СПОСОБ СОЗДАНИЯ НОВЫХ МУТАЦИЙ В ОРГАНИЗМАХ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2025 года по МПК C12N15/10 C12N15/63 C07K14/415 C12N15/82 C12N9/10 C12N9/22 

Область техники

Настоящее изобретение относится к области техники генной инженерии и, в частности, относится к способу получения сайт-специфичной мутации в организме в отсутствие матрицы искусственной ДНК и его применению.

Уровень техники

Технология генной инженерии для модификации генома организмов широко используется в промышленном и сельскохозяйственном производстве, например, генетически модифицированные микроорганизмы, обычно используемые в фармацевтической и химической областях, и генетически модифицированные культуры с резистентностью к насекомым и гербицидам в сельском хозяйстве. После открытия сайт-специфичных нуклеаз путем введения таргетной фрагментации в геном организма-реципиента и вызова спонтанной репарации стало возможным достичь сайт-специфичного редактирования генома и более точной модификации генома.

Инструменты редактирования генов в основном включают три типа сиквенс-специфичных нуклеаз (SSN): цинк-пальцевую нуклеазу (ZFN), нуклеазу на основе эффектора, подобную активатору транскрипции (TALEN) и ассоциированную с кластеризованными регулярными промежуточными короткими палиндромными повторами (CRISPR) систему Cas (систему CRISPR/Cas). Сиквенс-специфичными нуклеазами являются программируемые нуклеазы, которые могут создавать двухцепочечные разрывы ДНК (DSB) в специфичных сайтах генома. Двухцепочечные разрывы ДНК активируют эндогенный путь репарации ДНК для репарации повреждений ДНК в клетке, но процесс репарации легко приводит к изменениям в последовательности ДНК в сайтах-мишенях, тем самым обеспечивая введение мутаций в представляющие интерес сайты. Эта технология позволяет биологам точно таргетировать ген-мишень и редактировать его. Среди них, как ZFN, так и TALEN должны создать специфические модули белка распознавания для последовательности-мишени, что приводит к низкой пропускной способности и сложным операциям. Однако, белок Cas является универсальным в системе CRISPR/Cas, в которой направляющая РНК (gРНК) может быть образована специфичной CRISPR-РНК (crРНК), созданной только для сайта-мишени или в сочетании с трансактивирующей РНК (tracrРНК), или достаточно только одной направляющей РНК (sgРНК), crРНК и tracrРНК вместе или только sgРНК могут быть собраны с белком Cas с образованием рибонуклеопротеинового комплекса (RNP), последовательность-мишень идентифицируется на основе мотива, примыкающего к протоспейсеру (PAM) в геноме, тем самым реализуя сайт-специфичное редактирование. Таким образом, он стал основным инструментом редактирования генов из-за его простой работы, широкого диапазона применения и высокой производительности.

Сиквенс-специфичная нуклеаза может продуцировать двухцепочечные разрывы ДНК в специфичных сайтах в геноме. Эти двухцепочечные разрывы ДНК могут быть репарированы в различные типы репарации, которыми в основном являются вставки или делеции оснований. Например, двумя наиболее распространенными типами событий редактирования CRISPR/Cas9 являются вставка основания в месте разрыва или делеция основания в месте разрыва (Shen et al. 2018. Predictable and precise template-free CRISPR editing of pathogenic variants. Nature. DOI: 10.1038/s41586-018-0686-x). Вставка или делеция оснований в кодирующей области вызывает мутации со сдвигом рамки считывания, что приводит к потере функции гена. Следовательно, основной целью вышеупомянутых инструментов редактирования генов по-прежнему является нокаут генов.

Все время считалось, что использование только сиквенс-специфичных нуклеаз не может привести к мутациям типа замены оснований. С этой целью, известный уровень техники предлагает три решения: 1) добавление фрагмента экзогенной ДНК в качестве матрицы репарации для инициации пути репарации гомологичной рекомбинации; 2) слияние дезаминазы с Cas9 для последовательной разработки одноосновных инструментов редактирования для C - T и A - G; 3) слияние обратной транскриптазы с Cas9 с использованием pegРНК для управления синтезом и заменой малой цепи ДНК. Однако, эффективность редактирования этих трех растворов значительно ниже эффективности нокаута гена, и одновременное введение фрагмента экзогенной ДНК и обратной транскриптазы вполне может вызвать опасения по поводу биологической безопасности. Эффект вне мишени одноосновного редактирования также ограничивает его потенциальное применение в клеточной терапии. Особенно для долгосрочных проектов по селекции растений, то, как повысить эффективность замены оснований на сайте-мишени при одновременном снижении опасений регулирующих органов по поводу биобезопасности, является проблемой, которую необходимо решить при применении технологии редактирования генов.

Таким образом, в области клеточной терапии и биологической селекции существует острая техническая потребность в сайт-специфичной замене оснований с использованием только таргетного нокаута сиквенс-специфичной нуклеазы без введения фрагмента чужеродной ДНК, особенно с помощью не трансгенной системы временного редактирования для эффективного завершения редактирования сайт-специфичной замены основания.

Сущность изобретения

Изобретение представляет способ создания сайт-специфичной мутации в организме только путем создания двухцепочечных разрывов в геноме и без предоставления матрицы искусственной ДНК, и применение этого способа.

Технические решения, принятые настоящим изобретением, следующие:

Способ создания новой мутации в организме, который включает следующие стадии: последовательное создание двух или нескольких разрывов ДНК в специфичном сайте генома организма и их спонтанную репарацию, соответственно, где более поздний разрыв ДНК создается на основе новой последовательности, созданной из предыдущей репарации разрыва ДНК.

В конкретном варианте осуществления, «разрыв ДНК» достигается путем доставки нуклеазы с таргетным свойством в клетку организма для контакта со специфичным сайтом геномной ДНК.

В конкретном варианте осуществления, «нуклеазой с таргетным свойством» является система ZFN, TALEN или CRISPR/Cas.

В конкретном варианте осуществления, «последовательное создание двух или нескольких разрывов ДНК в специфичном сайте» относится к тому, что на основе новой последовательности, созданной в результате предыдущего события репарации разрыва ДНК, вызванного редактированием ZFN или TALEN, создается новый белок ZFN или TALEN для того, чтобы снова разрезать сайт.

В другом конкретном варианте осуществления, «последовательное создание двух или нескольких разрывов ДНК в специфичном сайте» относится к тому, что на основе новой последовательности, созданной в результате предыдущего события репарации разрыва ДНК, вызванного системой CRISPR/Cas, создается новая РНК-мишень для того, чтобы снова разрезать сайт. Например, второе разрезание проводят в этом сайте снова путем конструирования новой РНК-мишени на основе новой последовательности, сгенерированной в результате события репарации первого разрыва при редактировании Cas9. Аналогичным образом, в этом сайте проводят третье разрезание путем конструирования новой РНК-мишени на основе новой последовательности, полученной в результате второго события репарации разрыва и так далее, как показано на фигуре 1.

В конкретном варианте осуществления, «два или несколько разрывов ДНК» создаются путем последовательной доставки разных таргетных нуклеаз в клетки-реципиенты разных поколений, где мутантная клетка, которая завершила предыдущее редактирование, используется в качестве реципиента для доставки таргетной нуклеазы для последующего редактирования, тем самым выполняя второе редактирование для создания сайт-специфичной мутации. Этот способ предпочтительно использовать для систем редактирования ZFN и TALEN.

В другом конкретном варианте осуществления, «два или несколько разрывов ДНК» создаются путем доставки разных таргетных нуклеаз для разных мишеней в одну и ту же клетку-реципиент. Этот способ предпочтительно использовать для системы редактирования CRISPR/Cas.

В конкретном варианте осуществления, «два или более несколько ДНК» создаются, когда комплексы RNP образуются одной и той же CRISPR/Cas нуклеазой, соответственно, где разные gРНК или sgРНК последовательно разрезают соответствующие последовательности-мишени.

В другом конкретном варианте осуществления, «два или несколько разрывов ДНК» создаются, когда комплексы RNP, образованные каждой из двух или нескольких нуклеаз CRISPR/Cas, которые распознают разные последовательности PAM с соответствующими gРНК или sgРНК, последовательно разрезают соответствующие последовательности-мишени. Например, последовательностью PAM, распознаваемой Cas9 Streptococcus pyogenes, является «NGG» или «NAG» (Jinek et al., "A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity", Science 2012, 337:816-821), последовательностью PAM, распознаваемой Cas9 Staphylococcus aureus, является «NNGRRT» или «NNGRR(N)», последовательностью PAM, распознаваемой Cas9 Neisseria meningitidis, является NNNNGATT, и последовательностью PAM, распознаваемой Cas9 Streptococcus thermophilus, является NNAGAAW. Таким образом, редактируемое окно молекулы ДНК становится больше.

В конкретном варианте осуществления, таргетной нуклеазой является любая нуклеаза CRISPR/Cas, способная осуществлять редактирование генома.

В конкретном варианте осуществления, таргетная нуклеаза имеет форму ДНК.

В другом конкретном варианте осуществления, таргетная нуклеаза имеет форму mРНК или белка вместо ДНК. Белковая форма является предпочтительной.

В конкретном варианте осуществления, способ доставки таргетных нуклеаз в клетку выбран, но не ограничен ими, из: 1) способа ПЭГ-опосредованной трансфекции клеток; 2) способа липосомно-опосредованной трансфекции клеток; 3) способа электропорационной трансформации; 4) микроинъекции; 5) бомбардировки генной пушкой; 6) способа Agrobacterium-опосредованной трансформации.

В этом способе, новую мишень создают на основе новой последовательности, созданной в результате предыдущей репарации разрыва ДНК, и, таким образом, мутации могут последовательно образовываться много раз в специфичном сайте генома, тем самым экспоненциально обогащая типы событий репарации после разрывов ДНК и создавая новые типы мутаций с заменой основания, делецией и вставкой, которые нельзя получить путем редактирования одного гена, так что этот способ подходит для использования в качестве инструмента для создания новых мутаций. Этот способ можно кратко описать как способ запрограммированного последовательного отрезания/редактирования или последовательного отрезания/редактирования.

В конкретном варианте осуществления, новую мишень создают на основе новой специфической последовательности, которая, по прогнозам, будет получена в результате предыдущего восстановления разрыва в специфичном сайте генома организма, затем выполняют последовательное редактирование, и, таким образом, окончательная возможная мутация в этом сайте может быть создана заранее, чтобы добиться ожидаемого редактирования.

В другом конкретном варианте осуществления, новую мишень создают на основе новой последовательности, которая, по прогнозам, будет создаваться в результате предыдущего восстановления разрыва в специфичном сайте генома организма, затем выполняют последовательное редактирование, и, в дополнение к ожидаемому событию редактирования, различные в конечном итоге на сайте могут быть созданы различные мутации, так что способ можно использовать в качестве инструмента для создания различных мутаций.

В другом аспекте настоящее изобретение дополнительно обеспечивает способ создания новой мутации в организме, который включает следующую стадию: последовательное создание двух или более разрывов ДНК в специфическом участке гена на уровне генома или хромосомы организма., тем самым достигается точная замена основания, делеция или вставка.

В конкретном варианте осуществления, «последовательное создание двух или нескольких разрывов ДНК в специфичном сайте» относится к тому, что новая РНК-мишень создана на основе новой последовательности, созданной из предыдущего события репарации разрыва, и отрезание выполняют снова на том же сайте.

В конкретном варианте осуществления, «разрыв ДНК» достигается с помощью нуклеазы с таргетным свойством.

Настоящее изобретение дополнительно представляет новую мутацию, полученную вышеупомянутым способом.

Настоящее изобретение дополнительно относится к белку или его биологически активному фрагменту, который имеет вышеупомянутую новую мутацию.

Настоящее изобретение дополнительно относится к нуклеиновой кислоте, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты или комплементарную ей последовательность, которая кодирует белок или его биологически активный фрагмент.

Настоящее изобретение дополнительно представляет нуклеиновую кислоту, которая содержит:

(а) нуклеотидную последовательность, кодирующую РНК-мишень, где

РНК-мишень содержит, по меньшей мере, две РНК-мишени, в которых первая РНК-мишень таргетирует ДНК, вызывая разрыв в ДНК, и последняя РНК-мишень таргетирует последовательность, созданную в результате предыдущего события репарации разрыва, и снова создает разрыв.

В конкретном варианте осуществления, нуклеиновая кислота дополнительно содержит (b) нуклеотидную последовательность, кодирующую Cas полипептид.

В конкретном варианте осуществления, РНК-мишенью является sgРНК или gРНК.

В конкретном варианте осуществления, Cas полипептид и РНК-мишень присутствуют в клетке in vitro или клетке ex vivo.

Настоящее изобретение дополнительно представляет рекомбинантный вектор экспрессии, который содержит вышеупомянутую нуклеиновую кислоту и функционально связанный с ней промотор.

Настоящее изобретение дополнительно представляет кассету экспрессии, которая содержит вышеупомянутую нуклеиновую кислоту.

Настоящее изобретение дополнительно представляет клетку-хозяина, которая содержит вышеупомянутую кассету экспрессии.

Настоящее изобретение дополнительно представляет организм, регенерируемый с использованием вышеупомянутой клетки-хозяина.

Настоящее изобретение дополнительно представляет способ лизиса ДНК-мишени, который включает контакт ДНК-мишени с комплексом, где комплекс содержит:

(а) Cas полипептид; и

(b) по меньшей мере, две РНК-мишени, где первая РНК-мишень таргетирует ДНК, чтобы вызвать разрыв в ДНК, и последняя РНК-мишень таргетирует последовательность, созданную в результате предыдущего события репарации разрыва, и снова создает разрыв.

В конкретном варианте осуществления, РНК-мишенью является sgРНК или gРНК.

В конкретном варианте осуществления, ДНК-мишень присутствует в бактериальной клетке, эукариотической клетке, растительной клетке или животной клетке.

В конкретном варианте осуществления, ДНК-мишенью является хромосомная ДНК.

В конкретном варианте осуществления, Cas полипептид и РНК-мишень присутствуют в клетке in vitro или клетке ex vivo.

В конкретном варианте осуществления, контакт включает введение в клетку следующего: (а) Cas полипептида или полинуклеотида, кодирующего Cas полипептид, и (b) РНК-мишени или полинуклеотида ДНК, кодирующего РНК-мишень.

Настоящее изобретение дополнительно представляет композицию, которая содержит:

(а) Cas полипептид или полинуклеотид, кодирующий Cas полипептид; и

(b) по меньшей мере, две РНК-мишени или полинуклеотиды ДНК, кодирующие РНК-мишени, где первая РНК таргетирует ДНК, чтобы вызвать разрыв в ДНК, и последняя РНК-мишень таргетирует последовательность, созданную в результате предыдущего события репарации разрыва, и создает новый разрыв.

В конкретном варианте осуществления, РНК-мишенью является sgРНК или gРНК.

В конкретном варианте осуществления, Cas полипептид и РНК-мишень присутствуют в клетке in vitro или клетке ex vivo.

Изобретение дополнительно относится к применению композиции в производстве лекарственного средства для лечения заболевания.

Заболевание, которое можно лечить с помощью композиции по настоящему изобретению, включает, но не ограничено ими, заболевание, вызванное мутацией одного гена, такое как генетическая тирозинемия 1 типа, фенилкетонурия, прогерия, серповидно-клеточная анемия и т. д. Самопроизвольная репарация клеток индуцируется путем доставки в клетку Cas белка и композиции crРНК или sgРНК, которая, как ожидается, репарирует сайт патогенной мутации с продуцированием нормального функционального белка, и, таким образом, достигается терапевтический эффект.

Настоящее изобретение дополнительно представляет набор, который включает:

(а) Cas полипептид или нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую Cas полипептид; и

(b) по меньшей мере, две РНК-мишени или нуклеиновые кислоты, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие РНК-мишени, где первая РНК-мишень таргетирует ДНК, чтобы вызвать разрыв в ДНК, и последняя РНК-мишень таргетирует последовательность, созданную в результате предыдущего события репарации разрыва и снова создает разрыв;

где (а) и (b) находятся в одном и том же контейнере или отдельных контейнерах.

В конкретном варианте осуществления, РНК-мишенью является sgРНК или gРНК.

В конкретном варианте осуществления, РНК-мишени в (b) находятся в одном контейнере или отдельных контейнерах.

Настоящее изобретение дополнительно представляет способ скрининга событий редактирования, независимых от экзогенных трансгенных маркеров, включающий следующие стадии:

1) два или несколько разрывов ДНК последовательно создают в специфичном сайте первого гена-мишени клетки-реципиента и спонтанно репарируют, соответственно, где более поздний разрыв ДНК создают на основе новой последовательности, полученной в результате репарации предыдущего разрыва ДНК;

2) определенные события редактирования создают после того, как конкретный сайт первого гена-мишени последовательно отрезают и репарируют, что может придать мутантной клетке резистентность к определенному давлению отбора для продуцирования фенотипического селектируемого признака, соответствующее давление отбора применяют для селекции признака, и выделяют клетку, ткань, орган или целый организм, который содержит такие события редактирования;

3) необязательно, в дополнение к первому гену-мишени, таргетную нуклеазу для, по меньшей мере, одного второго гена-мишени используют для одновременного редактирования другого сайта-мишени, и событие редактирования второго гена-мишени синхронно обогащают и подвергают скринингу посредством скрининга селектируемого признака, созданного мутациями первого гена-мишени, и выделяют клетки, ткани, органа или целого организма, которые одновременно содержат события редактирования первого гена-мишени и, по меньшей мере, одного второго гена-мишени.

В конкретном варианте осуществления, «первым геном-мишенью» является локус гена, кодирующий, по меньшей мере, один фенотипический селектируемый признак, где, по меньшей мере, одним фенотипическим селектируемым признаком является признак резистентности/толерантности или признак преимущества роста.

В конкретном варианте осуществления, «специфический сайт первого гена-мишени» относится к сайту, в котором возникает определенный тип мутации после последовательных разрезов и репараций, который способен придать клетке-реципиенту резистентность к определенному давлению отбора для получения, по меньшей мере, одного фенотипически селектируемого признака резистентности/толерантности или признака преимущества роста.

В конкретном варианте осуществления, «мутация определенного типа» включает замену одного основания, замену множества оснований или вставку или делецию неопределенного числа оснований.

В конкретном варианте осуществления, «определенным давлением отбора» может быть давление окружающей среды или давление, возникающее в результате добавления соединения; например, давлением окружающей среды является высокая температура, низкая температура или гипоксия и подобные; давлением, возникающим в результате добавления соединения, может быть давление, возникающее в результате концентрации иона соли, антибиотика, цитотоксина, гербицида и т. д.

В конкретном варианте осуществления, «разрыв ДНК» достигается путем доставки нуклеазы с таргетным свойством в клетку организма для контакта со специфичным сайтом геномной ДНК.

В конкретном варианте осуществления, «нуклеазой с таргетным свойством» является любая нуклеаза CRISPR/Cas, способная осуществлять редактирование генома.

В конкретном варианте осуществления, признак «два или несколько разрывов ДНК последовательно создаются в определенной последовательности в специфичном сайте» относится к тому, что основано на новой последовательности, образованной предыдущим событием репарации разрыва ДНК, созданным системой CRISPR/Cas, новая РНК-мишень создана для повторного разрезания сайта.

В конкретном варианте осуществления, «два или несколько разрывов ДНК» создаются, когда комплексы RNP, образованные одной и той же CRISPR/Cas нуклеазой, соответственно, с разными gРНК или sgРНК, последовательно разрезают соответствующие последовательности-мишени.

В другом конкретном варианте осуществления, «два или несколько разрывов ДНК» создаются, когда комплексы RNP, соответственно, образованные каждой из двух или нескольких нуклеаз CRISPR/Cas, которые распознают разные последовательности PAM с соответствующими gРНК или sgРНК, последовательно разрезают соответствующие последовательности-мишени. Таким образом, редактируемое окно молекулы ДНК становится больше.

