Способ определения устойчивости вируса к обезвоживанию Советский патент 1992 года по МПК C12N1/00 C12Q1/70 

Изобретение относится к медицинской промышленности и может быть использовано в вирусологической практике для определения устойчивости вирусов в составе нативных суспензий при обезвоживании

Известны контактные способы определения влагоустойчивости микроорганизмов, при которых заданная конечная влажность биомассы принимается равной влажности смеси адсорбент - биомасса, а также учитывается удельная массоемкость пробы биомассы и адсорбента и рассчитывается количество адсорбента необходимое для смешивания в зависимости от начальной и заданной конечной влажности биомассы, начальной влажности адсорбента и установленной удельной массоемкости биомассы и адсорбента.

Недостатком указанных способов является невозможность использования их для определения устойчивости вирусов к обезвоживанию в связи с возможной адсорбцией вирионов на поверхности адсорбента и инактивации вируса вследствие выделения тепла при связывании воды с адсорбентом. Указанные причины влияют на результат определения биоактивности вируса, определяемой стандартными методами титрования для ресуспендированной в водной среде смеси биомасса - адсорбент.

Наиболее близким к изобретению является способ определения влагоустойчиво

VJ

сл оо

о VI

Јь

сти микроорганизмов, при котором устанавливают конечное знамение влажности путем измерения текущего значения влажности и устанавливают соответствующее ему время выдержки, Обезвоживание биомассы осуществляют бесконтактным массооб- меном при 1-4°С, а определение влагоустойчивости микроорганизмов ведут по графику зависимости выживаемости микроорганизмов от конечного значения влажности.

Недостатком Прототипа является длительность цикла определения устойчивости микроорганизмов к обезвоживанию (до 18 ч) вследствие длительности проведения процесса обезвоживания при 1-4°С и длительности определения остаточной влажности образцов при обезвоживании с использованием их высушивания до постоянного веса в сушильном шкафу при 105°С, Причем при применении указанного способа для определения влагоустойчивости вирусов длительность цикла увеличивается еще в несколько раз. Это связано с тем. что вирусные суспензии имеют сухой остаток в 3-4 раза меньший по сравнению с бактериальной биомассой, что ведет к увеличению объемов анализируемой суспензии вируса (для обеспечения достаточной точности определения влажности биомассы) и, как следствие, увеличивается время определения устойчивости вирусов к обезвоживанию.

Цель изобретения - ускорение способа определения устойчивости вирусов к обезвоживанию и сокраа1ению расхода вирусной суспензии.

Цель достигается тем, что способ определения устойчивости вирусов к обезвоживанию включает приготовление вирусной суспензии и размещение ее в емкости с сорбентом для бесконтактного удаления влаги. Далее определяют отдельные массы инкубируемой суспензии, а также репродукционную активность вирусов в исследуемой суспензии. Рассчитывают скорости изменения относительной массы и репродуктивной активности вируса Оценку устойчивости вируса к обезвоживанию проводят по отношению скорости изменения репродуктивной активности к скорости изменения относительной массы.

В данном способе не требуется проводить измерение влажности исследуемых образцов, что сокращает расход вирусной суспензии и ускоряет способ

На фиг. 2 представлен график зависимости

JZ4rJHi.(t),

ГПо - ГПг

где гтн - масса исследуемого образца с чашкой в момент t;

m0 - масса образца с чашкой до обезвоживания;

глг - масса чашки,

описывающей изменение относительной массы исследуемых образцов вирусной суспензии ВСЭЛ (штамм ТС-83) во времени (t); на фиг. 2 - график Tt f(t) зависимости изменения биоактивности (биотитра) исследуемых образцов вирусной суспензии ВЭЛ (штамм ТС-83), выраженного в д БОЕ/ мл, за время их обезвоживания (точки К соответствуют значения биотитров контрольных

образцов).

Способ поясняется конкретным примером его реализации при определении устойчивости к обезвоживанию вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей

(ВЭЛ, штамм ТС-83). Суспензию вируса ВЭЛ наливают в предварительно простери- лизованные и взвешенные на весах чашки с массой (mr) по 0,3 мл в каждую. Чашки с исследуемыми образцами взвешизают, определяя массу (т0), и устанавливают в герметичные емкости с сорбентом. В качестве сорбента используют ионообменную смолу № форму катионита КБ 4П2, влагоемкость которого составляет 150 г/100 г. Чашки с

контрольными образцами объемом 0,3 мл устанавливают в пустую герметичную емкость. Емкости с исследуемыми и контроль- ными образцами устанавливают в суховоздушный термостат с температурой

37°С, не вызывающей термоинактивацию вируса ВЭЛ в течение времени проведения обезвоживания сорбентом исследуемых образцов до момента прекращения изменения их веса. Через определенные промежутки времени извлекают из емкости с сорбентом по 3 исследуемых образца и определяют текущие значения их массы (mt). Далее вычисляют относительные массы исследуемых образцов -- 100%. ДанГПо Г

ные сведены в табл. 1,

После операций взвешивания каждый раз содержимое трех чашек с исследуемыми образцами объединяют и определяют репродукционную активность суспензии вируса ВЭЛ по стандартной методике титрованием на монослое культуры ФЭК(фибробласты куриных эмбрионов). Репродукционную активность выражают в Ig БОЕ/мл. Параллельно определяют репродукционную активность суспензии вируса ВЭЛ в контрольных образцах для исключения возможных ошибок вследствие термоинактивации вируса за время экспозиции образцов.

