СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО ВНЕКЛЕТОЧНОГО ЛЕКТИНА Российский патент 1995 года по МПК C12P19/04 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам получения бактериальных лектинов.

Известны способы получения бактериальных внеклеточных лектинов, включающие выращивание продуцента лектина глубинным методом, отделение биомассы, концентрирование лектина осаждением органическими растворителями или солями и, при необходимости, его дальнейшему очистку.

Недостатком известных способов получения бактериальных лектинов является необходимость наработки больших объемов культуральной жидкости, что обусловлено относительно низким уровнем биосинтеза этих биологически активных веществ микроорганизмами.

Известен способ получения бактериального лектина, специфичного к сиаловым кислотам из штамма - продуцента Bacillus mesentericus 316 M (авт. св. N 1622397). Cпособ включает выращивание продуцента глубинным методом на полусинтетической питательной среде, отделение биомассы центрифугированием, концентрирование лектина осаждением сернокислым аммонием при 60-70%-ном насыщении, отделение осадка, содержащего лектин, центрифугированием, диализ против воды, повторное центрифугирование и замораживание или сушку лектина. Данный способ позволяет получить выход целевого продукта по активности до 47-60%.

Недостатком приведенного способа получения внеклеточного лектина является низкий выход по активности, т.е. его низкая производительность, заключающаяся в необходимости наработки больших объемов культуральной жидкости, что обусловливает высокую себестоимость вещества и загрязнение окружающей среды продуктами микробиологического синтеза, а также низкая степень чистоты получаемого внеклеточного лектина.

Известен способ получения фермента эластолитического действия (эластотеразы) из Bacillus mesentericus 316 M (авт.св. N 1314673), включающий выращивание продуцента на полусинтетической питательной среде, отделение биомассы от культуральной жидкости, очистку эластотеразы методом ионообменной хроматографии (пропусканием культуральной жидкости через колонку с карбоксильным катионитом КМ-2П или СГ-1М в Са²⁺ или Ва²⁺-форме, отмывку сорбента от балластных белков водой, десорбцию эластотеразы 0,5-1,0 М раствором аммонийно-ацетатного буфера при рН 10,3-10,6) и последующую лиофильную сушку высокоочищенного ферментного препарата.

Особенностью вышеприведенных способов получения сиалоспецифичного лектина и фермента эластолитического действия является то, что для получения указанных продуктов были использованы питательные среды, близкие по качественному составу компонентов, но различные по их количественному содержанию. Причем оптимизация состава сред проводилась в каждом конкретном случае по максимальному накоплению одного из целевых продуктов без учета другого.

Целью изобретения является увеличение выхода по активности внеклеточного лектина, повышение степени его чистоты, стабильности при хранении, а также снижение себестоимости продукта и уменьшение загрязнения окружающей среды продуктами микробиологического производства.

Поставленная цель достигается тем, что выделение бактериального внеклеточного лектина осуществляется на одном из этапов технологического процесса получения фермента эластолитического действия (эластотеразы) путем использования не культуральной жидкости Bacillus mesentericus 316M, а стоков, образующихся после извлечения фермента эластотеразы ионообменной хроматографией, что значительно упрощает процесс получения внеклеточного лектина, не требует проведения культивирования продуцента лектина и снижает себестоимость продукта почти в три раза.

По предлагаемому способу на полусинтетической питательной среде глубинным методом выращивают продуцент фермента эластолитического действия и внеклеточного лектина - B.mesentericus 316M. По окончании ферментации биомассу отделяют центрифугированием или сепарированием. Культуральную жидкость подкисляют до рН 5,7-6,5 0,5 М раствором соляной или уксусной кислоты и пропускают через колонку с карбоксильным катионитом КМ-2П или СГ-1М в Са²⁺ или Ва²⁺-форме для селективной сорбции эластотеразы. После отмывки сорбента водой производят десорбцию эластотеразы 0,5-1,0 М аммонийно-ацетатным буфером и, при необходимости, сушку полученного препарата.