В конкретном варианте осуществления, «второй ген-мишень» относится к другому гену, кодирование которого отличается от первого гена-мишени.

В конкретном варианте осуществления, «таргетная нуклеаза, по меньшей мере, для одного второго гена-мишени» и нуклеаза CRISPR/Cas, используемые для создания разрыва ДНК в специфичном сайте первого гена-мишени, являются одинаковыми.

В другом конкретном варианте осуществления, «таргетная нуклеаза, по меньшей мере, для одного второго гена-мишени» и нуклеаза CRISPR/Cas, используемые для создания разрыва ДНК в специфичном сайте первого гена-мишени, являются разными. Таким образом, на втором гене-мишени имеется больше сайтов селектируемого редактирования.

В конкретном варианте осуществления, таргетная нуклеаза имеет форму ДНК.

В другом конкретном варианте осуществления, таргетная нуклеаза имеет форму mРНК или белка вместо ДНК. Белковая форма является предпочтительной.

В конкретном варианте осуществления, способ доставки таргетной нуклеазы в клетку выбран, но не ограничен ими, из: 1) способа ПЭГ-опосредованной трансфекции клеток; 2) способа липосомно-опосредованный трансфекции клеток; 3) способа электропорационной трансформации; 4) микроинъекции; 5) бомбардировки генной пушкой; или 6) способом Agrobacterium-опосредованной трансформации.

Настоящее изобретение также представляет способ не трансгенного временного редактирования генома организма, включающий следующие стадии:

1) создания и синтеза комбинации, по меньшей мере, двух фрагментов crРНК или комбинации, по меньшей мере, двух фрагментов sgРНК для специфичного сайта первого гена-мишени клетки-реципиента, где комбинация crРНК в комбинации с tracrРНК или только комбинация sgРНК способны управлять соответствующим Cas белком для последовательного создания двух или нескольких разрывов ДНК в конкретном сайте в первом гене-мишени клетки-реципиента и их спонтанной репарации, соответственно, где более поздний разрыв ДНК создается на основе новой последовательности, создаваемой из предыдущей репарации разрыва ДНК;

2) смешивания соответствующего количества белка CRISPR/Cas или его соответствующей mРНК с комбинацией фрагментов crРНК и фрагмента tracrРНК или только с комбинацией фрагментов sgРНК, как указано выше, созданной и синтезированной заранее, которая способна направлять сайт-специфическое редактирование первого гена-мишени для создания эндогенных селективных маркеров, необязательно, последующего добавления, по меньшей мере, одного из искусственно синтезированных фрагментов crРНК и tracrРНК или искусственно синтезированных фрагментов sgРНК, таргетирующих второй, третий или несколько генов-мишеней, и проведения инкубации in vitro с образованием комплекса RNP;

3) доставки вышеуказанного комплекса RNP в клетку-реципиент и контакта со специфичным сайтом геномной ДНК для осуществления редактирования гена;

4) в соответствии с фенотипическим селектируемым признаком, создаваемым сайт-специфическим редактированием первого гена-мишени комплексом RNP, применения соответствующего давления отбора, чтобы провести селекцию признака и выделения клетки, ткани, органа или всего организма, который содержит событие редактирования, и, необязательно, выделения клетки, ткани, органа или полного организма, которые одновременно содержат события редактирования первого гена-мишени и, по меньшей мере, одного из второго, третьего или нескольких генов-мишеней.

В конкретном варианте осуществления «первым геном-мишенью» является локус гена, кодирующий, по меньшей мере, один фенотипический селектируемый признак, где, по меньшей мере, одним фенотипическим селектируемым признаком является признак резистентности/толерантности или признака преимущества роста.

В конкретном варианте осуществления, «специфичный сайт первого гена-мишени» относится к сайту, в котором создается определенный тип мутации после последовательных разрезов и репараций, которые способны придать клетке-реципиенту резистентность к определенному давлению отбора для получения, по меньшей мере, одного фенотипически селектируемого признака резистентности/толерантности или признака преимущества роста.

В конкретном варианте осуществления, «мутация определенного типа» включает замену одного основания, замену множества оснований или вставку или делецию неопределенного числа оснований.

В конкретном варианте осуществления, «определенным давлением отбора» может быть давление окружающей среды или давление, возникающее в результате добавления соединения; например, давлением окружающей среды является высокая температура, низкая температура или гипоксия и подобные; давлением, возникающим в результате добавления соединения, может быть давление, возникающее в результате концентрации иона соли, антибиотика, цитотоксина или гербицида и подобных.

В конкретном варианте осуществления, белком CRISPR/Cas является любая нуклеаза CRISPR/Cas, способная осуществлять редактирование генома.

В конкретном варианте осуществления, признак «последовательное создание двух или нескольких разрывов ДНК в специфичном сайте» означает, что на основе новой последовательности, образованной предыдущим событием репарации разрыва ДНК, сгенерированным системой CRISPR/Cas, создается новая РНК-мишень для повторного разрезания сайта.

В конкретном варианте осуществления, «два или несколько разрывов ДНК» создаются, когда комплексы RNP, образованные одной и той же нуклеазой CRISPR/Cas, соответственно, с различными gРНК или sgРНК, последовательно разрезают соответствующие последовательности-мишени.

В другом конкретном варианте осуществления, «два или несколько разрывов ДНК» создаются, когда комплексы RNP, соответственно, образованные каждой из двух или нескольких нуклеаз CRISPR/Cas, которые распознают разные последовательности PAM с соответствующими gРНК или sgРНК, последовательно разрезают соответствующие последовательности-мишени. Таким образом, редактируемое окно молекулы ДНК становится больше.

В конкретном варианте осуществления, «второй, третий или несколько генов-мишеней» относятся к другим генам, кодирование которых отличается от первого гена-мишени.

В конкретном варианте осуществления, «по меньшей мере, один из искусственно синтезированных фрагментов crРНК и tracrРНК или искусственно синтезированных фрагментов sgРНК, таргетирующих второй, третий или несколько генов-мишеней» имеет тот же самый Cas белок, что и crРНК или sgРНК, таргетирующие первый ген-мишень.

В другом конкретном варианте осуществления, «по меньшей мере, один из искусственно синтезированных фрагментов crРНК и tracrРНК или искусственно синтезированных фрагментов sgРНК, таргетирующих второй, третий или несколько генов-мишеней», и crРНК или sgРНК, таргетирующих первый ген-мишень, используют Cas белки, которые распознают разные последовательности PAM. Таким образом, на втором гене-мишени имеется больше селектируемых сайтов редактирования.

В конкретном варианте осуществления, способ доставки RNP комплекса в клетки выбран, но не ограничен ими, из: 1) способа ПЭГ-опосредованной трансфекции клеток; 2) способа липосомно-опосредованной трансфекции клеток; 3) способа электропорационной трансформации; 4) микроинъекции; 5) бомбардировки генной пушкой; и так далее.

Настоящее изобретение также представляет способ не трансгенного временного редактирования генома растения, включающий следующие стадии:

1) создания и синтеза комбинации, по меньшей мере, двух фрагментов crРНК или комбинации, по меньшей мере, двух фрагментов sgРНК для специфичного сайта первого гена-мишени растительной клетки-реципиента, где комбинация crРНК в комбинации с tracrРНК или только комбинация sgРНК способны управлять соответствующим Cas белком для последовательного создания двух или нескольких разрывов ДНК в конкретном сайте в первом гене-мишени клетки-реципиента и их спонтанной репарации, соответственно, где более поздний разрыв ДНК создается на основе новой последовательности, создаваемой из предыдущей репарации разрыва ДНК;

2) смешивания соответствующего количества белка CRISPR/Cas или его соответствующей mРНК с комбинацией фрагментов crРНК и фрагмента tracrРНК или только с комбинацией фрагментов sgРНК, как указано выше, созданной и синтезированной заранее, которая способна направлять сайт-специфическое редактирование первого гена-мишени для создания эндогенных селективных маркеров, необязательно, последующего добавления, по меньшей мере, одного из искусственно синтезированных фрагментов crРНК и tracrРНК или искусственно синтезированных фрагментов sgРНК, таргетирующих второй, третий или несколько генов-мишеней, и проведения инкубации in vitro с образованием комплекса RNP;

3) доставки вышеуказанного комплекса RNP в растительную клетку или ткань-реципиент и контакта со специфичным сайтом геномной ДНК для осуществления редактирования гена;

4) в соответствии с фенотипическим селектируемым признаком, создаваемым сайт-специфическим редактированием первого гена-мишени комплексом RNP, применения соответствующего давления отбора, чтобы провести селекцию признака и выделения клетки, ткани, органа или всего растения, которое содержит событие редактирования, и, необязательно, выделения клетки, ткани, органа или полного растения, которые одновременно содержат события редактирования первого гена-мишени и, по меньшей мере, одного из второго, третьего или нескольких генов-мишеней.

В конкретном варианте осуществления «первым геном-мишенью» является локус гена, кодирующий, по меньшей мере, один фенотипический селектируемый признак, где, по меньшей мере, одним фенотипическим селектируемым признаком является признак резистентности/толерантности или признак преимущества роста.

В конкретном варианте осуществления, «специфичный сайт первого гена-мишени» относится к сайту, в котором мутация определенного типа создается после последовательного разрезания и репарации в сайте, что может придать клетке-реципиенту резистентность к определенному давлению отбора для получения, по меньшей мере, одного фенотипически селектируемого признака резистентности/толерантности или признака преимущества роста.

В конкретном варианте осуществления «мутация определенного типа» включает замену одного основания, замену множества оснований или вставку или делецию неопределенного числа оснований.

В конкретном варианте осуществления «определенным давлением отбора» может быть давление окружающей среды или давление, возникающее в результате добавления соединения; например, давлением окружающей среды предпочтительно является высокая температура, низкая температура или гипоксия и т.п.; давлением, возникающим в результате добавления соединения может быть давление, вызванное концентрацией ионов соли, антибиотиком, цитотоксином, гербицидом и т.д.

В конкретном варианте осуществления, «реципиентной растительной клеткой или тканью» является любая клетка или ткань, которые могут служить реципиентом для временной экспрессии и могут быть регенерированы в полноценное растение через культуру ткани. В частности, клеткой является протопластная клетка или суспензионная клетка; тканью предпочтительно является каллюс, незрелый зародыш, зрелый зародыш, лист, верхушка побега, молодой колос, гипокотиль и т.д.

В конкретном варианте осуществления, белком CRISPR/Cas является любая нуклеаза CRISPR/Cas, способная осуществлять редактирование генома.

В конкретном варианте осуществления функция «последовательное создание двух или нескольких разрывов ДНК в специфичном сайте» означает, что на основе новой последовательности, образованной предыдущим событием репарации разрыва ДНК, созданным системой CRISPR/Cas, создается новая РНК-мишень для повторного разрезания сайта.

В конкретном варианте осуществления, «два или несколько разрывов ДНК» создаются, когда комплексы RNP, образованные одной и той же CRISPR/Cas нуклеазой, соответственно, с различными gРНК или sgРНК, последовательно разрезают соответствующие последовательности-мишени.

В другом конкретном варианте осуществления, «два или несколько разрывов ДНК» создаются, когда, комплексы RNP, соответственно, образованные каждой из двух или нескольких CRISPR/Cas нуклеаз, которые распознают разные последовательности PAM, с соответствующими gРНК или sgРНК, последовательно разрезают соответствующие последовательности-мишени. Таким образом, редактируемое окно молекулы ДНК становится больше.

В конкретном варианте осуществления, «второй, третий или несколько генов-мишеней» относятся к другим генам, кодирование которых отличается от первого гена-мишени.

В конкретном варианте осуществления «по меньшей мере, один из искусственно синтезированных фрагментов crРНК и tracrРНК или искусственно синтезированных фрагментов sgРНК, таргетирующих второй, третий или несколько генов-мишеней» имеет общий белок Cas с crРНК или sgРНК, таргетирующими первый ген-мишень.

В другом конкретном варианте осуществления «по меньшей мере, один из искусственно синтезированных фрагментов crРНК и tracrРНК или искусственно синтезированных фрагментов sgРНК, таргетирующих второй, третий или несколько генов-мишеней», и crРНК или sgРНК, таргетирующие первый ген-мишень, используют белки Cas, которые распознают разные последовательности PAM. Таким образом, на втором гене-мишени имеется больше селектируемых сайтов редактирования.

В конкретном варианте осуществления, способ доставки комплекса RNP в растительные клетки выбран, но не ограничен ими, из: 1) способа ПЭГ-опосредованной трансформации протопластов; 2) микроинъекции; 3) бомбардировки генной пушкой; 4) способа, опосредованного волокнами карбида кремния; 5) способа вакуумной инфильтрации или любого другого способа кратковременного введения. Бомбардировка генной пушкой является предпочтительной.

В конкретном варианте осуществления, «первым геном-мишенью» является, по меньшей мере, один эндогенный ген, который кодирует, по меньшей мере, один фенотипический селектируемый признак, выбранный из резистентности/толерантности к гербицидам, где резистентность/толерантность к гербицидам выбрана из группы, состоящей из резистентности/толерантности к ингибитору EPSPS (включая глифосат); резистентности/толерантности к ингибитору синтеза глутамина (включая глюфосинат); резистентности/толерантности к ингибитору ALS или AHAS (включая имидазолин или сульфонилмочевину); резистентности/толерантности к ингибитору АССазы (включая арилоксифеноксипропионовую кислоту (FOP)); резистентности/толерантности к ингибитору биосинтеза каротиноидов, включая ингибиторы биосинтеза каротиноидов на стадии фитоендесатуразы (PDS), ингибиторы 4-гидроксифенилпируватдиоксигеназы (HPPD) или другие таргетные ингибиторы биосинтеза каротиноидов; резистентности/толерантности к ингибитору целлюлозы; резистентности/толерантности к ингибитору синтеза жиров; резистентности/толерантности к ингибитору длинноцепочечных жирных кислот; резистентности/толерантности к ингибитору сборки микротрубочек; резистентности/толерантности к электрон-шунтирующему агенту фотосистемы I; резистентности/толерантности к ингибитору фотосистемы II (включая карбаматы, триазины и триазоны); резистентности/толерантности к ингибитору PPO; и резистентности/толерантности к синтетическому гормону роста (включая дикамба, 2,4-D (т.е. 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту)). Где первый ген-мишень выбран из PsbA, ALS, EPSPS, ACCase, PPO, HPPD, PDS, GS, DOXPS, TIR1, AFB5, и некоторые типы мутаций, созданных после последовательных разрезаний и репараций в специфичных сайтах этих гербицидных генов-мишеней, могут придать клеткам растения-реципиента резистентность/толерантность к соответствующим гербицидам.

В конкретном варианте осуществления, «первым геном-мишенью» является ALS, и «специфичный сайт гена» относится к сайту A122, P197, R198, D204, A205, D376, R377, W574, S653 или G654 в аминокислотной последовательности белка Arabidopsis AtALS (например, показанной в SEQ ID NO:1) и аминокислотным сайтам в белке ALS другого растения, которые соответствуют вышеупомянутым аминокислотным сайтам при использовании аминокислотной последовательности AtALS в качестве эталонного стандарта. crРНК или sgРНК таргетируют последовательность-мишень, содержащую последовательность, кодирующую сайт аминокислотной последовательности белка AtALS, выбранный из группы, состоящей из A122, P197, R198, D204, A205, D376, R377, W574, S653, G654 или любой их комбинации, и последовательность-мишень, содержащую последовательность, кодирующую аминокислотный сайт в белке ALS другого растения, который соответствует вышеупомянутым аминокислотным сайтам, и любую их комбинацию, с использованием аминокислотной последовательности AtALS в качестве эталонного стандарта. Сайт ALS W574 является предпочтительным. Давлением отбора предпочтительно является обработка пироксуламом или никосульфуроном.

В конкретном варианте осуществления, «первым геном-мишенью» является АССаза, и «специфичный сайт гена» относится к сайтам I1781, E1874, N1878, W1999, W2027, I2041, D2078, C2088 или G2096 аминокислотной последовательности белка Alopecurus myosuroides AmACCase (например, показанной в SEQ ID NO: 3, и последовательности гена, показанной в SEQ ID NO: 4), и аминокислотные сайты в белке АССазы другого однодольного растения, которые соответствуют вышеупомянутым аминокислотным сайтам с использованием аминокислотной последовательности AmACCase в качестве эталонного стандарта. crРНК или sgРНК таргетируют последовательность-мишень, содержащую последовательность, кодирующую сайт аминокислотной последовательности AmACCase, выбранный из группы, состоящей из I1781, E1874, N1878, W1999, W2027, I2041, D2078, C2088, G2096 или любую их комбинацию, и последовательность-мишень, содержащую последовательность, кодирующую аминокислотный сайт в белке АССазы другого однодольного растения, которая соответствует указанному выше аминокислотному сайту, и любую их комбинацию, с использованием аминокислотной последовательности AmACCase в качестве эталонного стандарта. Сайт W2027 ACCазы является предпочтительным. Давлением отбора предпочтительно является обработка хизалофоп-п-этилом.

В конкретном варианте осуществления, «первым геном-мишенью» является HPPD, и «специфичный сайт гена» относится к сайту H141, L276, P277, N338, G342, R346, D370, P386, K418 или G419 в аминокислотной последовательности белка Oryza sativa OsHPPD (показанной в SEQ ID NO: 5, и последовательности генома, показанной в SEQ ID NO: 6), и аминокислотные сайты в белке HPPD другого растения, которые соответствуют вышеупомянутым аминокислотным сайтам при использовании аминокислотной последовательности OsHPPD в качестве эталонного стандарта. crРНК или sgРНК таргетируют последовательность-мишень, содержащую последовательность, кодирующую сайт аминокислотной последовательности OsHPPD, выбранный из группы, состоящей из H141, L276, P277, N338, G342, R346, D370, P386, K418, G419 или любой их комбинации, и последовательность-мишень, содержащую последовательность, кодирующую аминокислотный сайт в белке HPPD другого растения, который соответствует указанному выше аминокислотному сайту, и любую их комбинацию, с использованием аминокислотной последовательности OsHPPD в качестве эталонного стандарта. Давлением отбора предпочтительно является обработка бискарфентразоном.

В конкретном варианте осуществления, «первым геном-мишенью» является РРО, и «специфичный сайт гена» относится к сайту S128, V217, S223, V364, K373, L423, Y425 или W470 в аминокислотной последовательности белка Oryza sativa OsPPO1 (показанной в SEQ ID NO: 7, и последовательности генома, показанной в SEQ ID NO: 8), и аминокислотным сайтам в белке РРО другого растения, которые соответствуют вышеупомянутым аминокислотным сайтом, при использовании аминокислотной последовательности OsPPO1 в качестве эталонного стандарта. crРНК или sgРНК таргетируют последовательность-мишень, содержащую последовательность, кодирующую сайт аминокислотной последовательности OsPPO1, выбранный из группы, состоящей из S128, V217, S223, V364, K373, L423, Y425, W470, или любой их комбинации, и последовательность-мишень, содержащую последовательность вышеупомянутых аминокислотных сайтов, соответствующих белку РРО другого растения, и любую их комбинацию при использовании аминокислотной последовательности OsPPO1 в качестве эталонного стандарта. Давлением отбора предпочтительно является лечение сафлуфенацилом.

В конкретном варианте осуществления, «первым геном-мишенью» является TIR1, и «специфичный сайт гена» относится к сайт F93, F357, C413 или S448 в аминокислотной последовательности белка Oryza sativa OsTIR1 (показанной в SEQ ID NO: 9, и последовательности генома, показанной в SEQ ID NO: 10), и аминокислотным сайтам в белке TIR1 другого растения, которые соответствуют вышеупомянутым аминокислотным сайтам при использовании аминокислотной последовательности OsTIR1 в качестве эталонного стандарта. crРНК или sgРНК таргетируют последовательность-мишень, содержащую последовательность, кодирующую сайт аминокислотной последовательности OsTIR1, выбранный из группы, состоящей из F93, F357, C413, S448 или любой их комбинации, и последовательность-мишень, содержащую последовательность, кодирующую аминокислотный сайт в белке TIR1 другого растения, который соответствует указанному выше аминокислотному сайту, и любую их комбинацию, при использовании аминокислотной последовательности OsTIR1 в качестве эталонного стандарта. Давлением отбора предпочтительно является обработка 2,4-D.

