ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ СТАБИЛИЗАЦИИ ВИРУСА ВЕНЕСУЭЛЬСКОГО ЭНЦЕФАЛИТА ЛОШАДЕЙ Российский патент 1995 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к питательным средам для стабилизации плазматических и вирусных мембран, которые могут быть использованы для культивирования и хранения вирусных препаратов.

Одной из проблем является повышение термостабильности вирусного материала. Такая характеристика, как термоустойчивость, является одной из основных при создании вирусных препаратов и их хранении.

Из литературы известно, что при формировании термоустойчивого фенотипа вирусов большую роль играет липидный компонент мембран оболочечных вирусов, который в зависимости от содержания, например, холестерина может изменять физико-химические характеристики мембран (механическую устойчивость, проницаемость и др.) в сторону стабилизации, что ведет к предотвращению температурной инактивации вирусного материала. В качестве стандартных питательных сред, содержащих липидные компоненты, в биотехнологии вирусов используются ростовые среды с 10%-ной сывороткой крови крупного рогатого скота (КРС) и поддерживающие среды с 2%-ной сывороткой. В качестве таких сред для культивирования клеток и вирусов широко используется среда Игла МЕМ Hepes (прототип).

Однако указанная среда не позволяет повысить термоустойчивость культивируемого вируса.

Целью изобретения является повышение термоустойчивости культивируемого вируса.

Это достигается тем, что в ростовую среду Игла МЕМ Hepes дополнительно вводят 2-(винилоксиэтил)дитиокарбамат калия (виндитат) в количестве 10^-5 10^-6 мас.

Повышение термоустойчивости мембран клеток и вирусов путем введения в состав ростовой среды виндитата обусловлено тем, что виндитат обладает антиагрегационным, антигемолитическим, иммунологическим и термопротекторным действием, которое обнаружено впервые.

Сравнение заявляемой питательной среды с известной показывает, что применение виндитата приводит к увеличению термоустойчивости полученного вирусного материала как на стадии формирования монослоя перевиваемых клеток, так и на стадии поддерживания клеток после заражения их вирусом.

Питательная среда готовится на основе стандартной среды Игла МЕМ Hepes с 10% -ной сывороткой крови КРС. В срезу добавляют виндитат в дозе 10^-5 10^-6 мас. перед высевом клеток. Двухсуточные монослои перевиваемых клеток почки зеленой мартышки Vero, выращенные при 37^оС на заявляемой среде, заражают суспензией вируса Венесуэльского энцефалита лошади (ВЭЛ, аттенуированный штамм ТС-83) из расчета 1-10 БОЕ/клетка. После адсорбции вируса (40 мин) монослой заливают поддерживающей питательной средой Игла МЕМ Hepes с 2%-ной сывороткой крови КРС. После инкубации при 37^оС в течение 2 сут образцы с полученной суспензией вируса испытывают на устойчивость к ускоренному хранению при 37^оС с тестированием их инфекционности на первичной культуре ФЭК под твердым агаровым покрытием стандартным методом определения бляшкообразующих единиц (БОЕ).

Положительный эффект виндитата в составе питательной среды сохраняется и при введении его в указанных дозах в поддерживающую среду.

При этом после заражения двухсуточного монослоя клеток Vero вирусом ВЭЛ с 40-минутной экспозицией для адсорбции во флаконы для культивации вносится поддерживающая среда (среда Игла МЕМ Hepes с 2%-ной сывороткой КРС). Виндитат в дозе 10^-5 10^-6 мас. можно вводить в поддерживающую среду после инокуляции монослоя клеток Vero вирусом с последующим культивированием в стандартных условиях.

При введении виндитата в питательную среду в дозах 10^-1 10^-3 мас. после 48-часового культивирования при 37^оС монослой культуры клеток Vero не образуется. При содержании соединения в дозе 10^-4 мас. монослой клеток Vero образуется частично (30% поверхности культурального флакона).

Положительный эффект от использования заявляемой питательной среды состоит в повышении термоустойчивости полученного вирусного материала, что имеет существенное значение для сохранения биологической активности на этапах создания и хранения вирусных препаратов. Преимущества предлагаемой среды заключаются в простоте приготовления, хорошей растворимости препарата, низкой дозе, высокой эффективности.