Результаты сведены в табл. 2: После этого, используя табл. 1, строят график линейной убыли массы исследуемых образцов во времени:

ITIt - mr

m0 - nrir

100% f(t).

который представлен на фиг, 1, и график линейной убыли репродукционной активности во времени Tt f(t), используя табл. 2. Кроме того, на последнем графике наносят точки К, которые показывают репродукционную активность вируса ВЭЛ в контрольных образцах. В процессе проведения эксперимента соблюдалось равенство репродук- ционной активности вируса ВЭЛ в контрольных образцах и исходной вирусной суспензии, которая равнялась 9,0 lg БОЕ/мл, что подтверждает достоверность данных по определению устойчивости вирусов к обез- воживанию.

По графику на фиг. 1 определяют скорость изменения относительной массы исследуемых образцов ВЭЛ. которая соответствует тангенсу угла а наклона линейно- го участка функции

fTlt фг ГПо ГЛг

100% f(t)

и равна tg а- -0,4%/мин.

По графику на фиг. 2 определяют скорость изменения репродукционной активности исследуемых образцов ВЭЛ, которая соответствует тангенсу угла (/5) наклона линейного участка функции Tr f(t) и равна

tg/3 -5,8 БОЕ/мин-мл .

Устойчивость вируса ВЭЛ к обезвоживанию определяют по отношению скорости изменения репродукционной активности (tg /3) к скорости (tg а) изменения относительной массы исследуемых образцов, т. е.

мл

10 15 20

5

0

5

0

19 -5, Ig БОЕ/мин tga-0,4-%/мин

- 1, БОЕ/-мл,%

Величина 1, БОЕ/ Мл % характеризует устойчивость вируса ВЭЛ (штамм ТС- 83) к обезвоживанию, а именно изменение массы образца за счет удаления воды на 100%, что ведет к изменению репродукционной активности вируса на 1,5 д БОЕ/мл, т, е. в 32 раза. Использование контрольных образцов для подтверждения соответствия их биотитров репродукционной активности исходной суспензии вируса показывает корректность определения устойчивости вируса к обезвоживанию.

Технико-экономические преимущества предлагаемого способа по сравнению с прототипом состоят в ускорении способа определения устойчивости вируса к обезвоживанию с 18 ч до 4 ч за счет проведения процесса обезвоживания при 37°С, а не при 1-4°С, как в прототипе, Кроме того, отпадает необходимость определения остаточной влажности исследуемых образцов, что позволяет уменьшить расход исследуемой вирусной суспензии в 3-4 раза.

Формула изобретения Способ определения устойчивости вируса к обезвоживанию, включающий приготовление вирусных суспензий и размещение их в емкости с сорбентом для бесконтактного удаления влаги с последующей оценкой, отличающийся тем, что, с целью сокращения расхода вирусной суспензии и ускорения способа, Определяют во времени отдельные массы инкубируемых суспензий, а также репродукционную активность вирусов в исследуемых суспензиях, рассчитывают скорости изменения относительной массы и репродуктивной активности вирусов, а оценку проводят по отношению скорсЯ сти изменения репродукционной активности к скорости изменения относительной массы.

Использование: медицина, вирусология Подготовленные исследуемые и контрольные образцы вирусных нативных суспензий размещают в емкости с крышками. В емкость с исследуемыми образцами помещают сорбент для бесконтактного удаления влаги. Исследуемые и контрольные образцы выдерживают при температуре, не вызывающей термоинактивацию вируса в течение времени проведения эксперимента При этом определяют относительные массы исследуемых образцов и биоактивность вирусов в контрольных и исследуемых образцах в разные моменты времени стандартными методами с последующим нахождением скоростей изменения относительной массы исследуемых образцов и биоактивности вирусов в этих образцах. Устойчивость вирусов к обезвоживанию определяют по отношению скорости изменения биоактивности к скорости изменения относительной массы исследуемых образцов. В процессе осуществления способа соблюдается равенство биологической активности вируса в контрольных образцах и исходной вирусной суспензии. 2 ил., 2 табл. Ё

Таблица 1

ISO90 НЮХ

40 во во wo ш т 160 т 200 гго т mm .

Таблица 2