Настоящее изобретение дополнительно представляет не трансгенную систему временного редактирования, использующую вышеупомянутый способ.

Настоящее изобретение дополнительно представляет использование вышеупомянутой не трансгенной системы временного редактирования в качестве маркера селекции.

Настоящее изобретение дополнительно представляет использование вышеупомянутой не трансгенной системы временного редактирования для лечения заболевания.

Настоящее изобретение дополнительно представляет использование вышеупомянутой не трансгенной системы временного редактирования в биологической селекции.

Настоящее изобретение дополнительно представляет генетически модифицированное растение, полученное вышеупомянутым способом, геном которого содержит событие редактирования первого гена-мишени, и генетически модифицированное растение получено не трансгенным способом.

Настоящее изобретение дополнительно представляет генетически модифицированное растение, полученное вышеупомянутым способом, геном которого содержит событие редактирования первого гена-мишени и дополнительно содержит, по меньшей мере, одно событие редактирования второго гена-мишени, и генетически модифицированное растение получено в не трансгенным способом.

Настоящее изобретение дополнительно представляет генетически модифицированное растение, полученное вышеупомянутым способом, геном которого содержит, по меньшей мере, одно второе событие редактирования гена-мишени, и генетически модифицированное растение получено не трансгенным способом, где первое событие редактирования гена-мишени было удалено путем генетического разделения.

Настоящее изобретение дополнительно представляет геном генетически модифицированного растения, полученного вышеупомянутым способом, где геном содержит: 1) событие редактирования первого гена-мишени; 2) событие редактирования первого гена-мишени и событие редактирования, по меньшей мере, одного второго гена-мишени; или 3), по меньшей мере, одно событие редактирования второго гена-мишени, где событие редактирования первого гена-мишени было удалено путем генетического разделения; где генетически модифицированное растение получено не трансгенным способом.

Другой аспект настоящего изобретения представляет новую мутацию гена растения, полученную вышеупомянутым способом.

Настоящее изобретение также представляет новую мутацию, созданную в растении, которая включает один или комбинацию двух или нескольких из следующих типов:

замена аспарагиновой кислоты в сайте, соответствующем Arabidopsis ALS376, на любую другую аминокислоту, замена триптофана в сайте, соответствующем Arabidopsis ALS574, на любую другую аминокислоту, замена серина в сайте, соответствующем Arabidopsis ALS653, на любую другую аминокислоту, или замена серина в сайте, соответствующем Arabidopsis ALS654, на любую другую аминокислоту; или замена триптофана в сайте, соответствующем Alopecurus myosuroides ACCase2027, на любую другую аминокислоту.

В конкретном варианте осуществления, в котором аспарагиновая кислота на сайте, соответствующем Arabidopsis ALS376, заменена глутаминовой кислотой (D376E), триптофан на сайте, соответствующем Arabidopsis ALS574, заменена лейцином или метионином (W574L или W574M), серин на сайте, соответствующем Arabidopsis ALS653, заменен аспарагином или аргинином (S653N или S653R), или глицин на сайте, соответствующем Arabidopsis ALS654, заменен аспарагиновой кислотой (G654D), где аминокислотные сайты указаны с использованием соответствующих аминокислотных сайтов в Arabidopsis thalianan в качестве эталона; или триптофан на сайте, соответствующем Alopecurus myosuroides АССаза2027, заменен лейцином или цистеином (W2027L или W2027C), где аминокислотный сайт указан с использованием соответствующего аминокислотного сайта в Alopecurus myosuroides в качестве эталона.

В другом конкретном варианте осуществления, типом мутации является S653R/G654D, где аминокислотные сайты указаны с использованием соответствующих аминокислотных сайтов в Arabidopsis thalianan в качестве эталона.

В конкретном варианте осуществления, аспарагиновая кислота на сайте 350 Oryza sativa ALS заменена любой другой аминокислотой, триптофан на сайте 548 Oryza sativa ALS заменен любой другой аминокислотой, или триптофан на сайте 561 Solanum tuberosum L. ALS 2 заменен любой другой аминокислотой; или триптофан на сайте 2038 Oryza sativa ACCase2 заменен любой другой аминокислотой.

В другом конкретном варианте осуществления, аспарагиновая кислота на сайте 350 Oryza sativa ALS заменена глутаминовой кислотой (D350E), триптофан на сайте 548 Oryza sativa ALS заменена лейцином или метионином (W548L или W548M), или триптофан на сайте 561 Solanum tuberosum L. ALS 2 заменен лейцином или метионином (W561L или W561M); или триптофан на сайте 2038 Oryza sativa АССаза2 заменен лейцином или цистеином (W2038L или W2038C), где аминокислотная последовательность белка Oryza sativa ALS показана в SEQ ID NO: 11, аминокислотная последовательность белка Solanum tuberosum L. StALS2 показана в SEQ ID NO: 19, и аминокислотная последовательность белка Oryza sativa ACCase2 показана в SEQ ID NO: 13.

Настоящее изобретение дополнительно представляет белок или его биологически активный фрагмент, который имеет вышеупомянутую новую мутацию.

Настоящее изобретение также представляет нуклеиновую кислоту, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты или комплементарную ей последовательность, которая кодирует белок или его биологически активный фрагмент.

Настоящее изобретение дополнительно представляет рекомбинантный вектор экспрессии, который содержит нуклеиновую кислоту и функционально связанный с ней промотор.

Настоящее изобретение дополнительно представляет кассету экспрессии, содержащую нуклеиновую кислоту.

Настоящее изобретение дополнительно представляет растительную клетку, содержащую кассету экспрессии.

Настоящее изобретение дополнительно представляет растение, регенерированное с использованием растительной клетки.

Другой аспект настоящего изобретения представляет способ получения растения с улучшенной резистентностью или толерантностью к гербицидам, который включает регенерацию растительной клетки в растение.

В другом аспекте настоящего изобретения, представлен способ борьбы с сорняками на участке выращивания растений, где растение включает указанное выше растение или растение, полученное указанным выше способом, где способ включает внесение на участок выращивания одного или нескольких гербицидов в эффективном количестве для борьбы с сорняками.

Другой аспект настоящего изобретения также представляет применение новой мутации, белка или его биологически активного фрагмента, нуклеиновой кислоты, рекомбинантного вектора экспрессии или кассеты экспрессии для повышения резистентности или толерантности растительной клетки, растительной ткани, части растения или растения к гербицидам.

Настоящее изобретение имеет следующие превосходные технические эффекты:

На основе последовательностей, созданных из нового события репарации, созданного последовательным редактированием, могут быть разработаны новые мишени, которые могут последовательно формировать мутации много раз на специфичном сайте генома, тем самым экспоненциально обогащая типы событий репарации после разрывов ДНК, и реализуя новые типы мутаций замен оснований, делеции и вставки, которые не могут быть получены путем редактирования одного гена. То есть, запрограммированная последовательная схема разрезания/редактирования, принятая в настоящем изобретении, которая использует последовательность, созданную из предыдущей репарации редактирования гена в качестве более поздней мишени редактирования гена, может наделить CRISPR/Cas новыми функциями редактирования одного основания и сайт-точной делеции и вставки через простой нокаут.

Изобретение может реализовать скрининг событий редактирования генов в отсутствие экзогенных маркеров, дополнительно реализовать не трансгенное редактирование генов и проводить эффективный скрининг событий редактирования, и может значительно уменьшить проблемы биологической безопасности способа в клеточной терапии и биологической селекции.

В частности, способ не трансгенного временного редактирования растений, представленный настоящим изобретением, вовлекает только Cas белок и искусственно синтезированные малые фрагменты gРНК или sgРНК, без участия экзогенной ДНК во всем процессе, и продуцирует эндогенные маркеры селекции резистентности путем редактирования первого гена-мишени через последовательное разрезание/редактирование, так что событие редактирования может быть эффективно подвергнуто скринингу, фактически без участия операций генетической модификации, и, таким образом, способ эквивалентен химическому мутагенезу или радиационно-индуцированной селекции, а также не требует непрерывного множественного создания сепарации и обнаружения экзогенных трансгенных компонентов, тем самым сокращая цикл селекции, обеспечивая биологическую безопасность, экономя затраты на надзор и регистрацию и открывая большие перспективы применения в точной селекции растений.

Подробное описание изобретения

В настоящем изобретении, если не указано иное, используемые здесь научные и технические термины имеют значения, обычно понятные специалистам в данной области техники. Кроме того, термины, связанные с химией белков и нуклеиновых кислот, молекулярной биологией, культурой клеток и тканей, микробиологией, иммунологией и лабораторными процедурами, используемые здесь, являются терминами и рутинными процедурами, широко используемыми в соответствующих областях техники. В то же время, чтобы лучше понять настоящее изобретение, ниже приведены определения и пояснения связанных терминов.

Используемый здесь термин «геном» относится ко всем дополнениям генетического материала (генам и не кодирующим последовательностям), присутствующим в каждой клетке или вирусе или органелле организма, и/или полному геному, унаследованному от родителя, как единице (гаплоидной).

Термин «редактирование генов» относится к стратегиям и методам таргетной специфической модификации любой генетической информации или генома живых организмов. Следовательно, этот термин включает редактирование областей, кодирующих ген, но также включает редактирование областей, отличных от областей, кодирующих ген, в геноме. Это также включает редактирование или модификацию другой генетической информации ядер (если они есть) и клеток.

Термин «CRISPR/Cas нуклеаза» может быть нуклеазой на основе CRISPR или последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей ее, включая, но не ограничиваясь ими: 1) Cas9, включая SpCas9, ScCas9, SaCas9, xCas9, VRER-Cas9, EQR-Cas9, SpG-Cas9, SpRY-Cas9, SpCas9-NG, NG-Cas9, NGA-Cas9 (VQR) и т.д.; 2) Cas12, включая LbCpf1, FnCpf1, AsCpf1, MAD7 и т. д., или любой вариант или производное вышеупомянутой нуклеазы на основе CRISPR; предпочтительно, когда, по меньшей мере, одна нуклеаза на основе CRISPR содержит мутацию по сравнению с соответствующей последовательностью дикого типа, так что полученная нуклеаза на основе CRISPR распознает другую последовательность PAM. Используемый здесь термин «нуклеаза на основе CRISPR» является любой нуклеазой, которая была идентифицирована в существующей в природе системе CRISPR, которая впоследствии была выделена из своей природной среды и, предпочтительно, была модифицирована или объединена в представляющую интерес рекомбинантную конструкцию, подходящую в качестве инструмента для таргетного конструирования генома. Поскольку исходная нуклеаза на основе CRISPR дикого типа обеспечивает распознавание ДНК, т.е. свойства связывания, можно использовать любую нуклеазу на основе CRISPR и, необязательно, перепрограммировать или иным образом мутировать так, чтобы она подходила для различных вариантов осуществления изобретения.

Термин «CRISPR» относится к методу сиквенс-специфичных генетических манипуляций, который основан на кластеризованных регулярных промежуточных коротких палиндромных повторах, что отличается от РНК-интерференции, которая регулирует экспрессию генов на уровне транскрипции.

«Cas9 нуклеаза» и «Cas9» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к РНК-управляемой нуклеазе, содержащей белок Cas9 или его фрагмент (например, белок, содержащий активный домен расщепления ДНК Cas9 и/или gРНК связывающий домен Cas9). Cas9 является компонентом системы редактирования генома CRISPR/Cas (кластеризованные регулярные промежуточные короткие палиндромные повторы и ассоциированные системы). Он может таргетировать и разрезать последовательности-мишени ДНК под руководством направляющей РНК с образованием двухцепочечных разрывов ДНК (DSB).

«Cas белок» или «Cas полипептид» относится к полипептиду, кодируемому геном Cas (CRISPR-ассоциированным). Cas белок включает Cas эндонуклеазу. Cas белок может быть бактериальным или простейшим белком. Например, белки CRISPR Cas типов с I - III в настоящем документе обычно происходят от прокариотов; белки Cas типа I и типа III могут быть получены из бактерий или видов простейших, и белок Cas типа II (т.е. Cas9) может быть получен из видов бактерий. «Cas белки» включают Cas9 белок, Cpf1 белок, C2c1 белок, C2c2 белок, C2c3 белок, Cas3, Cas3-HD, Cas5, Cas7, Cas8, Cas10, Cas12a, Cas12b или их комбинацию или комплекс.

«Вариант Cas9» или «вариант Cas9 эндонуклеазы» относится к варианту исходной Cas9 эндонуклеазы, где, будучи связанным с crРНК и tracРНК или с sgРНК, вариант Cas9 эндонуклеазы сохраняет способность распознавать, связываться со всей или частью последовательности ДНК-мишени и, необязательно, развертывать всю или часть последовательности ДНК-мишени, никовать всю или часть последовательности ДНК-мишени или разрезать всю или часть последовательности ДНК-мишени. Варианты Cas9 эндонуклеазы включают варианты Cas9 эндонуклеазы, описанные в настоящем документе, где варианты Cas9 эндонуклеазы отличаются от исходной Cas9 эндонуклеазы следующим образом: варианты Cas9 эндонуклеазы (в комплексе с gРНК с образованием полинуклеотид-направленного эндонуклеазного комплекса, способного модифицировать сайт-мишень) обладают, по меньшей мере, одним улучшенным свойством, таким как, но не ограничиваясь ими, повышенная эффективность трансформации, повышенная эффективность редактирования ДНК, пониженное разрезание вне мишени или любая их комбинация по сравнению с исходной Cas9 эндонуклеазой (в комплексе с той же gРНК с образованием полинуклеотидом-направленного эндонуклеазного комплекса, способного модифицировать один и тот же сайт-мишень).

Варианты Cas9 эндонуклеазы, описанные в настоящем документе, включают варианты, которые могут связываться и никовать сайты-мишени двухцепочечной ДНК, будучи ассоциированной с crРНК и tracrРНК или с sgРНК, в то время как исходная Cas эндонуклеаза может связываться с сайтом-мишенью и приводить к двухцепочечному разрыву (расщеплению), будучи ассоциированной с crРНК и tracrРНК или с sgРНК.

«Направляющая РНК» и «gРНК» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к последовательности направляющей РНК, используемой для таргетирования конкретного гена для коррекции с использованием технологии CRISPR, которая обычно состоит из молекул crРНК и tracrРНК, частично комплементарных для образования комплекса, где crРНК содержит последовательность, которая имеет достаточную комплементарность с последовательностью-мишенью, чтобы гибридизоваться с последовательностью-мишенью и направлять комплекс CRISPR (Cas9+crРНК+tracrРНК) на специфическое связывание с последовательностью-мишенью. Однако в данной области техники известно, что можно сконструировать одну направляющую РНК (sgРНК), которая обладает свойствами как crРНК, так и tracrРНК.

Термины «одиночная направляющая РНК» и «sgРНК» используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к синтетическому слиянию двух молекул РНК, которое включает слияние crРНК (CRISPR РНК) вариабельного таргетирующего домена (связанного с последовательностью спаривания tracr, гибридизированной с tracrРНК) и tracrРНК (трансактивирующей CRISPR РНК). sgРНК может содержать crРНК или фрагменты crРНК и tracrРНК или фрагменты tracrРНК системы CRISPR/Cas типа II, которые могут образовывать комплекс с Cas эндонуклеазой типа II, где комплекс направляющей РНК/Cas эндонуклеазы может направлять Cas эндонуклеазу к сайту-мишени ДНК таким образом, чтобы Cas эндонуклеаза могла распознавать, необязательно связываться с сайтом-мишенью ДНК и необязательно никовать сайт-мишень ДНК или разрезать (вводить одноцепочечный или двухцепочечный разрыв) сайт-мишень ДНК.

В некоторых вариантах осуществления направляющие РНК и Cas9 могут быть доставлены в клетку в виде комплекса рибонуклеопротеина (RNP). RNP состоит из очищенного Cas9 белка в комплексе с gРНК, и в данной области техники хорошо известно, что RNP можно эффективно доставлять во многие типы клеток, включая, но не ограничиваясь ими, стволовые клетки и иммунные клетки (Addgene, Cambridge, MA, Mirus Bio LLC, Madison, WI).

Примыкающий к протоспейсеру мотив (PAM) в настоящем документе относится к короткой нуклеотидной последовательности, примыкающей к (таргетной) последовательности-мишени (преспейсеру), распознаваемой эндонуклеазной системой gРНК/Cas. Если последовательность ДНК-мишени не примыкает к соответствующей последовательности PAM, Cas эндонуклеаза не сможет успешно распознать последовательность ДНК-мишени. Последовательность и длина PAM в настоящем документе могут различаться в зависимости от используемого Cas белка или комплекса Cas белков. Последовательность PAM может быть любой длины, но обычно имеет длину 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 нуклеотидов.

Используемый в настоящем документе термин «организм» или «живой организм» включает животных, растения, грибы, бактерии и подобные.

Используемый в настоящем документе термин «клетка-хозяин» включает клетки растений, клетки животных, клетки грибов, клетки бактерий и подобные.

В настоящем изобретении, «животное» включает, но не ограничено ими, позвоночных, таких как человек, млекопитающие, отличные от человека, птицы, рыбы, рептилии, земноводные и т.д., а также беспозвоночных, таких как насекомые.