П р и м е р 1. Влияние виндитата на гемолиз эритроцитов.

Изучено влияние виндитата на резистентность эритроцитов in vitro при гемолизе, индуцированном 0,1 н. HCl и смесью растительных сапонинов. Об изменении динамики разрушения эритроцитов судили по изменению светорассеивающих свойств суспензии красных кровяных телец под воздействием гемолизирующих агентов. Виндитат в диапазоне доз от 0,001 до 10 мг/мл инкубируют с отмытыми эритроцитами кролика в течение 15 мин при 37^оС. Как видно из табл. 1, виндитат оказывает заметное защитное действие на мембраны эритроцитов при их альтерации HCl и сапонинами. Максимальный протекторный эффект наблюдается в дозе 10 мг/мл и составляет 50% что свидетельствует о высоком стабилизирующем эффекте соединения на мембраны эритроцитов.

П р и м е р 2. Влияние виндитата на агрегацию тромбоцитов.

Фармакологическое исследование виндитата в качестве стабилизатора мембран тромбоцитов выполнено на плазме крови кроликов, обогащенной тромбоцитами. Агрегацию тромбоцитов изучали по известной методике на агрегометре "Crono Zog". В качестве индуктора агрегации тромбоцитов использовали АДФ "Reanal" в конечной дозе 2 х 10^-5 М и комплемент в разведении 1:2. Предварительная инкубация тромбоцитов in vitro с виндитатом 15 мин при 37^оС приводит к ингибированию агрегации тромбоцитов, индуцированный как АДФ, так и комплементом. При этом в конечной дозе 1 мг/мл имеет место 100%-ное ингибирование процесса (табл. 2).

П р и м е р 3. Иммунологическая активность виндитата.

Иммунотропное действие виндитата изучают на мышах-самцах белых лабораторных, массой 18-21 г.

Влияние вещества на гуморальный иммунитет оценивают по числу антителообразующих клеток (АОК) в селезенке мышей, иммунизированных однократным внутрибрюшинным введением эритроцитов барана из расчета 2 х 10⁸ клеток на 10 г массы животного. АОК определяют методом локального гемолиза в монослое эритроцитов в специальных камерах. Соединение вводят в дозах: 50, 25, 10, 5 мг/кг в день антигенной нагрузки и в последующие 2 сут; на 5-е сут. после иммунизации животных забивали под эфирным наркозом. Рассчитывают число АОК на 10⁶ спленоцитов (относительное количество) и на всю массу (абсолютное количество). Активность соединений оценивают по отношению показателей опытной группы животных (соединение + иммунизация). Введение соединения в продуктивную фазу гуморального иммуногенеза сопровождается стимуляцией иммунного ответа (при дозе 10 мг/кг коэффициент (K) 1,95, т.е. стимулирует иммунный ответ по гуморальному типу приблизительно в 2 раза) (табл. 3).

Кроме АОК определялся титр антител методом гемаглютинации (Иммунологические методы./Под ред. Х. Фримель. М. Мир, 1979, с. 108-112).

Опыты проводились на мышах, белых лабораторных самцах массой 18-21 г.

Соединение вводили в дозе 10 мг/кг, перорально, в течение 7 дней. На 7-е сут. введена внутрибрюшинно антигенная нагрузка эритроцитами барана (ЭБ) в субтимальной дозе 2х10⁵ клеток. Забивались животные под эфирным наркозом на 7, 14, 21 сут. после иммунизации и ставилась методика гемаглютинации. Количество антител определяли по титрам по наибольшему разведению сыворотки, при котором реакция антиген-антитело еще считывается (табл. 4).

Сравнение титров подопытных и контрольных животных показывает, что увеличение титра антител наблюдается на 7, 21 сут. что позволяет сделать заключение об умеренной иммуностимулирующей активности изучаемого соединения.

П р и м е р 4. Влияние виндитата на термоустойчивость вируса при добавлении в ростовую среду.

