Синтетическая питательная среда для пропитки полиакриламидного геля, содержащего 0,95 мас.% иммобилизированного гемина, для выращивания бактерий FRaNSIeLLa тULаRеNSIS Советский патент 1993 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к микробиологии и касается плотных синтетических питательных сред для выращивания туляремийного микроба.

Целью изобретения является повышение чувствительности синтетической плотной питательной среды, обеспечивающей образование колоний Fr. tularensis при засеве единичных клеток.

Это достигается тем, что синтетическая плотная питательная среда для выращивания Fr.tularensfs содержит L-гистидин HCI, L-цистеин HCI, L-лизин HCI, dl-изолейцин, dl-метионин, L-треонин, L-пролин, L-лейцин, L-валин, L-тирозин, L-серин, L-аспарагиновую кислоту, KHaPO-i, N32HP04, NACI, MgS04 7H20, тиамин, пантотенат кальция, глюкозу, dl- -глицерофосфат натрия, а в качестве уплотняющей основы используют полиакриламидный гель с иммобилизованной гемовой частью при следующем количестенном соотношении компонентов, г/л дисиллированной воды:

L-аргинин HCI0,100-0,300 L-гистидин HCI 1,100-2,000 L-цистеинНС 1,000-1,500 L-лизин HCI 0,200-0,500 dl-изолейцин 0,100-0,200 dl-метионин 0,200-0,500 L-треонин 1,900-2,500 L-пролин 0,900-1.500 L-лейцин 0,200-0,500 L-валин 0,750-1,000 L-тирозин 0,100-0,300 L-серин 0,100-0,300 L-аспарагиновая кислота 0,100-0,300 КН2Р04 2,600-3,100 NaCI 4,500-5,500 MgS04 7HaO 0,030-0,050 NazHPOV 1,500-1,800 ТиаминНС 0.015-0,025 Пантотенат кальция 0,040-0,060 Р-глюкоза 0.01-8,000 а-глицерофосфат натрия 30,00-20,00 гемоглобин (щелочной гидролизат) 30.00-70,00 вода ДО 1 л. Готовят питательную среду следующим бразом.

Пример 1.

1.Приготовление растворов аминокислот добавок для пропитывания дисков.

На аналитических весах взвешивают ледующие вещества, г:

L-аргинин HCI0,100 L-гистидин HCI 1,100 L-цистеин НС1 1,000 L-лизин HCI 0,200 dl-изолейцин 0,100 dl-метионин 0,200 L-треонин 1,900 L-пролин 0,900 L-лейцин 0,200 L-валин 0,750 L-тирозин 0,100 L-серин 0,100 L-аспарагиновая кислота 0,100 КН2Р04 2,600 NaCI 4,500 MgS04 7НгО 0,030 N32HP04 1,500 Тиамин HCI 0,015 , Пантотенат кальция 0,040 D-глюкоза 0,010 а-глицерофосфат натрия 30,000 Навески КН2Р04 и N32HP04 растворяют 750 мл дистиллированной воды. Каждую авеску аминокислот, за исключением L-ци- теина, растворяют в 30-40 мл полученного уферного раствора при нагревании (7090°С) и полученные растворы объединяют, Для растворения L-тирозина к навеске этой аминокислоты добавляют 2 мл 1 н. едкого натрия, перемешивают и приливают 30-40

мл фосфатного буфера и после полного растворения тирозина объединяют со смесью остальных аминокислот. Хлористый натрий и сернокислый магний растворяют в 30-40 мл дистиллированной воды и добавляют к

смеси аминокислот. Остатки фосфатного буфера также приливают к смеси и объем ее доводят до 850 мл, проверяют рН и, если необходимо, подтитровывают 0,1 н. раствором кислоты или щелочи до значений рН

5 6,8+0,2. Раствор аминокислот и солей стерилизуют 30 минут при 0,5 атмосферах, Каждую из навесок тиамина, цистеина, пантотената кальция, глюкозы и «-глицерофосфата натрия растворяют в 25-30 мл

0 дистиллированной воды и стерилизуют при тех же условиях. Приготовленные растворы могут храниться длительное время (кроме цистеина и пантотената кальция) в холодильнике при 2°С до использования. Перед

5 использованием все растворы сливают.

2. Получение щелочногогидролизатагемоглобина

В 400 мл дистиллированной воды растворяют 25 г гемоглобина и добавляют 15 мл

0 40%-ного раствора едкого натрия, Полученную смесь инкубируют на кипящей водяной бане в течение 60+5 мин, После этого щелочной гидролизат гемоглобина охлаждают до комнатной температуры.

5 3. Приготовление полиакриламидных (ПАА) дисков

Полученный а елочной гидролизат гемоглобина (п.2) нейтрализуют 20% соляной кислотой до рН 8,5 и доводят объем дистил0 лированной водой до 500 мл,

В 110 мл нейтрализованного щелочного гидоролизата гемоглобина последовательно растворяют 23,0 г акриламида, 0,7 г пер- сульфата аммония, 0,28 г

5 N.N-метиленбисакриламида и 0,12 мл М,М,1Т,г4 -тетраметилэтилендиамина (ТЕМЕ Д). Полученный раствор разливают в формы для получения дисков (например чашки Петри) и проводят полимеризацию

0 при комнатной температуре в течение 3-4 часов.

Приготовленные ПАА-диски помещают в дистиллированную воду из расчета 50-60 мл воды на 1 диск. Процесс отмывки ведут в

5 течение 5 суток при комнатной температуре, меняя воду каждые сутки. В отмывочных водах проверяют наличие аминокислот по реакции с нингидрином, Окончанием отмывки считают получение отрицательной пробы на аминокислоты. Отмытые диски помещают в широкогорлую колбу, заливают дистиллированной водой и автоклавируют 20 минут при 1 атмосфере.