За счет того, что при ионообменной хроматографии идет высокоизбирательная сорбция эластотеразы, жидкость, вытекающая с колонки (стоки), представляет собой бесклеточную культуральную жидкость, содержащую 50-53% исходных белков, но без фермента эластолитического действия и некоторых минорных белков - пигментов. Эти стоки, а также промывные воды, вытекающие с колонки при промывке сорбента водой по окончании сорбции эластотеразы, являются исходным сырьем для получения лектина. Выделение лектина осуществляют осаждением его из смеси стоков и промывных вод сернокислым аммонием при 40-60%-ном насыщении. Образовавшийся осадок отделяют сепарированием или центрифугированием и диализируют против воды, затем повторно центрифугируют и полученный осадок замораживают или высушивают. Схематически предлагаемый способ получения внеклеточного лектина приведен на чертеже. Выход препарата внеклеточного лектина по активности составляет до 83,6%.

Как видно из представленной схемы, получение внеклеточного лектина по предлагаемому способу позволяет утилизировать технологические стоки, богатые микробным белком, и исключить следующие энерго- и материалоемкие процессы:
ТП 2. Приготовление посевного материала (выращивание от 1 до 3 сут. при 37 ±2^оС).

ТП 3. Выращивание культуры в ферментере при постоянных перемешивании, аэрации и температуре 37±2^оС в течение 16-20 ч. (в лаборатории - на микробиологической качалке при частоте оборотов 160-200 мин^-1 и температуре 37± 2^оС в течение 16-20 ч - получение культуральной жидкости и затем ее охлаждение до 8-10^оС.

ТП 4. Отделение культуральной жидкости от биомассы сепарированием (центрифугированием при 5000-6000 об/мин).

Затраты на эти этапы составляют около 60% от всех затрат на технологический процесс получения внеклеточного лектина из B.mesentericus 316М.

Применение предлагаемого способа наряду с улучшением экономических показателей позволяет получить препарат внеклеточного лектина со степенью чистоты, в 16 раз превышающей степень чистоты известного препарата, увеличить выход лектина на 23% и уменьшить примесь протеолитического фермента в 250 раз, что способствует более полному сохранению активности лектина при последующей очистке и хранении. Сравнительная характеристика препаратов внеклеточного лектина, полученных по способу-прототипу и предлагаемому способу, а также данные по стабильности их при хранении приведены в табл.1 и 2.

П р и м е р 1. Культуру-продуцент фермента эластолитического действия и внеклеточного лектина выращивают глубинным способом на полусинтетической питательной среде в колбах Эрленмейера на качалках при 160 об/мин и температуре 37^оС в течение 22±2 ч. По окончании культивированию биомассу отделяют центрифугированием при 5000-6000 об/мин, супернатант в количестве 3,0 л с рН 8,0-8,2 и активностью 1500-3000 ПЕ/мл подкисляют 0,5 г соляной кислоты до рН 6,6 и пропускают через колонку диаметром 5,5±0,5 см, высотой 25± 5 см, содержащую 110± 10 мл суспензии пористого карбоксильного катионита КМ-2П, предварительно переведенного в Са²⁺-форму. Скорость протекания культуральной жидкости через колонку составляет 100 мл/см² ч. После окончания сорбции колонку с сорбентом промывают водой со скоростью 50 мл/см² ч до прозрачных промывных вод.

Культуральную жидкость без эластотеразы, вытекающую с колонки (3 л) и промывные воды (около 0,5 л) собирают в одну емкость, куда вносят сернокислый аммоний из расчета 304 г/л (40% насыщения), перемешивают до полного растворения. Выпавший осадок отделяют центрифугированием при 5000-6000 об/мин в течение 20 мин, затем растворяют в минимальном количестве дистиллированной воды и диализуют 8-12 ч против проточной водопроводной воды. Затем повторно центрифугируют и супернатант - препарат внеклеточного лектина - замораживают или высушивают. Одновременно с выделением внеклеточного лектина из стоков культуральной жидкости и промывных вод проводят десорбцию эластотеразы с карбоксильного катионита. Удельная лектиновая активность составляет 213 титр^-1/мг белка, выход препарата внеклеточного лектина по активности - 32%, степень очистки 57,6 раз.

П р и м е р 2. Условия выращивания и схема выделения фермента эластолитического действия и внеклеточного лектина те же, что и в примере 1, но осаждение лектина проводят сернокислым аммонием из расчета 380 г/л (50% насыщения).

Удельная лектиновая активность составляет 320 титр^-1/мг белка, выход препарата внеклеточного лектина по активности - 84%, а степень очистки 86,4 раз.

П р и м е р 3. Условия выращивания продуцента и схема выделения фермента эластолитического действия и внеклеточного лектина те же, что и в примере 1, но осаждение лектина из остатков культуральной жидкости после сорбции эластотеразы и промывных вод проводят из расчета 456 г сернокислого аммония на 1 л стоков (60% насыщения).