Суспензию клеток почки зеленой мартышки (Vero) в концентрации 2 х 10⁵ клеток/мл в среде Игла МЕМ Hepes с 10%-ной сывороткой крови КРС расфасовывают в 2 флакона по 45 мл каждый. Навеску виндитата 100 мг растворяют при комнатной температуре в 100 мл среды Игла МЕМ Hepes с 10%-ной сывороткой крови КРС. Из полученного раствора готовят ряд десятикратных разведений: 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6, используя в качестве растворителя указанную выше ростовую среду. В один из флаконов добавляют 5 мл раствора 10^-4 разведения, а в другой 5 мл 10^-5 разведения. Суспензии перемешивают, встряхивают и разливают в 5 культуральных флаконов для каждой концентрации соединений. Параллельно ставят контроль по высеву клеток Vero в пяти культуральных флаконах без соединения. Клетки инкубируют при 37^оС в течение двух суток для образования монослоя.

Через двое суток среды из флаконов сливают и на монослой наносят пипеткой 2 мл вирусной суспензии аттенуированного штамма ТС-83 вируса ВЭЛ из расчета 1-10 БОЕ/клетка. Адсорбцию вируса на монослой клеток проводят в течение 40 мин при комнатной температуре, после чего жидкость, содержащуюся в культуральных флаконах, сливают, монослой промывают средой Игла МЕМ Hepes порциями по 10 мл на флакон. В культуральные флаконы заливают по 10 мл поддерживающей питательной среды Игла МЕМ Hepes и инкубируют 2 сут. при 37^оС. Через 2 сут полученный урожай вируса сливают, объединяя 5 флаконов в две испытуемые и одну контрольную партии. Образцы вирусосодержащих суспензий фасуют по 5 мл в пробирки и закладывают на хранение при 37^оС. Определяют биологическую активность образцов после культивирования вируса ВЭЛ и после хранения при 37^оС.

Полученные данные приведены в табл. 5.

П р и м е р 5. Влияние виндитата на термоустойчивость вирусов при добавлении в поддерживающую среду.

Высев клеток Vero в культуральные флаконы проводят с использованием базовой среды Игла МЕМ Hepes с 10%-ной сывороткой КРС. Используют суспензию клеток Vero с концентрацией 2 х 10⁵ клеток/мл. Флаконы инкубируют при 37^оС в течение 2 сут для образования монослоя клеток по стандартной методике. Для каждого используемого образца берут 5 параллельных флаконов. После образования монослоя клеток ростовую среду сливают и проводят заражение клеток вирусом ВЭЛ аналогично примеру 4, после чего монослой клеток промывают и в культуральные флаконы вносят поддерживающие среды в контрольную партию флаконов базовую среду Игла МЕМ Hepes с 2%-ной сывороткой КРС, в 2 опытные партии флаконов среды на основе базовой с 10^-5 мас. и 10^-6 мас. концентрациями виндитата.

Приготовление растворов виндитата в поддерживающей среде проводят аналогично примеру 4.

Культуральные флаконы инкубируют 2 сут при 37^оС, после чего собирают урожай вируса и объединяют по 5 флаконов в партии.

Проводят испытания полученных образцов в тесте на ускоренное хранение и определяют биоактивность вирусных суспензий после культивирования вируса и после хранения.

Полученные данные приведены в табл. 6.

Как видно из табл. 5 и 6, введение виндитата как в ростовую, так и в поддерживающую базовые питательные среды не ингибирует наработку вируса. Биоактивность вирусных суспензий, полученных с использованием виндитата, превышает биоактивность контрольных партий вируса боле чем в 10 раз при хранении при 37^оС.

Таким образом, положительный эффект от использования предлагаемой питательной среды состоит в повышении термоустойчивости получаемого вирусного материала, что имеет большое значение для сохранения биологической активности при температурной инактивации на этапах создания и хранения вирусных препаратов.

Использование: вирусология. Сущность изобретения: с целью повышения термоустойчивости культивируемого вируса на основе ростовой среды Игла МЕМ Hepes разработана высокоэффективная,питательная среда для стабилизации Вируса Венесуэльского энцефалита лошадей, содержавшая в качестве добавки 2 (винилоксиэтил) дитиокарбамат калия (виндитат) в количестве 10^-5-10^-6 мас %. 6 табл.

ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ СТАБИЛИЗАЦИИ ВИРУСА ВЕНЕСУЭЛЬСКОГО ЭНЦЕФАЛИТА ЛОШАДЕЙ на основе ростовой среды Игла MEMHepes, отличающаяся тем, что дополнительно она содержит 2-(винилоксиэтил)дитиокарбамат калия в количестве 10^-5 10^-6 мас.