Способ получения пируватдекарбоксилазы из пивных дрожжей Советский патент 1990 года по МПК C12N9/88 

Изобретение относится к способам получения ферментных препаратов, а именно пируватдекарбоксилазы, и может быть использовано в микробиологической промышленности для получения пируватдекарбоксилазы, используемой при ферментативном определении уровня тиаминдифосфата в

крови или другой биологической жидкости человека и животных.

Цель изобретения - повышение стабильности препарата при хранении.

Способ осуществляют следующим образом.

Берут свежую пастообразную массу пивных дрожжей Saccharomyces carls- bergensis 7-9 регенераций и готовят суспензию для экстрагирования белко- вого препарата Приготовленную суспензию обрабатывают ультразвуком с частотой 20-22 кГц в течение 18- 25 мин и проводят фракционирование ацетоном и сульфатом аммония. Затем выполняют адсорбционную хроматографию на оксиапатите и ионообменную хроматографию на КМ-целлюлоэе, добиваясь очистки пируватдекарбокси- лазы до гомогенного состояния. Ста- билизацию белкового препарата осуществляют добавлением к гомогенной пируватдекарбоксилазе 2-3 Ы сульфата аммония и 0,01-0,05 М сульфата магния в 0,02-0,1 М Wa-фосфатном бу- фере, рН 6,8 с последующей лиофили- зацией суспензии при -35°С. Лиофшга- зированный порошок хранят в плотно закрытых тюбиках при -15 С„

Наилучший эффект достигается . при обработке суспензии дрожжей ультразвуком с частотой 20-22 кГц в течение 18-25 мин и добавлении к гомогенному препарату 2-3 М сульфата аммония и 0,01-0,05 М сульфата магни в 0,02-0,1 М Na-фосфатном буфере, рН 6,8. Уменьшение частоты ультразвука ниже 20 кГц или времени обработки суспензии мене.е 18 мин ведет к недостаточному разрушению клеток (неполный выход продукта), а увели- чение частоты ультразвука свыше 22 кГц или времени обработки более 25 мин - к частичному разрушению пируватдикарбоксилазы.

-

Снижение молярности Wa-фосфатно го буфера ниже 0,02 М и уменьшение концентрации сульфата аммония ниже 2 М и сульфата магния менее 0,01 М в исходном Na-фосфатном буфере ведет к снижению стабильности препарата Стабильность белкового препарата уменьшается в таком случае от 2 до 5 раз. Увеличение молярности Na-фосфатного буфера свыше 03 М,

-

а также концентрации сульфата аммо- ния более 3 М не приводит к повышению эффекта по сравнению с применяемыми молярностью буфера или концентрациями соли. Сульфат магния в концентрациях свыше 0,05 М способствует инактивации фермента.

Пример 1. Берут 5 кг свежих пивных дрожжей Saccharomyees carlsbe . JQ 2Q

25 я3 5

40

45

0

rgensis 7-9 регенераций. Свежую дрожжевую массу многократно промывают холодной водой и центрифугируют 15 мин при 5000g. Полученную пастообразную массу дрожжевых клеток используют для приготовления суспензии и экстрагирования белкового препарата. С этой целью 400 г дрожжевых клеток смешивают с 1750 мл водного раствора, содержащего 67 мл глицерина, 0,668 г ЭДТА, 13,2 г и 2,8 г (HH4)4S04.

Приготовленную суспензию интенсивно перемешивают в течение 10 мин. Интенсивно перемешанную суспензию охлаждают до -2 °С и обрабатывают ультразвуком при частоте 22 кГц в течение 20 мин, добиваясь полного разрушения клеток, способствующего максимальному выходу конечного продукта. Полученный экстракт центрифугируют в течение 30 мин при 4000g, а затем в течение ч при lOSOOOg. Осевшие после центрифугирования субклеточные фракции удаляют, а к над- осадочной жидкости при непрерыв- i ном перемешивании приливают охлажденный до -20°Г, ацетон до 37,5%-ного насыщения, не допуская нагревания раствора выше 0°С„ После выдерживания 15 мин при этой температуре суспензию центрифугируют в течение 5 мин при 4000g и осадок отбрасывают. На каждые 100 мл надосадочной жидкости повторно приливают по 10 мл ацетона и доводят температуру раствора до -2°СС Через 15 мин экстракт центрифугируют, а конечный осадок быстро суспендируют в 400 мл 0,02 М трис-HCl буфера. рН 7,3 с 1 мМ ЭДТА и 5 мМ цистеин-гвдрохлоридом и перемешивают „ После перемеривания в i течение 30 мин при 0°С однородный белковый раствор подвергают фракционированию сульфатом аммония, добавляя 108 г сухого измельченного (Ш14)80. Через 1 ч смесь центрифугируют, осадок отбрасывают, а на каждые 100 мл надосадочной жидкости вносят по 7 г сульфата аммония (44-53%-ное насыщение) в течение 20 мин при перемешивании Высоленный белок собирают центрифугированием. На данной стадии активность пируватдекарбоксилазы достигает 8,3 Е, однако присутствующие в препарате незначительные остаточные концентрации НАД Н-зависимых оксидаз приводят к самопроизвольному окислению НАД Н«.

