центрифугированием Количество связанного меченого пролактина определяют по радиоактивности осадка, концентрацию рецептора определяют по графику Скэтчарда

Недостатком прототипа является условие связывания пролактина с мембранами жировых шариков, а именно применение инкубационного буфера с рН 74-75 при котором невозможно определить содержание лактогенных рецепт оров на мембранах жировых шариков молока коров

Цель изобретения - повышение точности способа.

XI

сл

о сл

Указанная цель достигается тем, чго пир инкубировании смеси мембран жировых глобул молока коров используют буфер с рН 4,5-5,0 и немеченый пролактин в кон центрации 0,84-120 нМ.

Проведение рецепторного анализа в кислой среде увеличивает тбчность и чувствительность способа, так как в интервале рН 4,5-5,0 обеспечиваются оптимальные условия специфического связывания про- лактина с мембранами жировых шариков молока коров.

Использование инкубационного буфера с рН 4,5-5,0 позволяет получить достоверные значение содержания рецепторов в лактогенных гормонах.

При значении рН инкубационного буфера менее 4,5 пролактин выпадает в осадок, что ведет к искажению данных о количестве пролактина и препятствует проведению рецепторного анализа, При значениях рН больше 5,0 снижается процесс специфического связывания пролактина с мембранами жировых шариков молока, вследствие этого уменьшается точность и чувствительность способа.

Влияние рН на специфическое связывание пролактина с мембранами секреторных клеток молока крольчих известно: традиционное значение рН инкубационного буфера составляет 7,4-7,5. Влияние рН на специфическое связывание пролактина с мембранами жировых шариков молока коров неизвестно.

Уточнение диапазона концентрации немеченого пролактина, добавляемого в инкубационный буфет, позволяет сократить объем экспериментов и увеличить точность способа, так как в нужном диапазоне концентрации немеченого пролактина получают больше данных по связыванию пролактина с лактогенными рецепторами мембран жировых глобул молока.

С использованием математических методов при обработке полученных данных более точно определяется концентрация лактогенных рецепторов мембран жировых глобул молока коров.

Выбор оптимальных концентраций немеченого пролактина обусловливается свойствами исходного рецепторного материала, а именно константами сродства пролактина и лактогенных рецепторов, а также концентрацией лактогенных рецепторов.

Эти свойства изучены для лактогенных рецепторов, локализованных на плазматических мембранах секреторных клеток тканей различных органов. Для мембран жировых глобул молока рецепторный анализ проведен только у кроликов.

Впеолые установлен оптимальный диа пазон концентрации немеченого пролакти на для проведения рецепгорного анализа мембран жировых глобул молока коров.

Константу диссоциации (К) и непосредственно концентрацию рецепторов (Q) определяют по графику Скэтчарда методом регрессионного анализа (с помощью программы Дельта, разработанной в МГК, для двухцентровой модели связывания).

Указанные параметры являются основными физико-химическими параметрами, характеризующими процесс комплексообра- зования. Модельная функция, описывающая

связывание лиганда со специфическими центрами, имеет вид

Всп I

Q. L

i 1

К, +L

0)

где Всп - количество специфически связанного гормона;

L - равновесная концентрация свобод- ного гормона;

п - количество центров связывания. Для определения параметров системы (К и Q) наиболее часто применяют методы, основанные на преобразовании уравнения (1) к виду, удобному для графического определения параметров. Широкое распространение в настоящее время получило представление данных по гормон-рецеп- торному взаимодействию в координатах Скэтчарда

Bcn/L i Qi/K,-(1/Ki)Bi , (2) i 1

где BI - количество гормона, специфически связанного с центром связывания.

В случае одного типа рецепторов это уравнение характеризует линейную зависимость между отношением количества связанных и свободных молекул гормона (ВСп/0 и концентрацией гормон-рецепторного комплекса (Всп). График этой зависимости представляет собой прямую линию с наклоном - 1/К, которая отсекает на оси ординат отрезок, равный Q/K, а на оси абсцисс Q,

В случае существования 2 типов рецепторов график Скэтчарда представляет собой вогнутую кривую, асимптоты к которой отсекают на оси ординат отрезки, равные Qi/Ki

и Q2/K2, а на оси абсцисс QI и Q2.

