Способ получения окрашенных суб-CTPATOB для ОпРЕдЕлЕНия пРОТЕОлиТичЕС-КОй АКТиВНОСТи Советский патент 1981 года по МПК C07K14/76 C07K1/107 C12N9/48 

1

Изобретение относится к улучшенному способу получения окрашенных субстратов для определения протеолитической активности соответствуюших ферментов, который может найти применение в биологии, медицине и сельском хозяйстве.

Известный способ получения окрашенных субстратов для определения протеолитической активности 1 включает обработку белка диазониевой солью в ш,елочной среде (рН) и последуюш,ее выделение целевого продукта при подкислении реакционной массы соляной кислотой.

Окрашивание белков диазониевыми солями происходит, в основном, вследствие взаимодействия с последним остатков гистидина и тирозина, с образованием интенсивно окрашенных азосоединений 2

ниевой солью, превращаясь в побочные низкомолекулярные окрашенные диазоамн ,,„ , ..,. Ar-H2)GB-UH2))5N-iK I-Ap)2

-icH2)5--r.:: .к2 А1 МАр-щ-1 к -АР

Эти нежелательные реакци затрудняют очистку субстрата и ухудшают его качество, из-за чего уменьшается точность определения протеолитической активности фермента.

Целью изобретения является повышение качества продукта.

Поставленная цель достигается описываемым способом, заключаюн1,имся в том, что перед обработкой белка диазо-ниевой солью проводят модификацию свободных аминогрунп белка ацилируюшнм 1ли алкилируюшим реагентом.

При этом, во времяреакции с модифицирующим реагентом, более 90% свободных аминогрупп белка модифицируются, а в реакцию с .онневой солью вступают, в основном, только гистйдиновые и тирозиновые остатки,---белка, образуя моноазопроизводные.

Стандартная методика приготовления раствора диазониевой соли для обработки белков: ароматический амин растворяют при леремешивании в экви.молярном количестве 0,1 н. NaOH, добавляют эквимолярное количество азотистокнслого натрия и охлаждают до О-5° С. Прибавляют по каплям, при перемешивании 1 в. HCi, с расчетом 4-5 моль на 1 моль амина и выдерж}-вают при температуре О-5° С в течение 30 мин. Полученный раствор непосредственно используют для окрашивания белков.

Пример 1. В IQO мл 15%-Ного водного раствора CHsCOONa растворяют 5 г альбумина (бь1чьей сывороткн) и при температуре 0° С, перемешивая, добавляют 15 мл уксусного ангидрида. По истечении 1 ч модифицированный альбумин осаждают, подкисляя реакционную смесь при помощи 1 н. НС до рН 3. Осадок отделяют центрифугированием, надосадочную жидкость удаляют, влажный .продукт растворяют в 100 мл 0,05М боратного буфера (рН 9,3), раствор охлал дают до О-5° С и, перемешивая, обрабатывают раствором диазониевой соли, полученным нз 0,52 г сульфаииловой кислоты. Реакцию проводят, энергично перемешивая при температуре О-5° С в течение 30 мин, рН поддерживают при помощи 1 н. NaOH в пределах 8,5-9,0. Продукт осаждают при помощи 1 н. НС1, понижением рН до 3. Осадок отделяют центрифугированием, очищают переосаждением из щелочного раствопа и лиофилизируют. Получают 4,0 н. субстрата в виде оранжевых пластинок, хорошо растворимых

нососд1111ен 1я, трудно отмываемые от целевого продукта:

J. -

в воде при рН 5. Молярный коэффицие:; экстинкцин при 340 нм, рН 7,2-85000, при 5 чОО нм, рН 7,2-50 000, ( молекулярную массу белка равной 70000).

Пример 2. В 100 мл 5,0 М раствора солянокислого гуанцдина растворяют 5 г казеината натрия, добавляют 10 г сукци0 пилангидрида; рН ноддерживают в нределах 9-10 при помоши 1 н. NaOH. Реакцию проводят в течение 30 мин. Прибавляют 7 г солянокислого гидроксиламина, рН доводят до Юн оставляют при комнатной

5 температуре в течение 60 мин. Продукт осаждают подкислением 1 н. НС1 до рН 3, осадок отделяют центрифугированием и растворяют в 100 мл 0,05 М боратного буфера. Раствор охлаждают до О-5° С и добавляют раствор диазониевой соли, приготовленный из 0,52 г ортаниловой кислоты; рН раствора поддерживают при помощи н. NaOH в пределах 9,0-9,5. Реакцию проводят в. течение 15 мин. Продукт

осаждают подкислением при помощи 1 н. НС1 до рН 3 и отделяют центрифугированием. Надосадочную жидкость удаляют, нродукт очищают переосаждением из щелочного раствора, осадок промывают 100 мл

0 воды, 100 мл этанола и сушат в вакуумэксикаторе одни сутки. Получают 3,8 г коричневого порошка, растворимого в слабо щелочном водном растворе. Молярный коэффициент экстинкции при 340 нм, рН 7,2-

5 115 000, при 400 нм, рН 7,2-75 ООО (принимая молекулярную массу белка равной 30000).