В настоящем изобретении, под «растением» следует понимать любой дифференцированный многоклеточный организм, способный осуществлять фотосинтез, в частности однодольные или двудольные растения, например, (1) пищевые культуры: Oryza spp., такие как Oryza sativa, Oryza latifolia, Oryza sativa, Oryza glaberrima; Triticum spp., такие как Triticum aestivum, T. Turgidumssp. durum; Hordeum spp., такие как Hordeum vulgare, Hordeum arizonicum; злаковые Secale; Avena spp., такие как Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantine, Avena fatua var.sativa, Avena hybrida; Echinochloa spp., такие как Pennisetum glaucum, Sorghum, Sorghum bicolor, Sorghum vulgare, Triticale, Zea mays или Maize, Millet, Rice, Foxtail millet, Proso millet, Sorghum bicolor, Panicum, Fagopyrum spp., Panicum miliaceum, Setaria italica, Zizania palustris, Eragrostis tef, Panicum miliaceum, Eleusine coracana; (2) бобовые культуры: Glycine spp., такие как Glycine max, Soja hispida, Soja max, Vicia spp., Vigna spp., Pisum spp., конские бобы, Lupinus spp., Vicia, Tamarindus indica, Lens culinaris, Lathyrus spp., Lablab, кормовые бобы, маш, красная фасоль, нут; (3) масличные культуры: Arachis hypogaea, Arachis spp., Sesamum spp., Helianthus spp., такие как Helianthus annuus, Elaeis, такие как Eiaeis guineensis, Elaeis oleifera, соя, Brassicanapus, Brassica oleracea, Sesamum orientale, Brassica juncea, Oilseed rape, Camellia oleifera, масличная пальма, олива, клещевина, Brassica napus L., рапс; (4) волокнистые культуры: Agave sisalana, Gossypium spp. такие как Gossypium, Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum, Hibiscus cannabinus, Agave sisalana, Musa textilis Nee, Linum usitatissimum, Corchorus capsularis L, Boehmeria nivea (L.), Cannabis sativa, Cannabis sativa; (5) плодовые культуры: Ziziphus spp., Cucumis spp., Passiflora edulis, Vitis spp., Vaccinium spp., Pyrus communis, Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Malus spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Ficus carica, виды Fortunella, виды Fragaria, виды Crataegus, виды Diospyros, Eugenia unifora, Eriobotrya japonica, Dimocarpus longan, Carica papaya, Cocos spp., Averrhoa carambola, Actinidia spp., Prunus amygdalus, Musa spp. (musa acuminate), Persea spp. (Persea Americana), Psidium guajava, Mammea Americana, Mangifera indica, Canarium album (Oleaeuropaea), Caricapapaya, Cocos nucifera, Malpighia emarginata, Manilkara zapota, Ananas comosus, Annona spp., Citrus reticulate (Citrus spp.), Artocarpus spp., Litchi chinensis, Ribes spp., Rubus spp., груша, персик, абрикос, слива, красная восковница, лимон, кумкват, дуриан, апельсин, клубника, черника, дыня хами, мускусная дыня, финиковая пальма, ореховое дерево, вишня; (6) корневищные культуры: Manihot spp., Ipomoea batatas, Colocasia esculenta, горчица клубневая, Allium cepa (лук), eleocharis tuberose (водяной орех), Cyperus rotundus, Rhizoma dioscoreae; (7) овощные культуры: Spinacia spp., Phaseolus spp., Lactuca sativa, Momordica spp, Petroselinum crispum, Capsicum spp., Solanum spp. (например, Solanum tuberosum, Solanum integrifolium, Solanum lycopersicum), Lycopersicon spp. (например, Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme), Macrotyloma spp., Kale, Luffa acutangula, чечевица, бамия, лук, картофель, артишоки, спаржа, брокколи, Brussels sprouts, капуста, морковь, цветная капуста, сельдерей, листовая капуста, кабачки, Benincasa hispida, Asparagus officinalis, Apiumgraveolens, Amaranthus spp., Allium spp., Abelmoschus spp., Cichorium endivia, Cucurbita spp., Coriandrum sativum, B.carinata, Rapbanus sativus, Brassica spp. (например, Brassica napus, Brassica rapa ssp., рапс, масличный рапс, турнепс, турнепс, листовая горчица, капуста, черная горчица, рапс (рапс), Brussels sprout, Solanaceae (баклажан), Capsicum annuum (сладкий перец), огурец, люффа, китайская капуста, рапс, капуста, калебас, китайский зеленый лук, лотос, корень лотоса, салат; (8) цветочные культуры: Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Canna indica, Opuntia spp., Tagetes spp., Cymbidium (орхидея), Crinum asiaticum L., Clivia, Hippeastrum rutilum, Rosa rugosa, Rosa Chinensis, Jasminum sambac, Tulipa gesneriana L., Cerasus sp., Pharbitis nil (L.) Choisy, Calendula officinalis L., Nelumbo sp., Bellis perennis L., Dianthus caryophyllus, Petunia hybrida, Tulipa gesneriana L., Lilium brownie, Prunus mume, Narcissus tazetta L., Jasminum nudiflorum Lindl., Primula malacoides, Daphne odora, Camellia japonica, Michelia alba, Magnolia liliiflora, Viburnum macrocephalum, Clivia miniata, Malus spectabilis, Paeonia suffruticosa, Paeonia lactiflora, Syzygium aromaticum, Rhododendron simsii, Rhododendron hybridum, Michelia figo (Lour.) Spreng., Cercis chinensis, Kerria japonica, Weigela florida, Fructus forsythiae, Jasminum mesnyi, Parochetus communis, Cyclamen persicum Mill., Phalaenophsis hybrid, Dendrobium nobile, Hyacinthus orientalis, Iris tectorum Maxim, Zantedeschia aethiopica, Calendula officinalis, Hippeastrum rutilum, Begonia semperflorenshybr, Fuchsia hybrida, Begonia maculataRaddi, Geranium, Epipremnum aureum; (9) лекарственные культуры: Carthamus tinctorius, Mentha spp., Rheum rhabarbarum, Crocus sativus, Lycium chinense, Polygonatum odoratum, Polygonatum Kingianum, Anemarrhena asphodeloides Bunge, Radix ophiopogonis, Fritillaria cirrhosa, Curcuma aromatica, Amomum villosum Lour., Polygonum multiflorum, Rheum officinale, Glycyrrhiza uralensis Fisch, Astragalus membranaceus, Panax ginseng, Panax notoginseng, Acanthopanax gracilistylus, Angelica sinensis, Ligusticum wallichii, Bupleurum sinenses DC., Datura stramonium Linn., Datura metel L., Mentha haplocalyx, Leonurus sibiricus L., Agastache rugosus, Scutellaria baicalensis, Prunella vulgaris L., Pyrethrum carneum, Ginkgo biloba L., Cinchona ledgeriana, Hevea brasiliensis (дикая), Medicago sativa Linn, Piper Nigrum L., Radix Isatidis, Atractylodes macrocephala Koidz; (10) сырьевые культуры: Hevea brasiliensis, Ricinus communis, Vernicia fordii, Morus alba L., Hops Humulus lupulus, Betula, Alnus cremastogyne Burk., Rhus verniciflua stokes; (11) пастбищные культуры: Agropyron spp., Trifolium spp., Miscanthus sinensis, Pennisetum sp., Phalaris arundinacea, Panicum virgatum, спороболусы, Indiangrass, Big bluestem grass, Phleum pratense, turf, Cyperaceae (Kobresia pygmaea, Carex pediformis, Carex humilis), Medicago sativa Linn, Phleum pratense L., Medicago sativa, Melilotus suavcolen, Astragalus sinicus, Crotalaria juncea, Sesbania cannabina, Azolla imbircata, Eichhornia crassipes, Amorpha fruticosa, Lupinus micranthus, Trifolium, Astragalus adsurgens pall, Pistia stratiotes linn, Alternanthera philoxeroides, Lolium; (12) сахарные культуры: Saccharum spp., Beta vulgaris; (13) культуры для производства напитков: Camellia sinensis, Camellia Sinensis, чай, кофе (Coffea spp.), Theobroma cacao, Humulus lupulus Linn.; (14) газонные растения: Ammophila arenararia, Poa spp. (Poa pratensis (мятлик)), Agrostis spp. (Agrostis matsumurae, Agrostis palustris), Lolium spp. (Lolium), Festuca spp. (Festuca ovina L.), Zoysia spp. (Zoysiajaponica), Cynodon spp. (Cynodon dactylon/bermudagrass), Stenotaphrum secundatum (Stenotaphrum secundatum), Paspalum spp., Eremochloa ophiuroides (эремохлоя змеехвостная), Axonopus spp. (мутовчатка), Bouteloua dactyloides (бизонова трава), Bouteloua var. spp. (Bouteloua gracilis), Digitaria sanguinalis, Cyperusrotundus, Kyllingabrevifolia, Cyperusamuricus, Erigeron canadensis, Hydrocotylesibthorpioides, Kummerowiastriata, Euphorbia humifusa, Viola arvensis, Carex rigescens, Carex heterostachya, дерн; (15) древесные культуры: Pinus spp., Salix spp., Acer spp., Hibiscus spp., Eucalyptus spp., Ginkgo biloba, Bambusa sp., Populus spp., Prosopis spp., Quercus spp., Phoenix spp., Fagus spp., Ceiba pentandra, Cinnamomum spp., Corchorus spp., Phragmites australis, Physalis spp., Desmodium spp., Populus, Hedera helix, Populus tomentosa Carr, Viburnum odoratissinum, Ginkgo biloba L., Quercus, Ailanthus altissima, Schima superba, Ilex pur-purea, Platanus acerifolia, ligustrum lucidum, Buxus megistophylla Levl., Dahurian larch, Acacia mearnsii, Pinus massoniana, Pinus khasys, Pinus yunnanensis, Pinus finlaysoniana, Pinus tabuliformis, Pinus koraiensis, Juglans nigra, Citrus limon, Platanus acerifolia, Syzygium jambos, Davidia involucrate, Bombax malabarica L., Ceiba pentandra (L.), Bauhinia blakeana, Albizia saman, Albizzia julibrissin, Erythrina corallodendron, Erythrina indica, Magnolia gradiflora, Cycas revolute, Lagerstroemia indica, хвойные, макрофанерофиты, Frutex; (16) орехоплодные культуры: Bertholletia excelsea, Castanea spp., Corylus spp., Carya spp., Juglans spp., Pistacia vera, Anacardium occidentale, Macadamia (Macadamia integrifolia), Carya illinoensis Koch, Macadamia, Pistachio, Badam, другие растения, которые дают орехи; (17) другие: arabidopsis thaliana, Brachiaria eruciformis, Cenchrus echinatus, Setaria faberi, eleusine indica, Cadaba farinose, водоросли, Carex elata, декоративные растения, Carissa macrocarpa, Cynara spp., Daucus carota, Dioscorea spp., Erianthus sp., Festuca arundinacea, Hemerocallis fulva, Lotus spp., Luzula sylvatica, Medicago sativa, Melilotus spp., Morus nigra, Nicotiana spp., Olea spp., Ornithopus spp., Pastinaca sativa, Sambucus spp., Sinapis sp., Syzygium spp., Tripsacum dactyloides, Triticosecale rimpaui, Viola odorata и подобные.

В конкретном варианте осуществления, растение выбирают из риса, кукурузы, пшеницы, сои, подсолнечника, сорго, рапса, люцерны, хлопка, ячменя, проса, сахарного тростника, томатов, табака, маниоки, картофеля, сладкого картофеля, пекинской капусты, белокочанной капусты, огурца, китайской розы, Scindapsus aureus, арбуза, дыни, клубники, черники, винограда, яблока, цитрусовых, персика, груши, банана и т. д.

Используемый в настоящем документе термин «растение» включает целое растение и любое потомство, клетку, ткань или часть растения. Термин «часть растения» включает любую часть растения, включая, например, но не ограничиваясь ими: семена (включая зрелые семена, незрелые зародыши без семенной оболочки и незрелые семена); черенки растений; растительную клетку; культуру растительных клеток; орган растения (например, пыльцу, зародыш, цветок, плод, почку, лист, корень, стебель и родственный эксплантат). Тканью растения или органом растения могут быть семена, каллюсная ткань или любая другая популяция растительных клеток, организованная в структурную или функциональную единицу. Растительная клетка или культура ткани может регенерировать растение, имеющее физиологические и морфологические характеристики растения, из которого получены клетка или ткань, и может регенерировать растение, имеющее по существу тот же генотип, что и растение. Напротив, некоторые растительные клетки не могут регенерировать растения. Регенерируемые клетки в растительных клетках или культурах тканей могут представлять собой зародыши, протопласты, меристематические клетки, каллюс, пыльцу, листья, пыльники, корни, кончики корней, шелк, цветки, зерна, колосья, початки, шелуху или стебли.

Части растения включают собираемые части и части, которые можно использовать для размножения растений-потомков. Части растения, которые можно использовать для размножения, включают, например, но не ограничены ими: семена; плоды; черенки; рассаду; клубни; и подвои. Собираемыми частями растений могут быть любые полезные части растений, включая, например, но не ограничиваясь ими: цветы; пыльца; рассада; клубни; листья; стебли; плоды; семена; и корни.

Клетки растений являются структурными и физиологическими единицами растений. В настоящем документе, растительные клетки включают протопласты и протопласты с частичными клеточными стенками. Растительные клетки могут быть в форме выделенных одиночных клеток или клеточных агрегатов (например, рыхлого каллюса и культивируемых клеток) и могут быть частью тканевых единиц более высокого порядка (например, растительных тканей, органов растений и растений). Следовательно, растительные клетки могут быть протопластами, клетками, продуцирующими гаметы, или клетками или набором клеток, способных регенерировать целое растение. Следовательно, в вариантах осуществления настоящего изобретения семя, содержащее множество растительных клеток и способное регенерировать в целое растение, рассматривается как «часть растения».

Используемый в настоящем документе термин «протопласт» относится к растительной клетке, у которой полностью или частично удалена клеточная стенка и открыта жировая двухслойная мембрана. Как правило, протопластом является выделенная растительная клетка без клеточной стенки, которая может регенерировать клеточную культуру или целое растение.

«Потомство» растения включает любые последующие поколения растения.

Термин «бактерии» означает всех прокариотов, включая все организмы царства Procaryotae. Термин «бактерия» включает все микроорганизмы, считающиеся бактериями, включая Mycoplasma, Chlamydia, Actinomyces, Streptomyce и Rickettsia. В это определение включены все формы бактерий, включая кокки, бациллы, спириллы, сферопласты, протопласты и т. д. Этот термин также включает прокариоты, которые являются грамотрицательными или грамположительными. «Грамотрицательный» и «грамположительный» означают картину окрашивания с использованием методов окрашивания по Граму, хорошо известных в данной области техники (см., например, Finegold and Martin, Diagnostic Microbiology, 6th Ed., CV Mosby St. Louis, pp. 13-15 [1982]). «Грамположительными бактериями» являются бактерии, которые могут сохранять исходный краситель, используемый для окрашивания по Граму, в результате чего окрашенные клетки под микроскопом имеют цвет от темно-синего до пурпурного. «Грамотрицательные бактерии» не сохраняют первоначальный краситель, используемый для окрашивания по Граму, но могут быть окрашены контр-окрашиванием. Поэтому грамотрицательные бактерии окрашивают в красный цвет после реакции окрашивания по Граму.

Используемый в настоящем документе термин «грибы» относится к эукариотическим организмам, таким как плесень и дрожжи, включая диморфные грибы.

Термины «толерантность к гербицидам» и «резистентность к гербицидам» могут использоваться взаимозаменяемо, и оба относятся к толерантности к гербицидам и резистентности к гербицидам. «Улучшение толерантности к гербицидам» и «улучшение резистентности к гербицидам» означают, что толерантность или резистентность к гербицидам улучшаются по сравнению с растением, содержащим ген дикого типа.

Термин «дикий тип» относится к молекуле нуклеиновой кислоты или белку, которые можно найти в природе.

В настоящем изобретении термин «участок культивирования» включает участок, где выращивают растение по настоящему изобретению, такой как почва, а также включает, например, семена растений, рассаду растений и выращенные растения. Термин «эффективное для борьбы с сорняками количество» относится к количеству гербицида, достаточному для воздействия на рост или развитие сорняка-мишени, например, для предотвращения или ингибирования роста или развития сорняка-мишени, или для уничтожения сорняка. Предпочтительно, эффективное для борьбы с сорняками количество не оказывает существенного влияния на рост и/или развитие семян растений, рассады растений или растений по настоящему изобретению. Специалисты в данной области техники могут определить такое эффективное количество для борьбы с сорняками с помощью обычных экспериментов.

Термин «ДНК-мишень», используемый в настоящем документе, относится к полинуклеотиду ДНК, содержащему «сайт-мишень» или «последовательность-мишень».

Термин «лизис» означает расщепление ковалентного остова молекулы ДНК. Лизис можно инициировать различными способами, включая, но не ограничиваясь ими, ферментативный или химический гидролиз фосфодиэфирных связей. Возможен и одноцепочечный, и двухцепочечный лизис, и двухцепочечный лизис может происходить из-за двух отдельных событий одноцепочечного лизиса. Лизис ДНК может привести к тупым или смещенным концам. В некоторых вариантах осуществления, для таргетного лизиса двухцепочечной ДНК используют комплекс, содержащий РНК, таргетирующую ДНК, и сайт-специфической полипептид модификации используют для таргетного лизиса двухцепочечной ДНК.

Термин «ген» включает фрагмент нуклеиновой кислоты, экспрессирующий функциональную молекулу (такую, как, но не ограниченную ими, специфичный белок), включая регуляторные последовательности до (5' не кодирующие последовательности) и после (3' не кодирующие последовательности) кодирующей последовательности.

Последовательностью ДНК, которая «кодирует» конкретную РНК, является последовательность нуклеиновой кислоты ДНК, которая может быть транскрибирована в РНК. Полинуклеотиды ДНК могут кодировать РНК (mРНК), которая может быть транслирована в белок, или полинуклеотиды ДНК могут кодировать РНК, которая не может быть транслирована в белок (например, tРНК, rРНК или ДНК-таргетную РНК; которые также известна как «не кодирующая» РНК или «ncРНК»).

Термины «полипептид», «пептид» и «белок» используются в настоящем изобретении взаимозаменяемо и относятся к полимеру аминокислотных остатков. Эти термины применяют к аминокислотным полимерам, в которых один или несколько аминокислотных остатков являются искусственными химическими аналогами соответствующих и встречающихся в природе аминокислот, а также к полимерам аминокислот природного происхождения. Термины «полипептид», «пептид», «аминокислотная последовательность» и «белок» могут также включать их формы модификации, включая, но не ограничиваясь ими, гликозилирование, липидную связь, сульфатирование, γ-карбоксилирование остатка глутаминовой кислоты, гидроксилирование и ADP-рибозилирование.

Термин «биологически активный фрагмент» относится к фрагменту, который имеет один или несколько аминокислотных остатков, удаленных с N- и/или C-конца белка, при этом сохраняющему свою функциональную активность.

Для терминов, связанных с аминокислотной заменой, используемых в описании, первая буква представляет встречающуюся в природе аминокислоту в определенном положении в определенной последовательности, следующее число представляет положение в соответствующей последовательности, и вторая буква представляет другую аминокислоту для замены встречающейся в природе аминокислоты. Например, W574L означает, что триптофан в положении 574 заменен лейцином. Для двойных или множественных мутаций каждая мутация отделяется знаком «/».

Термины «полинуклеотид» и «нуклеиновая кислота» используются взаимозаменяемо и включают ДНК, РНК или их гибриды, которые могут быть двухцепочечными или одноцепочечными.

Термины «нуклеотидная последовательность» и «последовательность нуклеиновой кислоты» относятся к последовательности оснований в ДНК или РНК.

Используемые в настоящем изобретении термины «кассета экспрессии», «вектор экспрессии» и «конструкция экспрессии» относятся к вектору, такому как рекомбинантный вектор, подходящему для экспрессии представляющей интерес нуклеотидной последовательности в растении. Термин «экспрессия» относится к продуцированию функционального продукта. Например, экспрессия нуклеотидной последовательности может относиться к транскрипции нуклеотидной последовательности (такой как транскрипция для получения mРНК или функциональной РНК) и/или трансляции РНК в предшественник или зрелый белок.

«Конструкцией экспрессии» по настоящему изобретению может быть фрагмент линейной нуклеиновой кислоты, кольцевая плазмида, вирусный вектор или, в некоторых вариантах осуществления, может быть РНК (такая как mРНК), которая может быть транслирована.

«Конструкция экспрессии» по настоящему изобретению может содержать представляющие интерес регуляторные последовательности и нуклеотидные последовательности из разных источников, или представляющие интерес регуляторные последовательности и нуклеотидные последовательности из одного и того же источника, но расположенные иначе, чем обычно встречающиеся в природе.

Термины «рекомбинантный вектор экспрессии» или «конструкция ДНК» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к молекуле ДНК, содержащей вектор и, по меньшей мере, одну вставку. Рекомбинантные векторы экспрессии обычно получают с целью экспрессии и/или размножения вставки или для конструирования других рекомбинантных нуклеотидных последовательностей. Вставка может быть функционально или не функционально связана с промоторной последовательностью, и может быть функционально или не функционально связана с регуляторной последовательностью ДНК.

Термины «регуляторная последовательность» и «регуляторный элемент» могут использоваться взаимозаменяемо и относятся к нуклеотидной последовательности, расположенной выше (5' не кодирующая последовательность), в середине или ниже (3' не кодирующая последовательность) кодирующей последовательности, и влияет на транскрипцию, процессинг РНК, стабильность или трансляцию родственной кодирующей последовательности. Регуляторные элементы экспрессии растений относятся к нуклеотидным последовательностям, которые могут контролировать транскрипцию, процессинг РНК или стабильность или трансляцию представляющей интерес нуклеотидной последовательности в растениях.

Регуляторные последовательности могут включать, но не ограничены ими, промоторы, лидерные последовательности трансляции, интроны и последовательности распознавания поли А.