Заключительную очистку проводят мтодами адсорбционной хроматографии на оксиапатите и ионного обмена на КМ-целлюлозе. Для достижения гомогенности 1 г грубой сулъфо-аммоний- ной пасты растворяют в 1,5 мл 0,005 М Na-фосфатного буфера, рН 6,8 с 2 мМ I мМ ЭДТА, 0,5 мМ тиаминдифосфатом и 5 мМ цистеин- гидрохлоридом и пропускают через колонку (3, см, 48 мл/ч) с сефа- дексом С-25, уравновешенную исходны буфером0 Значение рН и ионной силы уравновешивающего буфера подобраны экспериментально, при которых пиру- ватдекарбоксилаза не связывается оксиапатитом и обнаруживается в первых же фракциях элгоирующего раствора, тогда как сопутствующие примеси все еще эффективно удерживались на носителе. Обессоленный белковый элю ат смешивают с трехкратным объемом уплотненного осадка оксиапатита, уравновешенного этим же буфером, после якспозиции в течение 10 мин при 4°0 центрифугируют в течение 5 мин при lOOOOg. Адсорбент повторно промывают 3 мл буфера, надосадоч ную жидкость объединяю рН доводят 20 мМ ацетатом Na с 80 мМ Na- фосфа- том до 5,06 и наносят на колонку (2,1X20 см) с КМ-целлюлозой. Пиру- ватдекарбоксилаза не связывается катионообменником и элюируется Na- ацетатно-фосфатным буфером (20 и 80 мМ соответственно), рН 5,06 в пустом объеме колонки со скоростью 36 мл/ч. Объем фракций 2 мл После десорбции белка значение рН элюата увеличивается до 6,5, добавляя к фракциям по 1 мл 1 М фосфата На, рН 6,8. Результаты всех стадий очистки суммированы в табл 1 .

Стабилизацию пнруватдекарбокси- лазы осуществляют сульфатом аммония в присутствии ионов Mg . К белковому элюату, содержащему 3 мг белка в 1 мл, добавляют при перемешивании сульфат аммония и сульфат магния в 0,05 М Na-фосфатном буфере, рН 6,8 до конечной концентрации компонентов 2,7 и 0,02 М соответственно, после чего замороженную суспензию лиофилизируют на установке для сублимационной сушки при температуре -35 С и давлении 610 Па. Лиофилизированный порошок хранят в плотно закрытых тюбиках при -15°С. Все операции по выделению и очистке пи- руватдекарбоксилазы проводят при

+А°С.

Пример 2. Подготовку исходного материала, приготовление суспензии для экстрагирования белка с обработкой ее ультразвуком, проведение ацетонового и аммонийного фракционирований и заключительную очистку белкового препарата до гомогенного состояния проводят аналогич-. 5 но примеру 1. Стабилизацию пируват- декарбокоилаэы осуществляют сульфатом аммония в присутствии ионов К б.елковому элюату, содержащему 3 мг белка в 1 мл, добавляют при переме- 0 шивании сульфат аммония и сульфат

магния в 0,02 М Na-фосфатном буфере,- рН 6,8 до конечной концентрации компонентов 2 и 0,01 М соответственно, после чего замороженную суспензию 5 лиофилизируют на установке для сублимационной сушки при температуре -35°С и давлении , Лиофили- зированный порошок хранят в плотно закрытых тюбиках при -15°СС 0Влияние стабилизирующих агентов

с указанной конечной концентрацией (2 М сульфат аммония и 0,01 М сульфат магния в 0,02 М Na-фосфатном буфере, рН 6,8) на активность пиру- 5 ватдекарбоксилазы показано в табл. 2. Пример 3. Подготовку исходного материала, приготовление суспензии для экстрагирования белка с обработкой ее ультразвуком, проведение 0 ацетонового и аммонийного фракционирований и заключительную очистку белкового препарата до гомогенного состояния проводят аналогично примеру 1 .

Стабилизацию пируватдекзрбокси- 5 лазы осуществляют сульфатом аммония в присутствии ионов Mg t К белковому элюату, содержащему 3 мг белка в 1 мл, добавляют при перемешивании . сульфат аммония и сульфат магния в 0 0,1 М фосфатном буфере, рН 6,8 до конечной концентрации компонентов 3 и 0,05 М соответственно, после чего замороженную суспензию лиофилизируют на установке для сублимацион-1 ной сушки при температуре -35 С и давлении 6-10 Па. Лиофилизирован- ный порошок хранят в плотно закрытых тюбиках при -15°С. Влияние стабилизирующих агентов с указанной их

конечной концентрацией (3 М сульфат аммония и 0,05 М сульфат магния в 0,1 М Na-фосфатном буфере, рН 6,8) на активность пируватдекарбоксилазы показано в табл. 2.