4. Пропитка ПАА-дисков раствором жидкой питательной среды и рэскладыва- ние в чашки Петри

Стерильные ПАА-диски асептически переносят в стерильный раствор аминокислот со всеми добавками из расчета 20-30 мл жидкой питательной среды на 1 диск. Про- питывание ведут при комнатной температуре в течение 18 часов. Затем диски асептически раскладывают в стерильные чашки Петри. Полученная синтетическая плотная питательная среда хранится при 4°С в холодильнике в течение 3-4 недель.

5. Проверка чувствительности полученной синтетической плотной питательной среды микробиологическим способом

Клетки Fr.tuiarensis, выращенные на жидких или плотных питательных средах, отмывали питательной среды центрифугированием в физиологическом растворе, а затем суспендировали в этом же растворе. Используя стандарт мутности ГИСК им. Л.А,Тарасовича, готовили 1 млрд суспензию клеток в 1 мл, а также 10-кратные ее разведения в физиологическом растворе. Полученные разведения на чашки с предлагаемой синтетической питательной средой и чашки с плотной питательной средой на основе сернокислотного гидролиза- та рыбной муки из расчета 10, 100, 1000 клеток на чашку. После инкубирования чашек при 37°С в течение 3-5 суток проводили подсчет выросших колоний. Результаты этих экспериментов приведены в табл.1.

Из приведенных данных видно, что предлагаемая синтетическая плотная питательная среда по чувствительности не усту- пает, а даже несколько превосходит плотную питательную среду сложного состава, обычно используемую для определения количества жизнеспособных клеток данного микроорганизма. .

П р и м е р 2. Приготовление синтетической плотной питательной среды.

1. Приготовление раствора аминокислот и добавок для пропитки дисков.

На аналитических весах взвешивают следующие вещества, г:

L-аргинин HCI0,300

L-гистидин HCi2,00

L-цистеин HCI1,500

L-лизин HCI0,500

dl-изолейцин0,200

dl-метионин0,500

L-треонин2,500

L-пролин1,500

L-лейцин0,500

L-валин1,000 L-тирозин 0,300 L-серин 0,300 L-аспарагиновая кислота 0,300 КН2Р04 3,100 NaC 5,500 MgSCM 7H20 0,050 Na2HP04 1,800 Тиамин HCI 0,025 Пантотенат кальция 0,060 D-глюкоза 8,000 «-глицерофосфат натрия 20,000 дистиллированная вода до 1 л. Порядок растворения аминокислот и добавок такой же как в примере 1.

Остальные операции по приготовлению плотной синтетической питательной среды проводят, как в примере 1, п. 2,3,4.

2. Проверка чувствительности полученной плотной синтетической питательной среды микробиологическим способом

Суспензию клеток и их разведения готовят, как в примере 1 и также высевают 10, 100, 1000 клеток на две питательные среды. Результаты экспериментов отражены в табл.2.

Полученные данные указывают на то, что предлагаемая среда не уступает по .своей чувствительности сложной питательной среде.

П р и м е р 3. Приготовление плотной синтетической среды с использованием для пропитки дисков жидкой синтетической среды по прописи Майского и соавторов.

1. Жидкую питательную среду готовили, как описано в примере 1 или 2, пропитывали жидкой синтетической питательной средой. Микробиологическую проверку чувствительности проводили, как описано выше.

Использование для пропитки ПАА-дисков жидкой синтетической питательной среды по прописи Майского и соавторов не приводит к увеличению чувствительности синтетической плотной питательной среды. Формула изобретения Синтетическая питательная среда для пропитки полиакриламидного геля, содержащего 0,95 мас.% иммобилизированного гемика для выращивания бактерий Franslella tularensls, отличающаяся тем, что, с целью увеличения чувствительности среды, обеспечивающей рост из единичных колоний, она содержит следующие компоненты, г/л:

L-аргинин HCI0,100-0,300 l-гоистидин НС 1,100-2,000 L-цистеин HCI 1,000-1,500 L-лизин HCI 0,200-0,500 D.L-изолейцин 0,100-0,200 D.L-метионин 0,200-0,500

новая кислота

1.900-2,500 0,900-1,500 0,200-0,500 0,750-1,000 0,100-0,300 0,100-0,300 0,100-0,300 2,600-3,100 4.500-5,500

0,030-0,050 1,500-1,800 0,015-0,025 0,040-0,060 0,000-8.00 30,000-20,000 до 1 л.

Использование: биотехнология, микробиология, диагностика туляремии. Сущность изобретения: твердую основу, содержащую полиакриламидный гель с иммобилизованным гемином, пропитывают .раствором, содержащим L-аргинин HCI, L- гистидин HCI, L-цистейн HCI, L-лизин HCI, О,1 -изолейцин, D.L-метионин, L-треонин, L- пролин, L-лейцин, L-валин, L-тирозин, L-ce- рин, L-аспарагиновую кислоту, калий фосфорнокислый однозамещенный, натрий хлористый, магний сернокислый, натрий фосфорнокислый двузамещенный, тиамин хлорид, пантотенат кальция, D-глюкозу, а- глицерофосфат и воду. Полученная твердая питательная среда позволяет культивиро- 00 вать единичные клетки туляремийного микроба. 2 табл.QJ Ы &

Таблица1

ч

Средние числа выросших колоний Fr. tularensis на чашках с предлагаемой синтетической средой и средой на основе сернокислотного гидролизата рыбной муки (ГРМ))

) - в табл.1 приведены средние значения 7 экспериментов.

Табл и ца2

Сравнение числа выросших колоний Fr.tularensls на чашках с предлагаемой синтетической

средой и ГРМ)