Пример 3. В 100 мл 0,05 М боратного буфера растворяют 3 г казеина, подщелачивают при помощи 1 н. NaOH до рН М, прибавляют 0,3 г акрилонитрила и выдерживают при комнатной температуре в течение 10-15 ч. Доводят рН до 9,5 и приливают раствор диазониевой соли, полученный из 0,37 г амино-Г-кислоты, рН поддерживают при помощи 1 и. NaOH в пределах 9,0--9,5. Реакцию проводят в течение 60 мин при температуре О-5° С. Выделение и очистку продукта проводят аналогично примеру 1. Получают 2,4 г окрашенного субстрата в виде красных пласстинок, хорошо растворимых в воде при рр г; ,„.,,., коэффициент экстинкции ппч .-550 н.(. пН 7,2-100000, ппи 400 нм, рН Я-ЯО 000 (ппинимая молекулярную массу павной 30000).

П п ... М - г. 4. В 100 мл 0,05 М боратного п твоояют 5 г казеинята натрия, подщелачивают при помощи 1 н. NaOH до рН 11, прибавляют 1,0 г акриламида и выдерживают при температуре 50 С в течение 8-10 ч. Реакционную смесь охлаждают до О-5° С, рН доводят при помощи 1 н. NaOH до 9,5 и прибавляют раствор диазониевой соли, приготовленный из 0,52 г сульфаниловой кислоты. Время реакции 15 мин, температура 0-5° С, рИ 8,5-9,0. Продукт выделяют и очищают аналогично примеру 2. Получают 3,5 г коричневого порошка, хорошо растворимого в слабо щелочном водном растворе. Молярный коэффициент экстинкции при 340 нм, рК 7,2-13000, при 400 нм, рН 7,2-80000 (принимая молекулярную массу белка равной 30 000).

П р и м е р 5. В 100 мл 0,05 М боратного буфера растворяют 3 г альбумина (бычьей сыворотки), добавляют 1 н. NaOH до рН 10, прибавляют 1,р мл 30%-ного раствора метилвинилкетона и выдерживают в течение 4 ч при комнатной температуре. Доводят рН до 9,5 и прибавляют ратвор диазониевой соли, приготовленный из 0,44 г /г-арсаниловой кислоты, рН раствора поддерживают в пределах 8,5-9,0, температуру 0-5 С. Реакцию проводят в течение 15 мин. Продукт выделяют и очищают аналогично примеру 1. Получают 2,3 г продуктов в виде красных пластинок, хорошо растворимых в воде при . Молярный коэффициент экстинкции при 340 нм, рН 7,2-115000, при 400 нм, рН 7,2-70 000 (принимая молекулярную массу белка равной 70000).

Пример 6. Приготовление раствора диазониевой соли из сульфаниловой кислоты:

В 30 мл 0,1 н. NaOH растворяют 0,52 г (0,003 моль) сульфаниловой кислоты, добавляют 0,21 г (0,003 моль) азотистокислого натрия и охлаждают до температуры О-5 С. К полученному раствору по каплям, при перемешивании добавляют 15 мл 1 н. НС1 и выдерживают нри температуре О-5 С в течение 30 мин.

Аналогичным путем были получены растворы диазониевых солей из ортаниловой, арсаниловой кислот и амино-Г-кислоты, которые в дальнейшем были использованы для обработки (окрашивания) растворов модифицированных белков.

Модификация аминогрупп белков перед окрашиванием обеспечивает следующие преимущества:

модификация препятствует образованию лабильных триазеновых и пентазеновых связей, в результате чего повышается стабильность субстрата, исключается расходование диазониевой соли на образование соединений с низким коэффициентом экстинкции, за счет чего повышается выход интенсивно окрашенных групп типа азогистидина и азотитрозина;

модификация снижает выход побочных окрашенных соединений, поэтому облегчается очистка целевого продукта и понижается фоновая окраска субстратов, оптическая плотность контрольных растворов при определении протеолитической активности составляет 0,01 и ниже;

повышается точность определения протеолитической активности; модификация улучшает механические свойства субстрата, что позволяет снизить время центрифугирования. В отдельных случаях возможно применение фильтрации, что упрощает процедуру очистки.

Проведена сравнительная оценка 3 образцов субстратов:

Субстрат I - окрашенный казеин, изготовленный по предлагаемому способу. Субстрат II - окрашенный казеин, изготовленный по способу-прототипу.

Субстрат III - азоказеин фирмы «Серва (ФРГ).

