Штамм бактерий РSеUDомоNаS рUтIDа - деструктор низкомолекулярных алифатических гликолей Советский патент 1992 года по МПК C02F3/34 C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма бактерий - деструктора низкомолекулярных алифатических гликолей, который может быть использован при очистке промышленных сточных вод.

Известен штамм бактерий Pseudomonas aeruginosa - деструктор ди- и этиленгликоля. Недостаток штамма - низкая активность разрушения гликолей.

Известен штамм бактерий Pseudomonas desmolyticum - деструктор диэтиленгликоля. Штамм разрушает диэтиленгликоль при его исходной концентрации 5 г/л за 3 сут культивирования на 63%, а при исходной концентрации 10 г/л - на

15%. Недостаток штамма - его невысокая разрушающая активность.

Целью изобретения является получение штамма бактерий Pseudomonas putida ВКПМ В-5150, устойчивого по отношению к высоким концентрациям гликоля в среде и обладающего более высокой деструктивной активностью по сравнению с известными.

Штамм выделен из сточных вод подземного хранилища газа. Для выделения использовали твердые среды следующего состава, г/л: агар-агар 15; КН2Р04 0,5; NH4CI 1,0; диэтиленгликоль 5; стерильная водопроводная вода до 1 л. Выращивание проводили при 25°С в течение нескольких суток в аэробных условиях, а также на МПА.

vj

ON

CN Ю Ю

Чистая культура получена путем многократных пересевов из единственной колонии.

Штамм хранят на косяках на средах с добавлением диэтиленгликоля. Пересевы проводят 1 раз в 2 месяца.

Штамм имеет следующую характеристику.

Культу рал ьно-морфо логические признаки.

Грамотрицательные подвижные палочки с округлыми концами и размером 0,7- 0,8x1,4-1,6 мкм. Клетки расположены одиночно, спор и капсул не образуют.

На мясопептонном агаре образует блестящие гладкие с ровным краем и плоским профилем колонии желтоватого цвета. Диаметр 3-х-суточной колонии - 3,0 мм.

На мясопептонном бульоне умеренный рост в виде слизистого хлопьевидного осадка. Образует зеленый флюоресцирующий пигмент, диффундирующий в среду.

На среде Кинг А не образует дополнительных пигментов.

На агаровой среде с добавлением диэтиленгликоля способность к пигментообра- зованию утрачивается. Наблюдается рост в виде мелких полупрозрачных колоний, округлых с ровным краем и плоским профилем.

Физиолого-биохимические признаки.

Отношение к источникам углерода: используют глюкозу, сахарозу, мальтозу, галактозу, арабинозу, маннит, этанол, глицерин, бутиленгликоль, твин-80, глиок- силат, гликолат, глицерат, глицин, креатин, гиппурат, фенилацетат, м-оксибензоат; не усваивает лактозу, ксилозу, рамнозу, де- кстран, сорбит, i-инозит, формиат, ацетат, ацетальдегид, полигликоли. Не проявляют потребности в дополнительных факторах роста.

Отношение к источникам азота: хороший рост на среде с аммонийным азотом, слабый - с нитратами.

Пробы на оксидазу, каталазу положительные; крахмал и желатину не гидроли- зует, Индол и сероводород не образуются, Наличие уреазы,денитрификации не обна- ружены. Восстанавливает нитраты до нитритов, пептонизирует молоко, дезами- нирует аминокислоты. Реакция Фогес-Про- скауера слабо положительна. Не образует левана из сахарозы.

Строгий аэроб.

Температурный диапазон роста 20- 37°С, оптимальная область 25-30°С.

Рост возможен в диапазоне рН 6,1-9,2, оптимальная зона 7,2-8,1.

Штамм непатогенен для теплокровных животных.