Удельная лектиновая активность составляет 100 титр^-1/мг белка, выход препарата внеклеточного лектина по активности - 48%, степень очистки 27 раз.

П р и м е р 4. Культуру - продуцент эластолитического действия внеклеточного лектина выращивают глубинным способом в аппарате объемом 0,75 м³, коэффициент заполнения 0,5; при температуре 37± 2^оС, аэрации 0,5-1,0 м³ О₂/м³ мин, оборотах мешалки 170± 20 мин^-1 в течение 20± 2 ч. По окончании процесса культивирования культуральную жидкость с активностью 2000-3000 ПЕ/л с рН 8,2-8,6 захолаживают до 10-15^оС подачей рассола в рубашку ферментера и сжатым воздухом передают на сепарацию. Биомассу отделяют сепарированием, культуральную жидкость подкисляют 0,5 М соляной кислотой до рН 6,5 и пропускают через колонку (диаметр 10 ±0,5 см и высота 55± 10 см) с карбоксильным катионитом СГ-1М (1,2 л), предварительно переведенного в Са²⁺-форму. Скорость протекания культуральной жидкости через колонку составляет 5 л/ч.

После окончания сорбции эластотеразы колонку с сорбентом промывают дистиллированной водой со скоростью 2,5-3,0 л/ч до отсутствия поглощения по белку в промывных водах. Промывные воды также сливают в емкость, где собраны стоки с колонки. Общий объем стоков составляет 317-320 л. По окончании промывки колонки проводят десорбцию эластотеразы аммонийно-ацетатным буфером (1,0 М; рН 10,5).

В смесь стоков культуральной жидкости после сорбции эластотеразы на карбоксильном катионите в промывных водах при перемешивании вносят сернокислый аммоний в количестве 114 кг на 315-320 л (50% насыщения) и образовавшийся осадок отделяют сепарированием, затем растворяют в 3-5 л воды, диализируют и центрифугируют. Полученный осадок - препарат внеклеточного лектина - замораживают или высушивают.

Удельная лектиновая активность составляет 320 титр^-1 мг белка, выход препарата лектинов по активности - 84%, а степень очистки 86 раз.

П р и м е р 5. Условия выращивания продуцента и схема выделения фермента эластолитического действия и внеклеточного лектина те же, что и в примере 4, но осаждение лектина из стоков культуральной жидкости после сорбции эластотеразы и промывных вод проводят из расчета 70% насыщения аммонием, т. е. в количестве 160 кг соли на 317-320 л стоков.

Удельная лектиновая активность препарата составляет 74 титр^-1/мг белка, выход по активности - 45%, степень очистки 20 раз.

Таким образом, для выделения внеклеточного лектина по предлагаемому способу оптимальная степень насыщения сернокислым аммонием составляет 40-60%. При более низких концентрациях сернокислого аммония (менее 40%) осаждение белков вообще и лектинов в частности не происходит. При степени насыщения сернокислым аммонием, равной 70%, отмечается снижение удельной лектиновой активности без увеличения выхода по активности.

Использование: биотехнология. Сущность изобретения: предложен способ получения бактериального внеклеточного лектина из культуральной жидкости Bacillus mesentericus 316 М, заключающийся в том, что выделение лектина осуществляют на одном из технологических этапов получения ферментного препарата эластолитического действия из смеси стоков культуральной жидкости и промывных вод после сорбции эластотеразы на карбоксильном катионите путем осаждения сернокислым аммонием. 3 ил., 2 табл.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО ВНЕКЛЕТОЧНОГО ЛЕКТИНА, включающий выращивание продуцента Bacillus mesentericus 316М глубинным методом на полусинтетической питательной среде, отделение биомассы и выделение внеклеточного лектина осаждением сернокислым аммонием и последующий диализ, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода активности внеклеточного лектина, повышения степени его чистоты, стабильности при получении и хранении, а также снижения себестоимости и уменьшения загрязнения окружающей среды продуктами микробиологического синтеза, выделение лектина осуществляют после выделения из культуральной жидкости фермента эластолитического действия ионообменной хроматографией на карбоксильном катионите, причем в качестве сырья для извлечения лектина используют смесь стоков культуральной жидкости и промывных вод после сорбции эластотеразы на карбоксильном катионите, а осаждение лектина сернокислым аммонием проводят при насыщении 40 - 60%.