Для всех образцов определены 5 показателей: растворимость, степень окрашивания, относительная чувствительность при определении протеолитической активности, фоновая окраска контрольных проб при определении протеолитической активности, стабильность.

Определение растворимости субстратов. 0,500 г субстрата заливают 50 мл 0,1 М универсального буфера (рН 7,2), смесь перемешивают на магнитной мешалке при комнатной температуре (20° С). Определяют время, необходимое для полного растворения субстрата.

Результаты приведены ниже.

Время, мин

Субстрат 4 11 I

II 111

4

Определение степени окрашивания. Готовят 0,025%-ные растворы субстратов в 0,1 М универсальном буфере (рН 7,2). Измеряют оптическую плотность растворов на спектрофотометре СФ-26, при длине волны 400 нм, против буферного раствора (толщина кюветы 10 мм}.

Результаты приведены в табл. 1.

55

Таблица 1

Ошоснтельнаястепень окрашивания

1.00 0,82

S5 0,13

Определение относительной чувствительности при определении нротеолитической активности с использованием различных субстратов.

В пробирку вливают 2 мл 1%-ного раствора субстрата в универсальном буфере (рН 7,2), помещают в ультратермостат нри 30° С и выдерживают в течение 8-10 мин. Добавляют 2 мл раствора фермента (2,|5 мг/мл протосубтилина ГЗх), термостатированного нри 30 С. Точно через 10 мин добавляют 4 мл 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, чтобы прервать ферментативную реакцию и осадить непрогидролизованный субстрат. Быстро перемешивают н выдерживают при 30° С в течение 10 лгин. Затем реакционную смесь фильтруют через плотный фильтр (синяя лента). Измеряют оптическую плотность фильтрата на спектрофотометре СФ-26 против контрольной пробы при длине волны 400 нм.

Контрольную пробу готовят параллельно с опытным гидролизатом. Для этого в пробирку вливают 2 мл ферментного раствора, добавляют 4 мл раствора 10%-ного трихлоруксусной кислоты, выдерживают в ультратермостате при 30° С в течение 10 мин, затем в пробирку вносят 2 мл раствора субстрата, выдерживают при 30° С в течение 10 мин н фильтруют через плотный фильтр (синяя лента).

Результаты приведены в табл. 2.

т ;| блица 3

екая гктотность контро,1ьных проб

.1Ы1ая

0,iO 0,54

0,008 0,G2

Среднее значение из 5 измерений. В % по отношению к оптической плотности 0,25%-иото раствора соответствующето субстрата.

Определение стабильности субстратов. Образцы субстратов выдерживают в термостате при 100° С в течение 5 ч. Готовят

1% -ные растворы субстратов в универсальном буфере (рН 7,2). В пробирку вливают

2мл 1%-ного раствора субстрата, добавляют 2 мл воды и 4 мл раствора трихлоруксусной кислоты. Выдерживают в течение 10 мин при 30° С, фильтруют через плотный фильтр (синяя лента) и измеряют оптическую плотность субстрата на спектрофотометре СФ-26, против аналогичной смеси, не содержащей субстрата. Параллельно проводят контрольные опыты, осаждая субстраты, не подвергнутые нагреванию.

Результаты нриведены в табл. 4.

Т а б л и ц а 4

Оптическая плотность

р,.:JVI;O)OB при опреде.

;;ciiiiii активности

U

0,413

1,00 0.326 0,79 0,096 0,23

Оптнческоя плотиосИ) ;Ьи.1ьтратов

после о ч

без нагревания при 100° С

0,020

0.012 0,047 0,088 0,015 0,011 Среднее значение из 5 определений. Определение феновой окраски контрольных проб. В пробирку вносят 2 мл 1%-ного раствора субстрата в универсальном буфере (рН 7,2), добавляют 2 мл воды и 4 мл 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты. Перемешивают и выдерживают в течение 10 мин при 30° С. Фильтруют через плотный фильтр (синяя лента) и измеряют оптическую плотность фильтрата при К 400 нм на спектрофотометре СФ-26 против ее смеси, но не содержащей субстрат. Результаты приведены в табл. 3. Среднее значение нз 5 определений. Формула изобретения Способ получения окрашенных субстратов для определения протеолитнческой активности, путем обработки белка диазониевой солью в щелочной среде с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения качества продукта, перед обработкой белка диазониевой солью его подвергают взаимодействию с ацилирующим или алкилирующим реагентом. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе: 910

I. Суриков Б. П., Манойлов С. Е. Опреде-2. Howard А. N., Wild F., The Reactions

ление активности протеолитическнх фермен- . . „. .,,,.,.,

тов с помощью азоказеина. Вопросы меди-« Diazonium Compounds with Amino Acids

ЦННСКОЙ химии, 1965, XI, № 5, 55 (прототип). and Proteins, Biochem. J. 1957, 65, 651.

810723