СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ КОМПЛЕКСА ЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ Советский патент 1995 года по МПК C12N9/36 C12N9/36 C12R1/64 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской промышленности.

Изобретение касается способа получения ферментных комплексов, лизирующих грамположительные микроорганизмы, в том числе стафилококки, множественно устойчивые к антибиотикам.

Известен способ выделения комплекса литических ферментов, известного под названием "лизоамидаза", из фильтрата культуральной жидкости Xanthomonas campestris ВКПМ В-4102, включающий концентрирование раствора, содержащего литический комплекс, ультрафильтрацию на системе Multiplate TC 1D фирмы "Amicon" c мембраной ИМ-10, фракционное осаждение сульфатом аммония (40-80% от насыщения), диализ, лиофильную сушку.

Наиболее близким к предлагаемому способу по совокупности существенных признаков и достигаемому эффекту является способ выделения комплекса литических ферментов ("лизоамидазы") из фильтрата культуральной жидкости Xanthomonas campestris ВКПМ В-4102, предусматривающий охлаждение фильтрата, дробное осаждение ацетоном с последующим осаждением сульфатом аммония, диализ и лиофильную сушку. Согласно данному способу к фильтрату, полученному сепарированием или центрифугированием культуральной жидкости, добавляют охлажденный до +5^оС ацетон из расчета 1 объем на 1 объем фильтрата, выдерживают в течение 1 ч на холоду, осадок отделяют. К осветленному раствору добавляют 1,5 объема ацетона на 1 объем исходного фильтрата, выдерживают 1 ч без перемешивания, осадок отделяют сепарированием. К супернатанту добавляют сульфат аммония до 80% от насыщения, выдерживают 5 ч и отделяют осадок сепарированием. Осадок растворяют в дистиллированной воде, осуществляют диализ при +5^оС до электропроводности диализуемого раствора 6,0 mS. Отдиализованный раствор лиофильно сушат. Получают препарат с бактериологической активностью 18,3 ед/мг препарата. Выход продукта от содержания его в культуральной жидкости составляет 20,6% При осуществлении данного способа в полупромышленных условиях получают препарат с бактериологической активностью 30-40 ед/мг препарата или 120-200 ед/мг белка и протеолитической активностью 1,5-2,0 ед/мг препарата или 6-10 ед/мг белка. Выход по бактериолитической активности составляет 27% по протеолитической 15% Выход продукта с 1 л культуральной среды составляет: по бактериолитической активности 7,05 тыс.ед. по протеолитической 0,23 тыс. ед. Недостатками данного способа являются низкий выход продукта и многоступенчатость процесса.

Цель изобретения повышение выхода продукта и упрощение процесса.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу выделения комплекса литических ферментов, предусматривающему охлаждение фильтрата культуральной жидкости, полученной при культивировании штамма Xanthomonas campestris ВКПМ В-4102, осаждение целевого продукта органическим растворителем, охлаждение с выдержкой и отделение осадка, диализ и лиофильную сушку, перед осаждением фильтрат подкисляют до рН 3,5-5,0, осаждение ведут этанолом в количестве 2,5-3,5 объема на объем фильтрата, а диализ осуществляют непосредственно после отделения осадка.

Получают препарат с бактериолитической активностью 40-50 ед/мг препарата или 200-260 ед/мг белка и протеолитической активностью 25-4,0 ед/мг препарата или 10-18 ед/мг белка. Выход продукта от его содержания в культуральной жидкости составляет: по бактериолитической активности 40-60% по протеолитической 20-30% Выход продукта с 1 л культуральной жидкости составляет: по бактериолитической активности 45-50 тыс.ед. по протеолитической 3,6-4,0 тыс. ед.

Полнота осаждения комплекса литических ферментов зависит от рН исходного фильтрата (табл. 1) и от соотношения объемов этанола и фильтрата (табл. 2).

Оптимальными условиями для более полного осаждения комплекса ферментов являются рН фильтрата культуральной жидкости 4,0-4,5 и соотношение объемов этанола и фильтрата 2,5:1. Дальнейшее увеличение соотношения не приводит к повышению выхода.

Бактериологическую активность определяют следующим образом: к 2 мл суспензии лиофилизированных клеток Micrococcus lysodeikticus в 0,01 М Трис-буфере рН 8,4-8,5 с концентрацией 0,5-0,6 ед. оптической плотности (ФЭК 56 М, δ_кюв. 3 мм, с/ф N 6), прогретой в течение 10 мин, при 37^оС, добавляют 0,1 мл пробы, смесь инкубируют 5 мин, при 37^оС. Активность рассчитывают по формуле
E(ед/мл) где D₀ оптич. плотность контроля;
D оптич. плотность пробы после инкубации;
t время инкубации, мин;
Р разведение пробы;
0,01 оптич. плотность, соответствующая 1 ед. активности;
0,1 объем пробы, мл.