Термин «промотор» относится к фрагменту нуклеиновой кислоты, способному контролировать транскрипцию другого фрагмента нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, промотором является промотор, способный контролировать транскрипцию гена в растительных клетках, независимо от того, происходит ли он из растительных клеток. Промотор может быть конститутивным промотором, или тканеспецифическим промотором, или промотором, регулируемым развитием, или индуцируемым промотором.

Термин «конститутивный промотор» относится к промотору, который обычно вызывает экспрессию гена в большинстве типов клеток в большинстве случаев. «Тканеспецифический промотор» и «тканепредпочтительный промотор» используются взаимозаменяемо и относятся к промотору, который в основном, но не обязательно исключительно, экспрессируется в ткани или органе, а также экспрессируется в конкретной клетке или типе клеток. «Промотор, регулируемый развитием» относится к промотору, активность которого определяется событием развития. «Индуцируемый промотор» отвечает на эндогенный или экзогенный стимул (окружающую среду, гормон, химический сигнал и т.д.) для селективной экспрессии функционально связанной последовательности ДНК.

Используемый в настоящем документе термин «функционально связанный» относится к соединению регуляторного элемента (например, но не ограничиваясь ими, последовательности промотора, последовательности терминации транскрипции и т.д.) с последовательностью нуклеиновой кислоты (например, кодирующей последовательностью или открытой рамкой считывания), так что транскрипция нуклеотидной последовательности контролируется и регулируется регуляторным элементом транскрипции. Методы функционального связывания области регуляторного элемента с молекулой нуклеиновой кислоты известны в данной области техники.

«Введение» молекулы нуклеиновой кислоты (такой как плазмида, линейный фрагмент нуклеиновой кислоты, РНК и т.д.) или белка в растение относится к трансформации клетки растения нуклеиновой кислотой или белком таким образом, чтобы нуклеиновая кислота или белок могли функционировать в растительной клетке. Термин «трансформация», используемый в настоящем изобретении, включает стабильную трансформацию и кратковременную трансформацию.

Термин «стабильная трансформация» относится к тому, что введение экзогенной нуклеотидной последовательности в геном растения приводит к стабильному наследованию экзогенного гена. После стабильной трансформации последовательность экзогенной нуклеиновой кислоты стабильно интегрируется в геном растения и любых его последующих поколений.

Термин «временная трансформация» относится к тому, что введение молекулы нуклеиновой кислоты или белка в растительную клетку для выполнения функции не приводит к стабильному наследованию чужеродного гена. При временной трансформации последовательность экзогенной нуклеиновой кислоты не интегрируется в геном растения.

Если не указано иное, все используемые в настоящем документе технические и научные термины имеют те же значения, которые обычно понимаются специалистами в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Хотя любые способы и материалы, подобные или эквивалентные описанным в настоящем документе, также могут быть использованы при практическом применении или тестировании настоящего изобретения, теперь описаны предпочтительные способы и материалы.

Все публикации и патенты, цитируемые в этом описании, включены в настоящее описание посредством ссылки, как если бы каждая отдельная публикация или патент были точно и индивидуально указаны для включения посредством ссылки, и включены в настоящее описание посредством ссылки для раскрытия и описания методов и/или материалов, связанных с цитированными публикациями. Ссылка на любую публикацию, которая была опубликована до даты подачи заявки, не должна интерпретироваться как признание того, что настоящее изобретение не может предшествовать публикациям существующего изобретения. Кроме того, указанная дата публикации может отличаться от фактической даты публикации, что может потребовать независимой проверки.

Если специально не указано или не подразумевается, используемые в настоящем документе термины «а», «а/an» и «the» означают «по меньшей мере, один». Все патенты, патентные заявки и публикации, упомянутые или цитируемые в данном документе, включены в настоящий документ посредством ссылки во всей их полноте с той же степенью цитирования, как если бы они цитировались по отдельности.

Краткое описание чертежей

На фигуре 1 показана схематическая диаграмма способа получения новых мутаций в организмах по настоящему изобретению. На фигуре в качестве примера взят только Cas9 с NGG в качестве PAM; таким же образом можно использовать и другие варианты Cas9 с другим PAM (например, NG).

На фигуре 2 показана схема дизайна gРНК в сайтах W574 и S653 гена ALS Arabidopsis thaliana.

На фигуре 3 показано Т2 поколение Arabidopsis thaliana резистентных к гербициду штаммов, трансформированных двумя различными запрограммированными векторами последовательного разрезания/редактирования. pQY743 и pQY745 являются номерами векторов. Резистентные штаммы были способны нормально укореняться, но Col-0 дикого типа и не резистентные устойчивые штаммы не способны.

На фигуре 4 представлена диаграмма пиков секвенирования гена ALS штамма T2 поколения Arabidopsis thaliana, резистентного к имазапику, в котором T, обозначенный стрелкой, мутирован из G, что приводит к мутации W574L.

На фигуре 5 показан дизайн запрограммированной схемы последовательного разрезания/редактирования в сайте W574 гена ALS Arabidopsis thaliana. Последовательность Т-ДНК экспрессирует четыре гена, sgРНК1, sgРНК2, Cas9 и HygR. Среди них, sgРНК1 и Cas9 образуют комплекс, который разрезает кодон W574 ALS в геноме и, как ожидается, образует -G генотип посредством клеточной спонтанной репарации. Эта новая последовательность может быть распознана и разрезана комплексом, образованным sgРНК2 и Cas9, и формирует +T генотип посредством спонтанной клеточной репарации, приводящей к W574L.

На фигуре 6 показаны резистентная рассада Arabidopsis thaliana, после скрининга имазапиком и результаты секвенирования сайта ALS W574.

На фигуре 7 показан дизайн запрограммированной схемы последовательного разрезания/редактирования в сайте S653 гена ALS Arabidopsis thaliana. Последовательность Т-ДНК экспрессирует четыре гена, sgРНК1, sgРНК2, Cas9 и HygR. Среди них sgРНК1 и Cas9 образуют комплекс, разрезающий кодон S653 ALS в геноме. После спонтанной клеточной репарации формируется -G генотип. Эта последовательность может быть распознана и разрезана комплексом, образованным sgРНК2 и Cas9. После спонтанной клеточной репарации формируется +A генотип с получением S653N.

На фигуре 8 показана резистентная рассада Arabidopsis thaliana после скрининга имазапиком и результаты секвенирования сайта ALS S653. На левой панели показаны результаты скрининга резистентной рассады и доля резистентной рассады, и на правой панели показана диаграмма пиков секвенирования и типа мутации сайта S653.

На фигуре 9 показан дизайн запрограммированной схемы последовательного разрезания/редактирования в сайте W574 гена ALS Arabidopsis thaliana. Последовательность Т-ДНК экспрессирует четыре гена, sgРНК1, sgРНК2, Cas9 и HygR. Среди них sgРНК1 и Cas9 образуют комплекс, разрезающий кодон W574 ALS в геноме. После клеточной спонтанной репарации формируется +А генотип. Эта последовательность может быть распознана и разрезана комплексом, образованным sgРНК2 и Cas9. После спонтанной клеточной репарации формируется -G генотип с получением W574M. Для двух разрезов используют разные сайты PAM.

На фигуре 10 показан дизайн запрограммированной схемы последовательного разрезания/редактирования в сайте W2038 гена ACCase2 Oryza sativa. Этот сайт соответствует сайту W2027 гена ACCase2 Alopecurus myosuroides. Последовательность Т-ДНК экспрессирует четыре гена, sgРНК1, sgРНК2, Cas9 и HygR. Среди них sgРНК1 и Cas9 образуют комплекс, разрезающий кодон W2038 АССазы в геноме. Генотип A-G формируется после спонтанной клеточной репарации. Эта последовательность может быть распознана и разрезана комплексом, образованным sgРНК2 и Cas9. После клеточного спонтанного восстановления формируется +T генотип с получением W2038L.

На фигуре 11 показан резистентный каллюс Oryza sativa, подвергнутый совместному скринингу с гигромицином (50 мкг/л) и квизалофопом-р (50 мкг/л), и результаты секвенирования сайта W2038.

На фигуре 12 показана диаграмма электрофореза в полиакриламидном геле белков SpCas9 и NGA-Cas9, которые получены с помощью прокариотической экспрессии и очищены. Полоса, указанная стрелкой, является полосой белка Cas9.

На фигуре 13 показана in vitro активность разрезания очищенного белка Cas9 на фрагментах ДНК, содержащих сайт-мишень OsALS W548 и сайт-мишень OsACCase2 W2038, которые были обнаружены электрофорезом в агарозном геле, и можно увидеть, что только когда белок Cas9 и фрагмент sgРНК были добавлены одновременно, фрагменты ДНК можно было разрезать до ожидаемого размера.

На фигуре 14 показана диаграмма пиков секвенирования сайта-мишени OsALS W548 RNP-трансформированных протопластов Oryza sativa, и этот сайт соответствует сайту ALS W574 Arabidopsis thaliana. В месте, указанном стрелкой, в дополнение к исходному сигнальному пику G основания, имеется сигнальный пик T основания, полученный путем мутации, которая привела к мутации W548L.

На фигуре 15 показан резистентный каллюс Oryza sativa, отредактированный RNP на сайте OsACCase2 W2038 и подвергнутый скринингу с 50 мкг/л квизалофопа-p. Стрелка указывает на резистентный каллюс.

На фигуре 16 представлена диаграмма пиков секвенирования сайта-мишени OsACCase2 W2038 рассады Oryza sativa, дифференцированных из резистентного каллюса. Т, указанный стрелкой, мутирован из G, что приводит к мутации W2038L.

На фигуре 17 показан тест на резистентность рассады поколения T1, отредактированных OsACCase2 W2038L, к Галоксифопу-p. Слева направо: рассада № 1 показывает результаты контрольной обработки водой дикого типа Huaidao № 5 (сорт риса), и рассада № 2-4 показывает результаты дикого типа Huaidao No.5 и двух трансформированных RNP генной пушкой W2038L T1 поколения отредактированных штаммов QY367-7-12 и QY367-7-18, все которые обработаны 5 г/му активного ингредиента Галоксифоп-p (му, единица площади, 1 му=1/15 гектара). Очевидно, что у отредактированного штамма развилась резистентность к Галоксифопу-p.

На фигуре 18 показан тест на резистентность рассады поколения T1 обработанных OsACCase2 W2038L к квизалохоп-p. Слева направо: рассада № 1 показывает результаты контрольной обработки водой дикого типа Huaidao № 5, и рассада № 2-4 показывает результаты дикого типа Huaidao No.5 и двух трансформированных RNP генной пушкой W2038L T1 поколения отредактированных штаммов QY367-5-10 и QY367-5-21, все которые обработаны 5 г/му активного ингредиента квизалохопа-p. Очевидно, что у отредактированного штамма развилась резистентность к квизалохопу-p.

На фигуре 19 показан резистентный каллюс Oryza sativa, отредактированный RNP одновременно на сайте OsACCase2 W2038 и гене OsBADH2 и подвергнутый скринингу с использованием 50 мкг/л квизалофоп-p. Стрелка указывает на резистентный каллюс.

На фигуре 20 представлена диаграмма пиков секвенирования сайта-мишени OsACCase2 W2038 поколения T0 отредактированной на двойном сайте рассады. Т, указанный стрелкой, мутирован из G, что дает мутацию W2038L.

На фигуре 21 показана диаграмма пиков секвенирования сайта-мишени OsBADH2 поколения T0 отредактированной на двойном сайте рассады. +А гомозиготная мутация имеет место в точке, указанной стрелкой.

На фигуре 22 показан резистентный каллюс Oryza sativa, отредактированный RNP одновременно на сайте OsALS W548 и гене OsSWEET14, и подвергнутый скринингу с 5 мг/л пироксулама. Стрелка указывает на резистентный каллюс.

На фигуре 23 показана диаграмма пиков секвенирования сайта-мишени OsALS W548 поколения T0 отредактированной на двойном сайте рассады. Сигнальные пики обоих оснований G и T присутствуют в месте, указанном стрелкой, что дает мутацию W548L.

На фигуре 24 показана диаграмма пиков секвенирования сайта-мишени OsSWEET14 поколения T0 отредактированной на двойном сайте рассады. -С гомозиготная мутация имеет место в точке, указанном стрелкой.

На фигуре 25 показан тест резистентности рассады поколения T1 отредактированной на сайте OsALS W548 и двойном сайте OsSWEET14 рассады, к никосульфурону. Слева направо: рассада № 1 показывает результаты контрольной обработки водой Huaidao № 5 дикого типа, и рассада № 2-3 показывает результаты Huaidao No.5 дикого типа и трансформированного RNP генной пушкой поколения T1 W548L отредактированного штамма QY360-7-11, оба которых обработаны 4 г/му активного ингредиента никосульфурона. Видно, что у отредактированного штамма развилась резистентность к никосульфурону.

На фигуре 26 показан тест резистентности рассады поколения T1 отредактированной на сайте OsALS W548 и двойном сайте OsSWEET14 рассады к флукарбазону-Na. Слева направо: рассада № 1 показывает результаты контрольной обработки водой Huaidao № 5 дикого типа, и рассада № 2-3 показывает результаты Huaidao No.5 дикого типа и трансформированного RNP генной пушкой поколения T1 W548L отредактированного штамма QY360-7-9, оба которых обработаны 2 г/му активного ингредиента флукарбазона-Na. Видно, что у отредактированного штамма развилась резистентность к флукарбазону-Na.

На фигуре 27 показан тест резистентности рассады поколения T1 отредактированной на сайте OsALS W548 и двойном сайте OsSWEET14 рассады, к имазапику. Слева направо: рассада № 1 показывает результаты контрольной обработки водой Huaidao № 5 дикого типа, и рассада № 2-3 показывает результаты Huaidao No.5 дикого типа и трансформированного RNP генной пушкой поколения T1 W548L отредактированного штамма QY360-7-11, оба которых обработаны 7 г/му активного ингредиента имазапика. Видно, что у отредактированного штамма развилась резистентность к имазапику.

На фигуре 28 показан тест резистентности рассады поколения T1 отредактированной на сайте OsALS W548 и двойном сайте OsSWEET14 рассады, к пироксуламу. Слева направо: рассада № 1 показывает результаты контрольной обработки водой Huaidao № 5 дикого типа, и рассада № 2-4 показывает результаты Huaidao No.5 дикого типа и трансформированного RNP генной пушкой поколения T1 W548L отредактированных штаммов QY360-7-2 и QY360-7-11, все которые обработаны 2 г/му активного ингредиента пироксулама. Видно, что у отредактированного штамма развилась резистентность к пироксуламу.

На фиг. 29 показана схема запрограммированного последовательного разрезания/редактирования гена HBB в клетках 293T. А. Показан дизайн сайтов гена HBB для запрограммированного последовательного разрезания/редактирования в клетках 293T; B. Эффективность преобразования запрограммированного последовательного разрезания/редактирования гена HBB в клетках 293T после 48 часов трансформации каждого вектора редактирования; C. Соотношение типов редактирования генов, полученных из запрограммированного последовательного разрезания/редактирования гена HBB и разрезания/редактирования одного сайта гена HBB в клетках 293T; WT: дикий тип, indel: генотип для делеции или вставки, C->T SNP: генотип с заменой основания C на T при разрезании.

Описание списка последовательностей

Основные последовательности, задействованные в настоящем изобретении, суммированы следующим образом, и родственные последовательности представлены в списке последовательностей.

SEQ ID NO: Описание последовательности 1 Аминокислотная последовательность белка ALS из Arabidopsis thaliana 2 Последовательность ДНК гена ALS из Arabidopsis thaliana 3 Аминокислотная последовательность белка AmACCase из Alopecurus myosuroides 4 Последовательность ДНК гена AmACCase из Alopecurus myosuroides 5 Аминокислотная последовательность белка OsHPPD из Oryza sativa 6 Последовательность геномной ДНК белка OsHPPD из Oryza sativa 7 Аминокислотная последовательность белка OsPPO1 из Oryza sativa 8 Последовательность геномной ДНК белка OsPPO1 из Oryza sativa 9 Аминокислотная последовательность белка OsTIR1 из Oryza sativa 10 Последовательность геномной ДНК белка OsTIR1 из Oryza sativa 11 Аминокислотная последовательность белка ALS из Oryza sativa 12 Последовательность ДНК гена ALS из Oryza sativa 13 Аминокислотная последовательность белка ACCase2 из Oryza sativa 14 Последовательность геномной ДНК ACCase2 из Oryza sativa 15 Последовательность ДНК белка SpCas9, оптимизированная растительным кодоном 16 Последовательность ДНК белка NGA-Cas9, оптимизированная растительным кодоном 17 Последовательность геномной ДНК OsBADH2 из Oryza sativa 18 Последовательность геномной ДНК OsSWEET14 из Oryza sativa 19 Аминокислотная последовательность белка StALS2 картофеля (Solanum tuberosum L.) 20 Последовательность ДНК гена StALS2 картофеля (Solanum tuberosum L.) 21 Последовательность ДНК гена HBB (бета-субъединица гемоглобина) в эмбриональной клетке почки человека 293T 22 Последовательность CDS гена HBB в эмбриональной клетке почки человека 293T 23 Аминокислотная последовательность гена HBB в клетке почки эмбриона человека 293T

Варианты осуществления изобретения

Настоящее изобретение будет дополнительно объяснено в связи со следующими примерами. Следующие примеры проиллюстрированы посредством примеров, но объем правовой охраны настоящего изобретения не должен ограничиваться этими примерами. Экспериментальные способы в следующих примерах, если не указано иное, представляют собой способы, описанные в широко используемых руководствах по молекулярной биологии, технологии культуры тканей и агрономии. Например, конкретные стадии можно найти в: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd edition)" (Sambrook, J., Russell, David W., 2001, Cold Spring Harbor), "Plant Propagation by Tissue Culture" (Edwin F. George , Michael A. Hall, Geert-Jan De Klerk, 2008, Springer). Материалы, реагенты, инструменты и т.д., используемые в следующих примерах, могут быть получены из коммерческих источников, если не указано иное.

Пример 1: Создание предсказуемых замен оснований, введенных запрограммированным последовательным разрезанием/редактированием для сайтов W574 и S653 гена ALS Arabidopsis thaliana

А. Экспериментальные материалы

1. Материал Arabidopsis thaliana

Arabidopsis thaliana дикого типа Col-0 является модельным сортом двудольного растения, его оригинальные семена предоставлены Department of Weeds, College of Plant Protection, China Agricultural University, и их размножение и сохранение проводят в нашей лаборатории в соответствии со стандартными способами в этой области техники.

2. Векторы

Векторные плазмиды pCBC-dT1T2 (Xing HL, Dong L, Wang ZP, Zhang HY, Han CY, Liu B, Wang XC, Chen QJ 2014. A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants. BMC Plant Biol. Nov 29;14(1):327. Более подробно см. в https://www.addgene.org/50590/), pHEE401E (см. Wang ZP, Xing HL, Dong L, Zhang HY, Han CY, Wang XC, Chen QJ Genome Biol. 2015 Jul 21; 16:144. doi: 10.1186/s13059-015-0715-0. Конкретную информацию см. в https://www.addgene.org/71287/) и pHEE401E-NG (мутацию, описанную в Nishimasu et al. 2018 Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded Targeting space. Science 361(6408):1259-1262. doi: 10.1126/science.aas9129, введенную в pHEE401E для создания вектора pHEE401E-NG, способного распознавать NG PAM), приобретают на веб-сайте Addgene или создают в нашей лаборатории в соответствии с обычными способами молекулярной биологии и хранят в нашей лаборатории.

3. Основное оборудование

Капельная пушка, водяная баня, прибор для ПЦР (Bio-rad T100), прибор для электрофореза (WIX-EP600), аппарат для визуализации на геле, электрическая взрывная сушилка, центрифуга (Eppendorf 5424R), высокопроизводительный lyser (не нашла адекватный перевод) тканей, шейкер, электронные весы, рН метр, и т.д.