Применение изобретения позволяет получить ферментный препарат с удельной активностью 64,8 Е и выходом 31% (см. табло 1), при этом весь процесс получения пируватдекарбоксилазы занимает 8 ч.

Стабильность высокоочищенного фермента при +4°С в водных или буферных растворах в отсутствии и в присутствии стабилизирующих агентов, блокирующих реакционноспособные участки молекулы белка или моделирующих ком- партиентализацию фермента в дрожжевой клетке, показана в табл. 2. Как видно из табл. 2, среди агентов, защищающих реакционноспособные участки молекулы пируватдекарбоксилазы (дитиотреитол, пируват, MgS04) наибольшим стабилизирующим эффектом обладают ионы Mg . В среде 2,7 М сульфата аммония с 0,02 М сульфатом магния в 0,05 М Na-фосфатном буфере, рН 6,8 белок остается активным в течение месяца. Лиофилизированный с вышеуказанными компонентами препа

рат стабилен при -15°С в течение года.

Формула изобретения Способ получения пируватдекарбоксилазы из пивных дрожжей, включающий гомогенизацию клеток, фракционирование гомогената ацетоном и сульфатом аммония с последующей очисткой на катионообменнике в 20 мМ ацетате натрия и 80 мМ фосфате натрия с рН 5,06, отличающийся тем, что, с целью повышения стабиль

ности препарата при хранении, гомогенизацию клеток проводят обработкой ультразвуком с частотой 20-22 кГц в течение 18-25 мин, фракционирование ацетоном - в интервале концентраций 37,5-43,2 об „/ Фракционирование сульфатом аммония - в интервале 44-53% насыщения, перед очисткой на катионообменнике осуществляют очистку на оксиапатите в 0,005 М натрийфосфат- ном буфере с рН 6,8, ионообменную хроматографию проводят на КМ-целлю- лозе и полученный раствор фермента лиофилизуют из раствора, содержащего 0,02-0,1 М натрийфосфатный бу- - фер с рН 6,8, 2-3 М сульфата аммония и 0,03-0,05 М сульфата магния.

Изобретение относится к способам получения ферментных препаратов, а именно пируватдекарбоксилазы, и может быть использовано в микробиологической промышленности для выделения пируватдекарбоксилазы, используемой в медицинской и сельскохозяйственной практике при ферментативном определении уровня тиаминдифосфата в крови или другой биологической жидкости. Цель изобретения - повышение стабильности препарата при хранении. Из отмытой биомассы готовят суспензию для экстрагирования белкового препарата, которую обрабатывают ультразвуком с частотой 20 - 22 кГц в течение 18 - 25 мин с последующим фракционированием ацетоном и сульфатом аммония. Заключительную очистку выполняют адсорбционной хроматографией на оксиапатите и ионообменной хроматографией на КМ-целлюлозе. Стабилизацию белкового препарата осуществляют внесением к гомогенной пируватдекарбоксилазе 2 - 3 М сульфата аммония и 0,01 -0,05 М сульфата магния в @ 0,02 - 0,1 М NA-фосфатном буфере, PH 6, 8 с лиофилизацией суспензии при -35°С. Лиофилизированный порошок хранят в плотно закрытых тюбиках при -15°С. Выход высокоочищенной пируватдекарбоксилазы составляет 31% с удельной активностью 64,8 Е на 1 мг белка. 2 табл.

32500 12025 3170 9820

9547920

223 69

5300 3820

Таблица 1

0,37 3,1

8,3

23,8 64,8

1,0 8,4

22,5

64,3 175,1

100 82

65

44 31

з против М Na-цитратный буфер, рН 6,0 М Na-фосфатный буфер, рН 6,8 + 25%-ная сахароза + 25%-ный глидерин + 5 мМ дитяотреитол + 4 мМ пируват натрия + 0,02 М сульфат магния 2,7 М сульфат аммония

+ 2,7 М сульфат аммония с 0,02 М сульфатом магния

+ 2,7 М сульфат аммония с

0,02 М сульфатом магния (лиофилизированный препарат )

М Na-фосфатный буфер, рН 6,8 + 2,0 М сульфат аммония с 0,01 М сульфатом магния

Na-фосфатный буфер, рН 6,8 + 3,0 М сульфат аммония с 0,05 М сульфатом магния

40

3,7

23,2 6., 1

Ui

-еN5 U1 1л

100

100

100

100

97,0 61,9 27,6 10,9 3,4

100

100

100

100

10098,9 100100

100

10010094,885,4 56,7 25,3 8,8

10098,791,9 58,6 27,0 10,1

97,1

2,6

3,2