За единицу бактериолитической активности принимают такое количество фермента, которое при 37^оС в течение 1 мин уменьшает оптическую плотность 0,06% суспензии клеток Micrococcus lysodeikticus при измерении на фотоэлектроколориметре при зеленом светофильтре в кювете с толщиной слоя 3 мл на 0,01.

Протеолитическую активность измеряют по скорости гидролиза казеина. За единицу протеолитической активности принимают такое количество фермента, которое при 37^оС в течение 10 мин превращает в неосаждаемое трихлоруксусной кислоты состояние казеина в количестве, соответствующем повышению оптической плотности реакционной смеси при 280 нм на 1,0.

П р и м е р 1. 13 л фильтрата культуральной жидкости, полученной при культивировании штамма Xanthomonas campestris ВКПМ В-4012, охлаждают, подкисляют 2 н. HCl до рН 4,0 и при перемешивании приливают 325 л охлажденного этанола. Перемешивают еще 20 мин и оставляют суспензию без перемешивания на 10 ч при t 0-(+3)^oC. Выпавший осадок отделяют на сепараторе. Влажный осадок (1490,5 г) растворяют в 6,5 л дистиллированной воды, подкисляют до рН 4,0 и диализуют против дистиллированной воды в течение 8 ч до электропроводности диализуемого раствора 4,5 mS. Отдиализованный раствор лиофильно сушат.

Получают 136,5 г препарата с бактериолитической активностью 48 ед/мг препарата или 266 ед/мг белка и протеолитической активностью 3,8 ед/мг препарата или 21,1 ед/мг белка. Выход продукта от его содержания в культуральной жидкости составляет: по бактериолитической активности 52,5% по протеолитической 26,2% Выход продукта с 1 л фильтрата культуральной жидкости составляет: по бактериолитической активности 50,7 тыс.ед. по протеолитической 3,99 тыс.ед.

П р и м е р 2. 5 л фильтрата культуральной жидкости Xanthomonas campestris ВКПМ В-4102 подкисляют до рН 4,5, а далее обрабатывают по примеру 1.

Получают 4,9 г сухого препарата с бактериолитической активностью 46 ед/мг препарата или 230 ед/мг белка и протеолитической активностью 3,7 ед/мг препарата или 18,5 ед/мг белка. Выход продукта от его содержания в культуральной жидкости составляет: по бактериолитической активности 46,2% по протеолитической 25,5% Выход продукта с 1 л фильтрата составляет: по бактериолитической активности 45 тыс.ед. по протеолитической 3,6 тыс.ед.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет увеличить выход продукта за счет усовершенствования стадии осаждения ферментного комплекса органическим растворителем, что позволило исключить стадию осаждения сульфатом аммония. Кроме того, устранение стадии осаждения сульфатом аммония позволяет уменьшить сброс на очистные сооружения больших количеств отработанных растворов с сульфатом аммония и, соответственно, улучшает экологическую обстановку района.

Использование: биотехнология. Сущность изобретения: фильтрат культуральной жидкости. Xanthomonas campestris ВКПМ В-4102 охлаждают, подкисляют соляной кислотой до pH 3,5-5,0, при перемешивании добавляют 2,5-3,5 объема охлажденного этанола, выдерживают без перемешивания 6-10 ч на холоду, осадок отделяют, растворяют в дистиллированной воде, осуществляют диализ против дистиллированной воды при pH 4,0 до электропроводности 4,5 mS и отдиализованный раствор лиофильно сушат. Выход продукта с 1 л фильтрата культуральной жидкости составляет по бактериолитической активности 45,0 50,7 тыс.ед. по протеолитической 36-3,99 тыс.ед. 2 табл.

СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ КОМПЛЕКСА ЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ, предусматривающий охлаждение фильтрата культуральной жидкости полученной при культивировании штамма Xanthomonas campestris ВКПМ В 4102, осаждение целевого продукта органическим растворителем, охлаждение с выдержкой и отделение осадка, диализ и лиофильную сушку, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода продукта и упрощения процесса, перед осаждением фильтрат подкисляют до рН 3,5 5,0, осаждение ведут этанолом в количестве 2,5 3,5 объема на объем фильтрата, а диализ осуществляют непосредственно после отделения осадка.