4. Основные реагенты

ДНК полимераза с высокой точностью (приобретается у Tsingke Bio), набор для восстановления из агарозного геля и набор для выделения плазмид (приобретен у Sparkjade), BsaI и T4 ДНК лигазы (приобретены у NEB), Trans5α-компетентные клетки и EHA105-компетентные клетки (приобретены у TransGen Biotech, Beijing, China), GV3101 Agrobacterium-компетентные клетки (приобретены у Shanghai AngyuBio), Tris, EDTA, канамицин, цефалоспорин, гигромицин, агароза, порошковые дрожжи, триптон, NaCl (приобретен у Sangon Biotech), порошок MS, сахароза, Silwet-77, гигромицин (приобретен у Solarbio), краситель нуклеиновой кислоты (Dured), абсолютный этанол (приобретен у Sinopharm) и т. д.

5. Приготовление основных растворов

1) Дезинфицирующее средство для семян: 4 мл 10% SDS, 20 мл NaClO, добавляют воду до объема 200 мл.

2) Буфер для экстракции SDS: 40 мл 1M Tris⋅HCl (pH 8,0), 50 мл 0,1M EDTA, 10 мл 5M NaCl, 10 мл 10% SDS, добавляют воду до объема 200 мл.

3) Инфекционный раствор: 1,5 г сахарозы, 9 мкл Silwet-77, с добавлением 30 мл сверхчистой воды.

4) Твердая среда LB: 5 г порошковых дрожжей, 10 г триптона, 10 г NaCl, 15 г агара, добавляют воду до 1 л, стерилизуют при 121°C в течение 15 минут, выливают на планшет для последующего использования.

5) 50× исходный раствор TAE: 242 г Tris, 37,2 г Na₂EDTA⋅2H₂O, добавляют 800 мл ультрачистой воды, хорошо перемешивают до растворения, добавляют 57,1 мл уксусной кислоты, хорошо перемешивают, наконец разбавляют до 1 л деионизированной водой и хранят при комнатной температуре.

6) Твердая среда MS: взвешивают 4,42 г порошка MS и 10 г сахарозы, добавляют 800 мл сверхчистой воды, доводят pH до 5,8, добавляют воду до объема 1 л, добавляют 10 г фитагеля, стерилизуют при 121°C в течение 15 минут и выливают на планшет для последующего использования.

B. Способы эксперимента

1. Дизайн и конструирование вектора двойной мишени CRISPR/Cas9

1.1 Дизайн мишени

Последовательность гена ALS Arabidopsis thaliana представлена в SEQ ID NO: 2. Последовательность-мишень gРНК1 (5'-GCATGGTTATGCAATGGGA-3') из 19 оснований конструируют с использованием AGA рядом с сайтом ALS574 Arabidopsis thaliana в качестве PAM, по прогнозу, одно основание G будет удалено между первыми 3-4 сайтами PAM после редактирования, затем на основе последовательности, созданной при удалении, конструируют вторую последовательность-мишень gРНК2 (5'-GGCATGGTTATGCAATGGA-3'), и по прогнозу одно основание T будет вставлено посредством второго редактирования, тем самым осуществляя превращение TGG-TTG, как показано на фигуре 2.

Аналогично, последовательность-мишень gРНК3 (5'-TGCCGATGATCCCGAGTGG-3') из 19 оснований конструируют с использованием TGG рядом с сайтом ALS653 Arabidopsis thaliana в качестве PAM, по прогнозу одно основание G будет удалено между первыми 3-4 положениями PAM после редактирования, затем конструируют вторую последовательность-мишень gРНК4 (5'-TTGCCGATGATCCCGATGG-3') на основе последовательности, созданной в результате делеции, и по прогнозу одно основание А будет вставлено после второго редактирования, тем самым осуществляя превращение AGT-AAT, как показано на фигуре 2.

1.2 Векторная конструкция

Используют способ, описанный Xing HL, Dong L, Wang ZP, Zhang HY, Han CY, Liu B, Wang XC, Chen QJ 2014. A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants. BMC Plant Biol. Nov 29;14(1): 327. В частности, плазмиду dT1T2 используют в качестве матрицы для амплификации ALS574 и 653 сайтов фрагмента с двумя мишенями, соответственно, для конструирования кассеты экспрессии sgРНК. Векторные скелеты pHEE401E и pHEE401E-NG переваривают BsaI, полосы вырезают из геля и восстанавливают, и фрагмент-мишень непосредственно используют для реакции лигирования после перевара. Т4 ДНК лигазу используют для лигирования скелета вектора и фрагмента-мишени, продукты лигирования превращают в Trans5α-компетентные клетки, разные моноклоны отбирают для секвенирования. После подтверждения с помощью секвенирования, набор Sparkjade High Purity Plasmid Mini Extraction Kit используют для экстракции плазмид с получением рекомбинантных плазмид, которые были соответственно называют как pQY743 и pQY745.

2. Дизайн праймеров для обнаружения мишеней

Праймеры для обнаружения мишени берут сайты-мишени ALS574 и ALS653 в качестве центров, где праймер для восходящего обнаружения находится примерно в 100 п.н. от сайта-мишени ALS574, и праймер для нисходящего обнаружения находится примерно в 280 п.н. от сайта-мишени ALS653. Последовательности праймеров следующие: 574/653checking-F: 5'ATTGACGGAGATGGAAGCTT3' и 574/653checking-R: 5'CCAAACTGAGCCAGTCACAA3'.

3. Получение системы генетической трансформации Arabidopsis thaliana

3.1 Трансформация Agrobacterium

Сконструированные рекомбинантные плазмиды трансформируют в Agrobacterium GV3101-компетентные клетки для получения рекомбинантных клеток Agrobacterium.

3.2 Приготовление инфекционного раствора Agrobacterium

1) Активированные Agrobacterium собирают и инокулируют в 30 мл жидкой среды YEP (содержащей 25 мг/л Rif и 50 мг/л Kan) и культивируют при встряхивании при 200 об/мин и 28°С в течение ночи до значения OD600, равного примерно 1,0-1,5.

2) После центрифугирования при 6000 об/мин в течение 10 минут собирают Agrobacterium и отбрасывают супернатант.

3) Agrobacterium ресуспендируют в инфекционном растворе (нет необходимости регулировать pH) до OD600=0,8 для последующего использования.

3.3 Трансформация Arabidopsis thaliana

1) Перед трансформацией растения обращают внимание на то, хорошо ли росло растение, было ли пышно соцветие, не было ли реакции на стресс. Первую трансформацию проводят, когда высота растения составляет около 20 см. Полив осуществляют должным образом, когда почва высыхает. Выросшие стручки срезают ножницами за день до трансформации.

2) Соцветие трансформируемого растения погружают в вышеуказанный раствор на период от 30 секунд до 1 минуты при осторожном перемешивании, при этом на инфильтрированном растении должен быть слой жидкой мембраны.

3) После завершения трансформации растение культивируют в темноте в течение 24 часов, и затем вынимают и помещают в нормальную световую среду для роста.

4) Через неделю таким же образом можно провести вторую трансформацию.

3.4 Сбор семян

После созревания семян их собирают. После сбора семена повторно сушат в печи при 37°С в течение примерно одной недели.

4. Выбор трансгенного растения

Семена обрабатывают дезинфицирующим средством в течение 5 минут, 5 раз промывают деионизированной водой и равномерно распределяют на селекционной среде MS (содержащей 30 мкг/мл гигромицина, 100 мкг/мл цефалоспорина), среду помещают в световой инкубатор (температура 22°, 16 часов света, 8 часов темноты, интенсивность света 100-150 мкмоль/м²/с, влажность 75%), и через неделю положительную рассаду отбирают и пересаживают в почву.

5. Обнаружение мутантных растений T1

5.1 Экстракция геномной ДНК

1) Листья Arabidopsis thaliana срезают и помещают в 2 мл центрифужную пробирку, добавляют стальные шарики, и листья измельчают с помощью высокопроизводительного lyser ткани.

2) После завершения измельчения добавляют 400 мкл буфера для экстракции SDS, перемешивают перевертыванием и инкубируют на водяной бане при 65° в течение 15 минут и перемешивают перевертыванием каждые 5 минут.

3) Центрифугирование проводят при 13000 об/мин в течение 5 минут.

4) 300 мкл супернатанта отбирают пипеткой и переносят в новую 1,5 мл центрифужную пробирку, в центрифужную пробирку добавляют равный объем изопропанола, предварительно охлажденного до -20°С, и центрифужную пробирку выдерживают при -20°С в течение 1 часа или в течение ночи.

5) Центрифугирование проводят при 13000 об/мин в течение 10 минут, и супернатант отбрасывают.

6) В центрифужную пробирку добавляют 500 мкл 70% этанола для промывки лепешки, промывочный раствор удаляют после центрифугирования (будьте осторожны, чтобы не выбросить лепешку), сушат при комнатной температуре, добавляют 30 мкл сверхчистой воды для растворения ДНК, и ДНК хранят при -20°С.

5.2 ПЦР амплификация

Извлеченный геном растения T1 используют в качестве матрицы, определяющие праймеры используют для амплификации фрагмента-мишени, 5 мкл амплифицированного продукта отбирают пипеткой и определяют с помощью электрофореза в 1% агарозном геле, и визуализируют с помощью аппарата для визуализации на геле. Оставшийся продукт доставляют в компанию, занимающуюся секвенированием, для непосредственного проведения секвенирования.

6. Обнаружение мутантного растения Т2

После сбора семян штамма T1 с одного растения, выбирают семена разных штаммов двух векторов и высевают на среду для селекции с имазапиком (среда MS+0,24 мкг/мл имазапика) для проведения селекции, и положительную рассаду пересаживают в почву через неделю и подвергают молекулярному обнаружению, где способ такой же, как на стадии 5.

Используемые праймеры и их последовательности :

Наименование праймера Последовательность (5'-3') ALS574-F ATATATGGTCTCGATTGGCATGGTTATGCAATGGGAGTTTTAGAGCTAGAAATA ALS574-R ATTATTGGTCTCGAAACTCCATTGCATAACCATGCCCAATCTCTTAGTCGACTC ALS653-F ATATATGGTCTCGATTGTGCCGATGATCCCGAGTGGGTTTTAGAGCTAGAAATA ALS653-R ATTATTGGTCTCGAAACCCATCGGGATCATCGGCAACAATCTCTTAGTCGACTC ALS574/653checking-F ATTGACGGAGATGGAAGCTT ALS574/653checking-R CCAAACTGAGCCAGTCACAA

С. Результаты эксперимента

1. Определение генотипа растения T1

Семена T1 выбирают с помощью резистентной к гигромицину среды MS, всего 32 положительных сеянца получают для вектора pQY743 и всего 18 положительных сеянцев получают для вектора pQY745. Для каждого вектора отбирают 10 сеянцев и экстрагируют геномную ДНК из листьев для обнаружения сайта-мишени. Было обнаружено, что в поколении T1 на сайте ALS574 редактирование не происходит, и на сайте ALS653 происходят события редактирования, которые соответствуют ожиданиям проекта. Результаты обнаружения представлены в таблице 1:

Таблица 1: Типы мутаций растений Т1 Сайт ALS Номер вектора Номер растения T1 Тип редактирования 574 pQY743 1-10 WT 653 pQY745 3,4-8,10 Химера 1,2,9 Гетерозигота

2. Результаты селекции семян поколения Т2

После сбора семян поколения Т2 одного растения, их высевают на резистентную к имазапику среду для проведения селекции. Было видно, что Col-0 дикого типа не может расти на резистентной среде, в то время как положительные растения мутантных штаммов могут нормально расти на резистентной среде, как показано на фигуре 3.

Для каждого вектора отбирают 10 сеянцев и выделяют их геномную ДНК из листьев для молекулярного обнаружения. Было обнаружено, что для вектора pQY743 имеется 6 штаммов, которые имеют гомозиготную мутацию в соответствии с ожиданиями, т. е. мутацию от TGG к TTG, как показано на фигуре 4. Кроме того, имеется 1 штамм с гетерозиготной мутацией, и имеются 3 штамма с химерной мутацией. Результаты обнаружения представлены в таблице 2.

Таблица 2: Типы мутаций растений Т2 Сайт ALS Номер вектора Номер растения T2 Тип редактирования 574 pQY743 2,3,5,6,7,9 Гомозигота 4 Гетерозигота 1,8,10 Химера

Вышеприведенные результаты показали, что с помощью технического решения запрограммированного последовательного разрезания/редактирования по настоящему изобретению можно достичь дизайна и реализации ожидаемых мутаций в сайте-мишени, а мутации замены оснований можно реализовать путем конструирования последовательных комбинаций sgРНК только с Cas9 белком.

Пример 2. Получение множественных типов мутаций путем запрограммированного последовательного разрезания/редактирования в сайтах W574 и S653 ALS гена Arabidopsis thaliana

Технологические стадии дизайна вектора, конструирования и трансформации и селекции Arabidopsis thaliana проводят согласно примеру 1. Для сайта AtALS W574 дизайн вектора был таким же, как и в примере 1. Схематическая диаграмма вектора показана на фигуре 5, и ожидается, что мутация W574L должна была быть реализована сначала -G, затем +T в специфичном сайте. Никаких событий редактирования не было обнаружено в поколении T1 вектора, трансформированного Arabidopsis thaliana. Поколение T2 трансгенного Arabidopsis thaliana выбирают с 0,24 мг/л имазапика, и получают большое количество резистентных к гербицидам растений, как показано на левой панели фигуры 6, проводят молекулярное обнаружение этих резистентных растений, результаты секвенирования продукта ПЦР показывают, что не только ожидаемая мутация W574L появляется в сайте W574, но также появляется другая резистентная мутация W574M, как показано на правой панели фигуры 6.

Для сайта AtALS S653, дизайн вектора такой же, как в примере 1. Диаграмма вектора показана на фигуре 7, и ожидается, что мутация S653N должна быть реализована сначала -G, затем +A в специфичном сайте. Ожидаемое событие редактирования S653N обнаружено в поколении T1 трансформированного вектором Arabidopsis thaliana. Поколение T2 трансгенного Arabidopsis thaliana непрерывно выбирают с 0,24 мг/л имазапика, и получают большое количество резистентных к гербицидам растений, как показано на левой панели фигуры 8, для этих резистентных растений проводят молекулярное обнаружение, результаты секвенирования продукта ПЦР показывают, что в сайте S653 произошла не только ожидаемая мутация S653N, но также произошли две другие резистентные мутации S653R и S653R/G654D, как показано на правой панели фигуры 8.

Вышеприведенные результаты показывают, что с помощью технического решения запрограммированного последовательного разрезания/редактирования по настоящему изобретению, в дополнение к ожидаемым мутациям, предназначенным для сайта-мишени, можно также создавать несколько типов функциональных мутаций путем конструирования последовательных комбинаций sgРНК только с соответствующим Cas9 белком, так что он является подходящим инструментом для создания новых функциональных мутаций.

Пример 3: Создание мутации резистентности W574M с использованием различных PAM для выполнения запрограммированного последовательного разрезания/редактирования рядом с сайтом W574 гена ALS Arabidopsis thaliana

Технологические стадии проектирования вектора, конструирования и трансформации и селекции Arabidopsis thaliana проводят в соответствии с примером 1, за исключением того, что последовательность 5'CTTGGCATGGTTATGCAATGgg3' рядом с сайтом AtALS W574, GG, расположенный ближе к сайту W574, используют первым в качестве PAM для конструирования sgРНК1: 5'CTTGGCATGGTTATGCAATG3', в котором сайт W574 был подчеркнут, и NG PAM выделен курсивом. По прогнозу, новая последовательность 5'CTTGGCATGGTTATGCAAATGGGAag3' должна образоваться с помощью +A после разрезания и репарации. AG используют в качестве нового сайта PAM для разработки sgРНК2: 5'CTTGGCATGGTTATGCAAATGGGA3', и генотип -G образуется после спонтанной репарации клеток, с получением W574M. То есть, разные сайты PAM используют для двух разрезов в этой схеме. Диаграмма вектора показана на фигуре 9. Вектор используют для трансформации Arabidopsis thaliana, определяют генотип трансгенного штамма поколения T1 подвергают, из чего определяют ожидаемое событие редактирования W574M, и растение демонстрирует резистентность к обработке имазапиком.

Результаты показали, что при использовании технического решения настоящего изобретения и использовании различных PAM для выполнения запрограммированного последовательного разрезания/редактирования, редактирование может быть выполнено в более широком диапазоне последовательностей с получением аминокислотной замены.

Пример 4. Разработка прогнозируемых замен оснований для сайтов D350 и W548 ALS гена Oryza sativa

Мутацию, описанную в Nishimasu et al. 2018 Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science 361(6408):1259-1262. doi: 10.1126/science.aas9129, вводят в pHUE411 (набор инструментов CRISPR/Cas9 для мультиплексного редактирования генома растений. Xing HL, Dong L, Wang ZP, Zhang HY, Han CY, Liu B, Wang XC, Chen QJ. BMC Plant Biol. 2014 Nov 29;14(1):327. 10.1186/s12870-014-0327-y, более подробно см. в https://www.addgene.org/71287/) для конструирования вектора pHUE411-NG, способного распознавать NG PAM.

Последовательность гена ALS Oryza sativa представлена в SEQ ID NO:12. Используя 5'GGCGTGCGGTTTGATGATCG3' (подчеркнутая часть является сайтом OSALS-D350, соответствующим Arabidopsis thaliana ALS-D376) и новую последовательность 5'GGCGTGCGGTTTGATGACG3', которая, по прогнозам должна быть получена в результате редактирования в качестве мишеней, конструируют вектор с двойной мишенью согласно способу, описанному Xing HL, Dong L, Wang ZP, Zhang HY, Han CY, Liu B, Wang XC, Chen QJ. BMC Plant Biol. 2014, и ожидают получить превращение GAT-GAA, приводящее к мутации OsALS D350E.

Используя 5'GGTATGGTTGTGCAATGGGA3' (подчеркнутая часть является сайтом OsALS-W548, соответствующим Arabidopsis thaliana ALS-W574) и новую последовательность 5'GGTATGGTTGTGCAATGGA 3', которая, по прогнозам должна быть получена в результате редактирования в качестве мишеней, конструируют вектор с двойной мишенью, и ожидают получить превращение TGG-TTG, приводящее к мутации OsALS W548L.

Затем два вектора переносят в Oryza sativa для получения трансгенных растений, и идентификация показывает, что получены растения с ожидаемыми заменами D350E и W548L. Результаты биотестирования резистентности к гербицидам в полевых условиях показали, что мутанты D350E и W548L приобрели резистентность к гербицидам-ингибиторам ALS.

Пример 5. Разработка прогнозируемых замен оснований и выбор множественных типов мутаций для W2038 сайта ACCase2 гена Oryza sativa

Последовательность гена ACCase2 Oryza sativa представлена в SEQ ID NO:14, в которой сайт OsACCase2 W2038 соответствует сайту ACCase W2027 Alopecurus myosuroides. AGG, близкий к этому сайту, используют в качестве PAM для конструирования sgРНК1: 5'TTCATCCTCGCTAAC-TGAG3', и по прогнозу новая последовательность будет образовываться посредством -G после разрезания и репарации. AGG непрерывно используют в качестве PAM для конструирования sgРНК2: 5'CTTC-ATCCTCGCTAACTGAG3', и +T генотип формируется после разрезания и репарации снова, что дает мутацию W2038L. sgРНК1 и sgРНК2 конструируют на векторе pHUE411 для получением вектора редактирования, и диаграмма вектора показана на фигуре 10.

Вектор редактирования используют для трансформации каллюса Huaidao № 5 (сорт риса), и после 3 недель совместной селекции с 50 мкг/л гигромицина и 50 мкг/л квизалопа-p получают большое количество резистентных каллюсов, как показано на левой панели фигуры 11. Резистентный каллюс берут для идентификации генотипа, и обнаруживают, что произошла не только ожидаемая мутация W2038L, но также и мутация W2038C, как показано на правой панели фигуры 11.