Пример, Берут 400 мл молока коровы, центрифугируют в течение 30 мин при 18000 д. Полученные сливки промывают трехкратно 0,25 М раствором сахарозы (10 m M

MgCte). замораживают в концентрации 35% по жиру при 40°С в течение 18 ч. Затем сливки нагревают до 36°С, центрифугируют в течение часа при 100 000 д(4°С). Осадок промывают 2 раза 0,04 М фосфатно-цитрат- ным буфером с рН 4.8 (10 m M MgCIa), осаждают при центрифугировании в течение часа при 10000д(4°С),

Полученные мембраны гомогенизируют в промывочном буфере и определяют концентрацию белка методом Лоури. В 14 пробирок, содержащих по 0 5 мл мембран в концентрации 100 мкг/мл по белку, добавляют по 0,1 мл меченого I125 пролактина (100 000 импульсов/мин) и по 0,05 мл немеченого пролактина с различной концентрацией (от 0,84 до 120нМ).

В контрольной пробе (1) немеченый пролактин отсутствует. Вместо него добавляют 0,05 мл буфера, Смесь инкубируют при 20°С в течение 24 ч, Свободный и связанный с мембранами пролактин разделяют центрифугированием проб, надосадочную жидкость отсасывают. Радиоактивность осадка определяют на приборе Сотри-Gamma (фирма, LKB). Константу диссоциации и концентрацию рецепторов определяют по графику Скэтчарда методом регрессионного анализа, в котором используют полученные данные о количестве меченого пролактина, связанного с мембранами жировых глобул молока коров. Зная удельную активность меченого пролактина, а также количество добавленного к мембранам меченого и натив- ного пролактина, вычисляют концентрации специфически связанных (В) и свободных молекул гормона (L), а также их отношение (B/L). Представив таким образом экспериментальные данные (B/L от В, фиг 1), методом регрессии определяют параметры взаимодействия На фиг. 1 пунктиром изображена линия регрессии, вычисленная по уравнению 1 с помощью определенных параметров взаимодействия. Параметры взаимодействия пролактина с рецепторами мембран жировых глобул молока коров показаны в табл. 1.

Обработку экспериментальных данных проводят на ЭВМ с помощью программы Дельта, разработанной в МГУ,

Как свидетельствуют данные табл. 2, при концентрации добавляемого немеченого пролактина боле 120 нМ обеспечивается только неспецифическое связывание меченого I мролэкгинас мембранами жировых глобул молом Этим объясняются граничные значения концентрации немеченого пролактина, взятые в пределах от 0,84 до 120 нМ,

Результаты излучения влияния величины рН инкубационной среды на специфическое связывание пролактина представлены в табл. 3 и фиг. 2.

Результаты экспериментов подтверждают правильность выбора значений рН инкубационного буфера, равных 4,5-5,0, и концентрации пролактина, равной 0,84-120 нМ, использование которых позволяет повысить точность способа определения лак- тогенных рецепторов в молоке корок, Процент специфического связывания пролактина с жировыми шариками молока крольчихи в способе-прототипе равен 2530, В предлагаемом решении он достигает до 43%, т.е. на 13-18% выше. Влияние концентрации немеченого пролактина на специфическое связывание меченого |125 пролактина показано в табл. 2.

Следовательно, предлагаемый способ повышает точность и чувствительность известного способа, высокоэффективен при использовании в научных и дй а гнЪ стиче- ских исследования, так как получение большого количества мембран жировых глобул из молока коров дает возможность проводить параллельные исследования, повышающие надежность предлагаемого способа Формула изобретения

Способ определения концентрации лак- тогеиных рецепторов, предусматривающий выделение мембран элировых глобул из исследуемых проб молока с последующим рецепторным анализом в присутствии меченого I и немеченого пролактина, инкубирование в буфере, центрифугирование, установление количества связанного меченого пролактина по радиоактивности полученного осадка и определение концентрации лактогенных рецепторов в зависимости от установленного количества связанного меченого пролактина, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и расширения функциональных

возможностей, выделение мембран жировых глобул осуществляют из исследуемых проб молока коров, причем немеченый пролактин используют в концентрации 0 84 120 нМ, а буфер с рН 4,5-5,0

1 d 6 л и ц д 1

Таблица 2

Таблица 3

Spesiju Binding

Transform plot 9(/N)

1372

З/L (E-1)

Ш1 7,3V9 7,037

-j

ел o

O5

л

,725 ,W

.90

ЖГГ

W455,05,5

Влияние рн инкубационного буфера на специфическое сдязыбание с МХГН Фиг.2

е