Периодическое культивирование штамма осуществляют в колбах Эрленмейера в среде следующего состава, г/л: КН2Р04 3,0; К2НР04,0; NH4N03 1,0; MgCteOJ; гликоль

5 или 10 г/л. Температура культивирования 25°С, скорость оборотов качалки 240 об/мин. Концентрация биомассы при посеве составляет не менее 0,15 г АСБ/л. Концентрацию гликолей в среде определя0 ют на хроматографе Хром-5 (ЧССР). Неподвижной фазой служит 10% FFAP, нанесенный на хроматон зернистостью 100-120 мкм. Температура термостата колонок-200°С, температура испарителя 250°С,

5 газ-носитель - гелий, расход газа носителя 30 мл/мин, детектор - пламенно-ионизационный. Снижение концентрации диэтиленгликоля после 24 ч роста при исходных концентрациях субстрата в среде, равных 5

0 и 10 г/л, происходит соответственно на 75 и 50%. Этиленгликоль за это же время разрушается полностью при исходной концентрации в среде, равной 5 г/л, и на 97% - при исходной концентрации 10 г/л. Максималь5 ная удельная скорость роста наблюдается в диапазоне концентраций субстрата диэтиленгликоля 5-40 г/л, этиленгликоля 0,0610 г/л.

Пример 1. Культивирование осуще0 ствляют на лабораторной установке объемом 10 л (АНКУМ-2М) в среде следующего состава, г/л: КН2Р04 3,0; К2НР04 4,0; NH4NOs 1,0; MgChOJ; диэтиленгликоль5,0. Количество посевного материала штамма

5 0,15 г абсолютно сухой массы/л среды. Выращивание осуществляют при 25°С, перемешивании 400 об/мин. Через 24 ч концентрация диэтиленгликоля снизилась на 75%.

0Пример 2. Условия культивирования

и состав среды, как в примере 1, за исключением того, что концентрация диэтиленгликоля 10 г/л. После 24 ч выращивания штамма содержание диэтиленгликоля в сре5 де составляет 50% от исходного уровня.

Пример 3. Условия культивирования и состав среды те же, что в примере 1, за исключением того, что в качестве источника углерода в среду добавлено 5 г/л этиленгли0 коля. После 24 ч выращивания весь этилен- гликоль использован штаммом.

Пример 4. Условия культивирования и состав среды те же, что в примере 1, за исключением того, что в среду добавлен эти5 ленгликоль в концентрации 10 г/л. После 24 ч выращивания штамма концентрация этиленгликоля составляет 3% от исходной.

Пример 5. Штамм P.putida ВКПМ В-5150 используют в качестве посевного материала для аэротенка 1-й ступени при за

пуске установок биохимического обезвре-При исходной концентрации диэтиленгживания высококонцентрированных сточ-ликоля 30 г/л (на входе в аэротенк 1 ступени)

ных вод подземных хранилищ газа (ПХГ). Встепень деструкции достигает 87% (навыхосточную воду дополнительно вносят аммо-де из азротенка 1 ступени),

фоску в концентрации 1 кг/м3. Объем аэро-5 Формула изобретения

тенка ПХГ 200 м3. Время пребыванияШтамм бактерий Pseudomonas putida

сточной воды в аэротенке 36-48 ч при не-ВКПМ В-5150-деструктор низкомолекулярпрерывной аэрации иловой суспензии.ных алифатических гликолей.

Использование: микробиологическая промышленность, биоочистка сточных вод на предприятиях химической промышленности от низкомолекулярных алифатических гликолей, в частности этилен- и диэтиленгликоля. Сущность изобретения: использование штамма Pseudomonas putida ВКПМ В-5150 позволяет осуществлять биоочистку от этиленгликоля и диэтиленгликоля. Штамм выделен из сточных вод подземного хранилища газа с использованием агаризованной среды, содержащей диэтиленгликоль в качестве единственного источника углерода. Штамм выражен в среде, содержащей, г/л: КНаРО 3,0; КаНРОз 4,0; NH4N031.0; MgCteO.I; диэтиленгликоль 5,0. Количество посевного материала 0,15 г абсолютно сухой биомассы/г среды. Степень очистки от диэтиленгликоля после 24 ч культивирования 75%, этиленглик.оля - практически полностью. 5 пр. ел С