Приведенные выше результаты запрограммированного последовательного разрезания/редактирования гена Oryza sativa показали, что техническое решение настоящего изобретения применимо как к однодольным, так и к двудольным растениям.

Пример 6. Экспрессия и очистка белков SpCas9 и NGA-Cas9.

1. Экспериментальные приборы и реагенты

Таблица 3: Экспериментальные реагенты Реагент Приготовление и использование Q5 ДНК полимераза Куплено у NEB I5 ДНК полимераза и I5 реакционный раствор Куплено у Tsingke Bio dNTP Shanghai Sangon Смола Ni-NTA Shanghai Sangon Tris/NaCl/имидазол Shanghai Sangong DTT Shanghai Sangong β-меркаптоэтанол Sigma Сборный гель SDS-PAGE Nanjing GenScript Колонка Superdex200 GE Healthcare Таблица 4: Экспериментальные приборы Инструмент Модель Инструмент ПЦР Bio-rad T100 Встряхиваемый слой с постоянной температурой Ounuo HNY-200B Клеточный дезинтегратор Ningbo Xinzhi JY92-IIN Аппарат для электрофореза WIX-EP600 Очиститель белка GE AKTA pure Высокоскоростная центрифуга с охлаждением большой емкости Xiangzhi ZX21K Высокоскоростная центрифуга Eppendorf 5424R Киноскоп для дневного света Beijing Liuyi WD-9406 Аппарат для визуализации на геле нуклеиновой кислоты Beijing Sage ChampGel™ 5000 Микроспектрофотометр DS-II

2. Экспериментальный способ

2.1 Конструирование вектора экспрессии pET15b-Cas9

Последовательности ДНК белков SpCas9 и NGA-Cas9, полученные после оптимизации растительных кодонов, показаны в SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16 соответственно, и последовательности синтезируют с помощью GenScript в качестве матричных ДНК.

После раздельной амплификации последовательностей NG-Cas9 и NGA-Cas9 два фрагмента лигируют в вектор экспрессии pET15b способом инфузии, трансформируют в DH5a и секвенируют после проверки.

Таблица 5: Система амплификации для проверки ПЦР и праймеры Реакционная система, 50 мкл 2× I5 реакционный раствор 25 мкл Матричная ДНК 1 мкл Прямой и обратный праймеры по 2 мкл каждый Сверхчистая вода Добавлена до 50 мкл Последовательность праймера: 5'-3' pET15b-NG Cas9 -F gtgccgcgcggcagccatatggattacaaggaccacgacg pET15b-NG Cas9-R tttgttagcagccggatcctcacttcttcttcttcgcctgc pET15b-NGA Cas9 -F tgccgcgcggcagccatatgatggattacaaggaccacgacg pET15b-NG Cas9 -R tttgttagcagccggatcctcacttcttcttcttggcctgtccc

2.2 Экспрессия и очистка белков

Сконструированные векторы экспрессии трансформируют в Escherichia coli Rosetta (DE3), их экспрессию индуцируют с помощью IPTG, и бактерии собирают, лизируют и очищают на колонке Ni-NTA. Конкретный способ описан ниже:

а) Рекомбинантные векторы экспрессии трансформируют в штамм Rosetta (DE3), одну колонию собирают в 10 мл среды LB, резистентной к CmR+Amp (pET15b) или CmR+Kana (pET28a), культивируют при 200 об/мин при 37° в течение ночи, переносят в 2 л встряхиваемую колбу, содержащую 1 л среды LB, культивируют при 37°C и 200 об/мин до достижения OD600 d 0,6-0,8, охлаждают до 18°C, экспрессию индуцируют 0,5 мМ IPTG в течение ночи, и бактерии собирают центрифугированием при 4000g.

b) Собранные бактерии ресуспендируют в Ni-буфере А: 50 мМ HEPES, pH 7,4, 500 мМ NaCl, 20 мМ имидазола, 5 мМ β-меркаптоэтанола, с добавлением PMSF с конечной концентрацией 1 мМ и 250 мкл коктейля ингибиторов, и затем хорошо перемешивают.

с) после разрушения ресуспендированных клеток ультразвуковым дезинтегратором, их центрифугируют при 40000g в течение 30 минут при 4°C, супернатант собирают и пропускают через колонку Ni-NTA.

d) Очистка на колонке Ni-NTA: надосадочную жидкость лизата объединяют со смолой в течение 20 минут, элюируют буфером А, содержащим 50 мМ имидазола, для удаления примесей и, наконец, элюируют буфером для элюирования, содержащим 400 мМ имидазола.

е) SDS-PAGE систему гель-электрофореза используют для определения эффекта очистки белка.

f) Диализ проводят, заменяя буфер на 50 мМ HEPES pH 7,5, 150 мМ KCl, 1 мМ ДТТ, 3% глицерин.

h) Конечный образец подвергают SDS-PAGE гель-электрофорезу для определения эффекта очистки белка. После концентрации ультрафильтрацией белок замораживают при -80°С для последующего использования.

2.3 Результаты экспрессии и очистки слитых белков Cas9

Результаты очистки белков SpCas9 и NGA-Cas9 показаны на фигуре 12. Стрелки указывают на полосы белка Cas9, указывая на то, что была достигнута более высокая чистота.

Пример 7. In vitro активность расщепления белков SpCas9 и NGA Cas9, обнаруженная отдельно в отношении сайтов-мишеней OsACCase2 W2038 и OsALS W548

1. Последовательности ДНК генов OsALS и OsACCase2 вводят в онлайн-инструмент CRISPOR (http://crispor.tefor.net/), следующие sgРНК разрабатывают для W548 OsALS (548 аминокислота OsALS, аминокислотная последовательность белка ALS Oryza sativa представлена в SEQ ID NO: 11), соответствующей аминокислотному сайту 574 белка ALS Arabidopsis thaliana и W2038 OsACCase2 (2038 аминокислота OsACCase2, аминокислотная последовательность белка ACCase2 Oryza sativa показана в SEQ ID NO: 13), соответствующей аминокислотному сайту 2027 Alopecurus myosuroides, и эти sgРНК синтезируют с помощью GenScript:

>sgRNA1-548-G:

5’GGGUAUGGUUGUGCAAUGGGAguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc3’

>sgRNA1-2038-G:

5’GUUCAUCCUCGCUAACUGGAGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc3’

2. Специфические праймеры обнаружения, OsALS265AA-F: 5’ggtcttgcgtctggttggc3’ и OsALS-end-R: 5’ccatgccaagcacatcaaacaag3’, используют для амплификации фрагмента, содержащего сайт-мишень OsALS W548, и продукт ПЦР имеет длину 1200 п.н.

Специфические праймеры обнаружения, OsACC1750AA-F: 5'gcgaagaagactatgctcgtattgg3' и OsACC2196AA-R: 5'cttaatcacacctttcgcagcc3', используют для амплификации фрагмента, содержащего сайт-мишень OsACCase W2038, и продукт ПЦР имеет длину 1500 п.н.

Система ПЦР показана в следующей таблице:

Компонент Объем 2× I5 реакционный раствор 25 мкл Прямой праймер (10 мкМ) 2 мкл Обратный праймер (10 мкМ) 2 мкл Матрица геномной ДНК 2 мкл Сверхчистая вода Добавляют до 50 мкл

3. Проводят реакцию ПЦР, и условия реакции показаны в следующей таблице:

Стадия Температура Время Предварительная денатурация 98°С 30 с 30-35 циклов усиления 98°С 15 с 58°С 15 с 72°С 30 с Окончательное расширение 72°С 3 мин

4. Продукты ПЦР обнаруживают электрофорезом в агарозном геле и подвергают секвенированию для дальнейшей проверки. После правильной проверки гель разрезают для извлечения фрагментов ДНК. Восстановленные фрагменты ДНК растворяют, добавляя 30 мкл сверхчистой воды, не содержащей РНКазы, и измеряют их концентрацию.

5. Для определения активности белка Cas9 используют следующую систему обнаружения, и после того, как система приготовлена, ее инкубируют при 37°C в течение 1 часа.

Компоненты Объем Cas9 белок 0,5 мкл (1 мкг) sgРНК 0,5 мкл (1 мкг) 10× Cas9 реакционный буфер 2 мкл Восстановленный фрагмент ДНК Х мкл (100 нг) Сверхчистая вода без РНКазы Добавляют до 20 мкл

6. После завершения реакции, систему обрабатывают при 65°C в течение 10 минут, добавляли 4 мкл 6× буфера для загрузки ДНК и запускают на 2% агарозном геле для определения размера полосы.

Результаты представлены на фигуре 13, и видно, что очищенные белки Cas9 могут разрезать двухцепочечную ДНК на сконструированных сайтах-мишенях только в присутствии sgРНК.

Пример 8: Получение мутации W548L в сайте OsALS548 путем трансформации протопласта Oryza sativa двумя различными таргетными RNP комплексами

1. Получение протопластов Oryza sativa и PEG-опосредованную трансформацию выполняют на основе частично модифицированного метода, который был опубликован (Bart et al., 2006), и конкретные стадии получения включают следующие:

(1) Сначала готовят рассаду Oryza sativa для протопластов. Сорт риса - Nipponbare. Сначала семена риса очищают от шелухи, и очищенные семена промывают 75% этанолом в течение 1 минуты, обрабатывают 5% (об./об.) гипохлоритом натрия в течение 20 минут, затем промывают стерильной водой более 5 раз, помещают на сверхчистый стол и высушивают обдуванием, и затем помещают в колбу для тканевых культур, содержащую 1/2 среды MS, по 20 семян в каждой колбе. Протопласты получают путем инкубации семян при 26°С и 12-часовом освещении в течение примерно 10 дней.

(2) Выбирают листовое влагалище рассады, разрезают острым лезвием бритвы Gillette на кусочки размером примерно 1 мм и помещают в 0,6М маннит и культуральную среду MES (состав: 0,6М маннит, 0,4М MES, рН 5,7) для последующего использования. После разрезания всех материалов их переносят в 20 мл раствора для ферментолиза (состав: 1,5% целлюлаза R10/RS (YaKult Honsha), 0,5% Мецерозим R10 (YaKult Honsha), 0,5М маннит, 20 мМ KCl, 20 мМ MES, pH5,7, 10 мМ CaCl₂, 0,1% BSA, 5 мМ β-меркаптоэтанол), заворачивают в алюминиевую фольгу и помещают в шейкер при 28°. Ферментолиз проводят при 50 об/мин в темноте в течение примерно 4 часов, и последние 2 минуты скорость повышают до 100 об/мин;

(3) После ферментолиза добавляют равный объем раствора W5 (состав: 154 мМ NaCl, 125 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl, 15 мМ MES), встряхивают горизонтально в течение 10 секунд для высвобождения протопласта. Клетки, полученные в результате ферментолиза, фильтруют через сито 300 меш и центрифугируют при 150 g в течение 5 минут для сбора протопласта;

(4) Клетки дважды промывают раствором W5 и собирают протопласт центрифугированием при 150 g в течение 5 минут;

(5) Протопласт ресуспендируют с соответствующим количеством раствора MMG (состав: 3,05 г/л MgCl₂, 1 г/л MES, 91,2 г/л маннита), и концентрация протопласта составляет около 2×10⁶ клеток/мл.

2. Приготовление комплекса RNP:

В соответствии с последовательностью сайта-мишени OsALS548 GGGTATGGTTGTGCAATGGGAgga (сайт OsALS W548 подчеркнут, в соответствии с Arabidopsis thaliana ALS W574, и сайт PAM, распознаваемый Cas9 белком, показан курсивом в нижнем регистре), очищенный белок NGA-Cas9 выбирают для получения комплекса RNP. GGA используют в качестве PAM для конструирования >CrRNA1-548-G: 5'-GGGUAUGGUUGUGCAAUGGGAguuuuagagcuaugcu-3', было спрогнозировано, что одно основание G будет удалено между первыми 3-4 положениями PAM после редактирования, и затем последовательность, полученную в результате вышеуказанной делеции, используют для конструирования второй >CrRNA2-548+T: 5'-UGGGUAUGGUUGUGCAAUGGAguuuuagagcuaugcu-3', было спрогнозировано, что одно основание T будет вставлено после второго редактирования с получением превращения TGG-TTG.

>CrRNA1-548-G и >CrRNA1-548+T синтезированы компанией GenScript Biotechnology Company, и также синтезируют sgРНК:

>sgRNA1-548-G:

5’GGGUAUGGUUGUGCAAUGGGAguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc3’

>sgRNA2-548+T:

5’UGGGUAUGGUUGUGCAAUGGAguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc3’.

Синтезированные crРНК и GenCRISPR tracrРНК (GenScript SC1933) смешивают эквимолярно, добавляют буфер для отжига crРНК и tracrРНК (GenScript SC1957-B) и отжигают для получения gРНК в соответствии с инструкциями. Последовательностью tracrРНК является 5'-agcauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuu-3'.

Реакционную систему RNP получают в соответствии со следующей таблицей, и после получения реакционной системы ее инкубируют при 25°С в течение 10 минут.

Компоненты Объем NGA Cas9 белок 10 мкл (20 мкг) gРНК или sgРНК 10 мкл (20 мкг) 10x× Cas9 реакционный буфер 10 мкл Сверхчистая вода без РНКаз 70 мкл

3. Трансформация протопластов

(1) 200 мкл ресуспендированного протопласта MMG, полученного выше, берут и добавляют комплекс RNP (20 мкг Cas9 белка, 20 мкг sgРНК), созданный после инкубации, и осторожно встряхивают для хорошего перемешивания.

(2) Равный объем 40% (масса/объем) раствора PEG (состав: 40% (масса/объем) PEG, 0,5М маннита, 100 мМ CaCl₂), осторожно встряхивают для хорошего перемешивания и выдерживают при 28°С в темноте в течение 15 минут;

(3) После индукции и трансформации, медленно добавляют 1,5 мл раствора W5, осторожно взбалтывают для тщательного перемешивания клеток, и клетки собирают центрифугированием при 150 g в течение 3 минут. Эту стадию повторяют один раз;

(4) Клетки ресуспендируют добавлением 1,5 мл раствора W5, помещают в инкубатор при 28°C и культивируют в темноте в течение 12-16 часов. Клетки следует инкубировать от 48 до 60 часов, если они использовались для экстракции геномной ДНК протопластов.

4. Обнаружение события редактирования генома-мишени

(1) ДНК протопласта экстрагируют с использованием частично модифицированного способа CTAB, и этот способ конкретно описан следующим образом: протопласт центрифугируют, и супернатант отбрасывают, добавляют 500 мкл раствора для экстракции ДНК, тщательно встряхивают и перемешивают, и инкубируют на водяной бане при 65°C в течение 1 часа; образец охлаждают после инкубации на водяной бане, добавляют равный объем хлороформа, несколько раз переворачивают для тщательного перемешивания, и центрифугируют при 10000 об/мин в течение 10 минут; 400 мкл супернатанта берут и переносят в новую 1,5 мл центрифужную пробирку, добавляют 1 мл 70% (об./об.) этанола и выдерживают для осаждения при -20°С в течение 20 минут; ДНК осаждают центрифугированием при 12000 об/мин в течение 15 минут, осадок сушат на воздухе, затем растворяют, добавляя 50 мкл сверхчистой воды, и хранят при -20°С для дальнейшего использования.

(2) Ген-специфические праймеры используют для амплификации фрагмента, содержащего сайт-мишень W548, и для сайта-мишени конструируют следующие праймеры для выявления:

OsALS500AA-F: 5’GGCTAACCCAGGTGTCACAG3’,

OsALS-3’UTR-R: 5’CCATGCCAAGCACATCAAACAAG3’

Реакционная система ПЦР представлена в следующей таблице:

Компонент с Объем 2× I5 реакционный раствор 25 мкл Прямой праймер (10 мкМ) 2 мкл Обратный праймер (10 мкМ) 2 мкл Матрица геномной ДНК 2 мкл Сверхчистая вода Добавляют до 50 мкл

(3) Проводят реакцию ПЦР была установлена, и общие условия реакции показаны в следующей таблице:

Стадия Температура Время Предварительная денатурация 98°С 30 с 30-35 циклов амплификации 98°С 15 с 58°С 15 с 72°С 30 с Окончательное расширение 72°С 3 мин

(4) Обнаружение проводят электрофорезом в агарозном геле, и фрагменты ПЦР выделяют и секвенируют.

5. Результаты эксперимента:

Либо с помощью gРНК, полученной с синтетическими crРНК и tracrРНК путем отжига, либо непосредственно с использованием синтетической sgРНК, может быть получен активный комплекс RNP с очищенным NGA-Cas9 белком. Путем секвенирования сайта-мишени OsALS548, может быть обнаружена мутация из TGG в TTG, что демонстрирует то, что сайт-специфическая мутация сайта-мишени в клетке может быть достигнута путем запрограммированного последовательного разрезания/редактирования, созданного из комплекса RNP в комбинации с crРНК или sgРНК в последовательном порядке. Как показано на фигуре 14, в точке, указанной стрелкой на диаграмме пиков секвенирования протопласта OsALS548-мишени, в дополнение к исходному пику сигнала основания G, также имеется пик сигнала основания T, созданный в результате мутации, которая приводит к мутации W548L на сайте в OsALS548.

Пример 9. Получение мутации W2038L в сайте OsACCase2 W2038 путем бомбардировки каллюса Oryza sativa двумя различными таргетными комплексами RNP.

1. Получение комплексов RNP:

В соответствии с последовательностью сайта-мишени OsACCase2 W2038 GTTCATCCTCGCTAACTGGAGagg, в которой подчеркнут сайт OsACCase2 W2038, соответствующий Alopecurus myosuroides ACCase W2027, и сайт PAM, распознаваемый Cas9 белком, выделен курсивом строчными буквами, очищенный SpCas9 белок был выбран для получения RNP комплексов. GGA используют в качестве PAM для конструирования >CrRNA1-2038-G: 5'-GUUCAUCCUCGCUAACUGGAGguuuuagagcuaugcu-3', было спрогнозировано, что одно основание G будет удалено между первыми 3-4 положениями PAM после редактирования, затем последовательность, образовавшуюся при делеции, используют для конструирования второй CrRNA2-2038+T: 5'-UGUUCAUCCUCGCUAACUGAGguuuuagagcuaugcu-3', было спрогнозировано, что после второго редактирования будет вставлено одно основание Т, таким образом, получают превращение TGG-TTG.

>CrRNA1-2038-G и >CrRNA2-2038+T синтезированы компанией GenScript Biotechnology Company, и также синтезируют sgРНК:

>sgRNA1-2038-G:

5’GUUCAUCCUCGCUAACUGGAGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc 3’

>sgRNA2-2038+T:

5’UGUUCAUCCUCGCUAACUGAGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc 3’.

Синтезированные crРНК и GenCRISPR tracrРНК (GenScript SC1933) смешивают эквимолярно, добавляют буфер для отжига crРНК и tracrРНК (GenScript SC1957-B) и подвергают отжигу для получения gРНК в соответствии с инструкциями.

Комплексы RNP получают путем инкубации в той же реакционной системе, что и в примере 8. Берут количество 10 бомбардировок из генной пушки для трансформации, например: 20 мкг Cas9 белка, 20 мкг gРНК или sgРНК, 10 мкл 10× Cas9 реакционного буфера, общий объем доводят до 100 мкл ультрачистой водой, не содержащей РНКазы, инкубируют при 25°C в течение 10 минут и осторожно перемешивают.

2. Индукция каллюса Oryza sativa

Зрелые и разбухшие семена Oryza sativa отбирают, очищают от шелухи и дезинфицируют в соответствии со следующими стадиями:

(1) Семена риса (Oryza sativa) очищают от шелухи, сорт риса Huaidao No.5 куплен на рынке семян.

(2) Семена промывают стерильной водой неограниченное количество раз до тех пор, пока промытая вода не становится прозрачной.

(3) После стерилизации 70% спиртом в течение 1 минуты, семена помещают в 10% гипохлорит натрия на горизонтальном шейкере и инкубируют в течение 25 минут при встряхивании.

(4) После дезинфекции гипохлоритом натрия, семена 5 раз промывают стерильной водой. Семена высевают на среду для индукции каллюса (состав: порошок MS (4,42 г/л) + 2,4-D (2 мг/л) + сахароза (30 г/л) + фитагель (4 г/л)) и культивируют в темноте при 28°С для индукции каллюса.

3. RNP бомбардировка генной пушкой:

(1) Гипертоническая культивация

Каллюс с хорошей эмбриогенностью переносят на гипертоническую среду (состав: MS порошок (4,42 г/л) + 2,4-D (2 мг/л) + сахароза (30 г/л) + D-маннит (0,4 М)) + фитагель (4 г/л)), стерильную операцию проводят на ультрачистом лабораторном столе, и культивирование проводят в темноте при 25° в течение 4-6 часов.

(2) Получение суспензии золотого порошка: с помощью импортированной 1,5 мл пробирки EP взвешивают 30 мг золотого порошка (диаметр 0,6 мкм); добавляют 1 мл 70% этанола, тщательно встряхивают и выдерживают на льду в течение 10 минут. После центрифугирования в течение 1 минуты, супернатант удаляют; добавляют 1 мл стерильной воды, тщательно встряхивают, центрифугируют в течение 1 минуты, супернатант удаляют и повторяют описанную выше операцию 3 раза. Добавляют 500 мкл стерилизованного глицерина (50%), тщательно встряхивают для приготовления суспензии золотого порошка с концентрацией 60 мкг/мкл, которую хранят при -20°С.

(3) Берут 50 мкл суспензии золотого порошка (60 мкг/мл), добавляют 100 мкл полученного комплекса RNP и осторожно перемешивают.

(4) Берут 15 мкл смеси RNP/золотой порошок и помещают в центр расщепляемой мембраны настольной генетической пушки PDS-1000 (Bio-Rad), сушат обдувом, и затем подвергают бомбардировке в соответствии с инструкциями для инструмента.

Параметры бомбардировки: степень вакуума 26-28, расстояние 6 см, давление воздуха 1100 ф./кв.д. или 1350 ф./кв.д.

(5) После окончания бомбардировки, каллюс культивируют в гипертонической среде при 25°С в течение ночи (16 часов) в темноте.

4. Выбор, дифференциация и укоренение:

(1) После культивирования подвергнутого бомбардировке каллюса в течение ночи, его переносят в индукционную среду и культивируют для восстановления при 28°C в течение одной недели.

(2) После одной недели восстановления, каллюс переносят в среду для селекции (состав: 4,1 г/л N6 порошок+0,3 г/л гидролизованный казеин+2,8 г/л пролин+2 мг/л 2,4-D+3% сахароза+50 мкг/л квизалофоп-р+500 мг/л Cef (цефалоспорин) + 0,1 г/л инозит+0,35% фитогель, рН 5,8) для проведения селекции в течение 3-4 недель; для предполагаемого редактирования OsACCase2 W2038, для селекции используют 50 мкг/л квизалофопа-p, как показано на фигуре 15.

(3) Отобранный резистентный каллюс с хорошим статусом роста переносят на среду для дифференциации (состав: MS порошок (4,42 г/л) + KT (1 мг/л) + сахароза (30 г/л) + фитагель (4,5 г/л).) + 50 мкг/л квизалофоп-p, pH 5,8) и культивируют при 28° на свету для индукции дифференциации в течение 2-4 недель.

(4) Дифференцированную рассаду переносят на среду для укоренения (состав: 1/2 MS порошок (2,3 г/л) + сахароза (30 г/л) + фитагель (4,5 г/л)) для укоренения, рассаду закаляют после завершения укоренения, и затем переносят в горшки, наполненные почвой, и помещают в теплицу для выращивания.

5. Обнаружение событий редактирования мишени в резистентных каллюсах и рассаде культур тканей T0:

Всего при селекции получают 11 резистентных каллюсов, ДНК которых была экстрагирована способом СТАВ. Праймеры для выявления для сайта-мишени конструируют следующим образом: OsACC2038test-F: 5'CTGTAGGCATTTGAAACTGCAGTG3', OsACC2038test-R: 5'GCAATCCTGGAGTTCCT-CTGACC3', и ПЦР фрагмент, содержащий сайт OsACCase2 W2038, амплифицируют, выделяют и секвенируют. Обнаружение секвенирования показало, что 10 из них имели мутацию от TGG к TTG на сайте OsACCase2 W2038, где 3 образца являются гомозиготными мутантами.

Для рассады культуры ткани поколения Т0, полученной путем дифференциации резистентного каллюса, экстрагируют их ДНК для обнаружения последовательности сайта-мишени редактирования, и также обнаруживают гомозиготную мутацию из TGG в TTG на сайте OsACCase2 W2038, как показано на фигуре 16.

6. Тест на резистентность рассады поколения Т1 к гербицидам, ингибиторам АССазы.

После размножения штамма T0, содержащего мутацию W2038L, мутантную рассаду поколения T1 тестируют на резистентность к гербицидам с квизалофопом-p и галоксифопом-p в рабочих концентрациях. Можно увидеть, что мутантный штамм OsACCase2 W2038L обладает значительной резистентностью к этим двум гербицидам, ингибиторам АССазы, как показано на фигурах 17-18.

Таким образом, либо используя gРНК, полученную с синтетическими crРНК и tracrРНК путем отжига, либо непосредственно используя синтетическую sgРНК, активный комплекс RNP может быть образован с очищенным SpCas9 белком; каллюсы, подвергнутые бомбардировке генной пушкой, могут быть отобраны с использованием квизалофопа-p на стадии культуры ткани; гомозиготная мутация от TGG до TTG может быть обнаружена путем секвенирования сайта-мишени OsACCase2 W2038 рассады тканевой культуры поколения T0; мутация может быть унаследована в поколении T1 и показала резистентность к гербицидам, ингибиторам АССазы, что также демонстрирует то, что запрограммированное последовательное разрезание/редактирование, созданное из комплекса RNP в сочетании с последовательным таргетированием crРНК или sgРНК, может привести к сайт-специфической мутации сайта-мишени в клетке и может управлять продуцированием клеточно-эндогенных маркеров селекции для селекции тканевых культур, тем самым создавая резистентные к гербицидам культуры.

Пример 10: Различные таргетные комплексы RNP одновременно редактируют сайт OsACCase2 W2038 и ген OsBADH2 каллюса Oryza sativa

Комплекс RNP получают способом по примеру 8, процедуры бомбардировки генной пушкой и культуры ткани такие же, как в примере 9. Кроме crРНК или sgРНК, таргетирующих сайт OsACCase2 W2038, одновременно добавляют crРНК или sgРНК, таргетирующие ген OsBADH2, и их инкубируют с SpCas9 белком с образованием таргетного комплекса RNP для второго гена-мишени OsBADH2. Проводят бомбардировку генной пушкой, рассаду культуры тканей поколения T0 получают после выделения культуры, скрининга, дифференциации и укоренения, и поколение T1 получают путем размножения.

Последовательность генома Oryza sativa OsBADH2 представлена в SEQ ID NO: 17. Согласно онлайн-инструменту CRISPOR (http://crispor.tefor.net/) выбирают последовательность сайта-мишени CCAAGTACCTCCGCGCAATCGcgg, в котором сайт PAM, распознаваемый Cas9 белком, показан курсивом строчными буквами, и очищенный SpCas9 белок выбирают для получения RNP комплекса. CGG используют в качестве PAM для конструирования >CrRNA1-OsBADH2: 5’-CCAAGUACCUCCGCGCAAUCGguuuuagagcuaugcu-3’, было спрогнозировано, что резистентная мутация OsACCase2 W2038L и событие нокаутной мутации OsBADH2 могут быть одновременно обнаружены в резистентном каллюсе, полученном селекцией квизалофопа-p.

>CrRNA1-OsBADH2 был синтезирован GenScript Biotechnology Company, также синтезируют sgРНК:

>OsBADH2-sgRNA:5’CCAAGUACCUCCGCGCAAUCGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc3’.

Резистентный каллюс отбирают в соответствии со стадиями трансформации в примере 9, как показано на фигуре 19, и резистентный каллюс отбирают и подвергают дифференциации и появлению проростков, и последовательности сайтов-мишеней OsACCase2 и OsBADH2 каллюса и рассады культуры тканей поколения Т0 секвенируют. Праймеры для выявления мишени OsBADH2 следующие:

OsBADH2-check F: 5’CATCGGTACCCTCCTCTTC3’

OsBADH2-check R: 5’ATCGATCGATTTGGGGCTCA3’

В результате, всего путем селекции получают 13 резистентных каллюсов, событие мутации OsACCase2 W2038L обнаруживают в 11 из них, и обнаружение последовательности-мишени OsBADH2 для этих 11 образцов каллюсов показывает, что 8 из них одновременно содержат событие редактирования в сайте-мишени OsBADH2. В рассаде культуры ткани поколения T0, полученной дифференциацией, обнаружено наличие мутации OsACCase2 W2038L и гомозиготной мутации OsBADH2 +A, как показано на фигурах 20-21.

В общем, после того, как каллюс риса был подвергнут бомбардировки генной пушкой с последовательным таргетированием crРНК- или sgРНК-таргетным RNP комплексом для проведения сайт-специфического редактирования OsACCase2 W2038 и одновременным добавлением таргетного RNP-комплекса, таргетирующего второй ген-мишень OsBADH2, селекция каллюса может быть проведена на стадии культуры ткани с квизалофопом-р; мутация OsACCase2 W2038 и таргетный нокаут OsBADH2 одновременно возникают в 61% резистентного каллюса, и штаммы, содержащие гомозиготную мутацию OsBADH2 обнаружены в рассаде культуры тканей поколения Т0. Это показывает, что последовательное разрезание/редактирование в сочетании с трансформацией RNP для сайт-специфического редактирования генов резистентности может создавать маркеры эндогенной селекции, и добавление соответствующего давления отбора может одновременно отбирать события редактирования второго гена-мишени, тем самым достигая сайт-специфического редактирования генома не трансгенными средствами.

Пример 11: Различные таргетные комплексы RNP одновременно редактируют сайт OsALS548 и ген OsSWEET14 каллюса Oryza sativa

Таргетные комплексы RNP для сайта OsALS548 получают способом по примеру 8, где последовательности crРНК и sgРНК такие же, как в примере 8, соответственно:

>CrRNA1-548-G: 5’-GGGUAUGGUUGUGCAAUGGGAguuuuagagcuaugcu-3’,

>CrRNA2-548+T: 5’-UGGGUAUGGUUGUGCAAUGGAguuuuagagcuaugcu-3’,

>sgRNA1-548-G:

5’GGGUAUGGUUGUGCAAUGGGAguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc3’,

>sgRNA2-548+T:

5’UGGGUAUGGUUGUGCAAUGGAguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc3’.

Согласно примеру 8, gРНК или sgРНК инкубируют с NGA-Cas9 для получения комплексов RNP, таргетирующих сайт OsALS548.

В дополнение к таргетному комплексу RNP для сайта OsALS548, одновременно добавляют crРНК или sgРНК для гена OsSWEET14, и формируют таргетный комплекс RNP для второго гена-мишени OsSWEET14 путем инкубации с SpCas9 белком. Рассаду тканевой культуры поколения T0 получают путем бомбардировки генной пушкой, выделения культуры, селекции, дифференциации, укоренения, и поколение T1 получают путем размножения. Давление отбора составляет 5 мг/л пироксулама.

Последовательность генома Oryza sativa OsSWEET14 представлена в SEQ ID NO: 18. Согласно онлайн-инструменту CRISPOR (http://crispor.tefor.net/) выбирают последовательность сайта-мишени GAGCTTAGCACCTGGTTGGAGggg, в которой сайты PAM, распознаваемые SpCas9 белком, показаны курсивом строчными буквами, и очищенный SpCas9 белок выбирают для получения комплекса RNP. GGG используют в качестве PAM для конструирования:

>CrRNA1-OsSWEET14::

5'-GAGCUUAGCACCUGGUUGGAGguuuuagagcuaugcu-3', и было спрогнозировано, что резистентная мутация OsALS W548L и нокаутная мутация OsSWEET14 могут быть одновременно обнаружены в резистентном каллюсе, полученном селекцией пироксулама.

>CrRNA1-Os SWEET14 был синтезирован компанией GenScript Biotechnology Company, и также синтезируют sgРНК:

>Os SWEET14-sgRNA:

5’GAGCUUAGCACCUGGUUGGAGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc3’.

Резистентный каллюс выбирают в соответствии с процедурами бомбардировки генной пушкой и культуры ткани, как описано в примере 9, как показано на фигуре 22, и отбирают резистентный каллюс для проведения дифференциации и появления проростков, где состав среды для селекции следующий : 4,1 г/л порошка N6+0,3 г/л гидролизата казеина+2,8 г/л пролина+2 мг/л 2,4-D+3% сахарозы+5 мг/л пироксулама+500 мг/л Cef (цефалоспорина) + 0,1 г/л инозита+0,35% фитагеля, рН 5,8.

Последовательность с в сайте OsALS548 и сайте-мишени OsSWEET14 каллюса и проростках культуры ткани поколения T0 секвенируют. Праймеры для выявления сайта-мишени OsSWEET14 следующие:

OsSWEET14-check F: 5’ ATGGGTGCTGATGATTATCTTGTAT3’

OsSWEET14-check R: 5’ TGAAGAGACATGCCAGCCATTG3’

В результате, селекция дает 9 резистентных каллюсов, событие мутации OsALS W548L обнаруживают в 8 из них, и обнаружение последовательности-мишени OsSWEET14 в этих 8 образцах каллюсов показало, что 5 из них также содержат событие редактирования в сайте-мишени OsSWEET14. В рассаде культуры тканей поколения T0, полученных дифференциацией, можно обнаружить как мутацию OsALS W548L, так и гомозиготную мутацию OsSWEET14-C, как показано на фигурах 23-24.

После размножения штаммов T0, в которых была обнаружена мутация OsALS W548L, мутантные штаммы рассады поколения T1 тестируют на резистентность к гербицидам с пироксуламом, имазапиком, никосульфуроном и флукарбазоном-Na в рабочих концентрациях. Можно видеть, что мутантный штамм OsALS W548L проявляет значительную резистентность ко всем этим 4 гербицидам-ингибиторам ALS, как показано на фигурах. 25-28.

Таким образом, либо используя gРНК, полученную с синтетическими crРНК и tracrРНК путем отжига, либо непосредственно используя синтетическую sgРНК, активный комплекс RNP может быть образован с очищенным NGA Cas9 белком, сайт-специфическая мутация сайта-мишени в клетках может быть достигнута с помощью запрограммированного последовательного разрезания/редактирования, создаваемого из комплекса RNP в комбинации с последовательным таргетированием crРНК или sgРНК, селекция каллюса, бомбардированного генной пушкой, может быть выполнена с пироксуламом на стадии культуры ткани, мутация от TGG до TTG обнаруживается путем секвенирования сайта-мишени OsALS548 рассады культуры тканей поколения T0, и эта мутация могла быть унаследована поколением T1 и показала резистентность к гербицидам, ингибиторам ALS.

После бомбардировки каллюса риса генной пушкой с одновременным добавлением таргетного комплекса RNP, таргетирующего второй ген-мишень OsSWEET14, и с использованием SpCas9 белка, который распознает NGG PAM, проводят селекцию каллюса пироксуламом на стадии культуры ткани. Мутация OsALS W548L и таргетный нокаут OsSWEET14 происходят одновременно в 55% резистентного каллюса, появление гомозиготной мутации OsSWEET14 может быть обнаружено в рассаде культуры ткани поколения T0, что дополнительно указывает на то, что маркеры эндогенной селекции могут быть созданы запрограммированным последовательным разрезанием/редактированием в комбинации с сайт-специфическим редактированием резистентных генов, созданных при трансформации PNP, и события редактирования второго гена-мишени могут быть выбраны одновременно с одновременным использованием Cas9 белков, которые распознают разные сайты PAM, и добавлением соответствующего давления отбора, тем самым достигая сайт-специфического редактирования генома не трансгенными средствами.

Пример 12: Создание мутации W561L в сайте StALS561 при бомбардировке эксплантатов картофеля (Solanum tuberosum L.) двумя различными таргетными комплексами RNP

Аминокислотная последовательность белка StALS2 Solanum tuberosum L. показана в SEQ ID NO: 19, и последовательность гена StALS2 Solanum tuberosum L. показана в SEQ ID NO: 20. Способы получения комплексов RNP и бомбардировки генной пушкой описаны в примерах 8-9, и sgРНК для исходной последовательности и отредактированной последовательности, сконструированной для сайта StALS2W561 Solanum tuberosum L. StALS2, соответствующего сайту ALS574 Arabidopsis thaliana следующая:

>StALS561- G:

5’GGGAAUGGUGGUUCAGUGGGAguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc3’

>StALS561 +T:

5’UGGGAAUGGUGGUUCAGUGGAguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc3’,

И комплексы RNP получают в соответствии со способом, описанным в Примере 8.

Реципиентным сортом картофеля является Atlantic или Favorita, и его листья, стебли и пазушные почки используют, соответственно, в качестве эксплантатов. Способы бомбардировки генной пушкой и селекции и дифференциации следующие:

(1) Листья: весь лист разрезают и расправляют на гипертонической среде М6 (состав: 4,42 г/л порошок MS+1 мл/л витамины В5 (Phytotechlab, G219) + 30 г/л сахароза+8 г/л агар+2мг/л 2,4-D+0,8 мг/л зеатинрибозид+0,2 М маннит+250 мг/л Cef), для каждой бомбардировки используют около 5-6 листьев. После предварительной инкубации в течение 24 часов проводят бомбардировку золотым порошком. После бомбардировки их непрерывно культивируют в гипертонической среде М6 в темноте в течение 2 дней, затем переносят в среду М6 (4,42 г/л порошок MS+1 мл/л витамины B5 (Phytotechlab, G219) + 30 г/л сахароза+8 г/л агар+2мг/л 2,4-D+0,8 мг/л зеатинрибозид+250 мг/л Cef) и непрерывно культивируют в течение 1 недели, затем через 1 неделю переносят в среду M6 с давлением отбора, селекцию резистентного каллюса проводят с давлением отбора 20 мкг/л хлорсульфурона (состав: 4,42 г/л порошок MS+1 мл/л витамины B5 (Phytotechlab, G219) + 30 г/л сахароза+8 г/л агар+2 мг/л 2,4-D+0,8 мг/л зеатинрибозид+250 мг/л Cef+20 мкг/л хлорсульфурон), 4 недели спустя их переносят в среду для индукции глазков R4, имеющую давление отбора (состав: 4,42 г/л порошок MS+1 мл/л витамины B5 (Phytotechlab, G219) + 30г/л сахароза+8 г/л агар+2 мг/л GA3+0,8 мг/л зеатинрибозид+250 мг/л Cef+20 мкг/л хлорсульфурон) до появления всходов.

2) Стебли: берут стебли картофеля (без пазушных почек), разрезают их вдоль надрезом вверх и помещают на среду CIMI (4,42 г/л порошок MS+20 г/л сахароза+8 г/л агар+0,5 мг/л зеатиннуклеозид+2 мг/л 2,4-D+250 мг/л Cef+20 мкг/л хлорсульфурон), с последующей бомбардировкой генной пушкой, культивируют в темноте в течение 1 дня после бомбардировки, стебли переносят в свежую среду CIMI и непрерывно культивируют в течение 1 недели, затем стебли переносят в среду SIMI, имеющую давление отбора (состав: 4,42 г/л порошок MS+20 г/л сахароза+8 г/л агар+1 мг/л зеатинрибозид+0,1 мг/л GA3+250 мг/л Cef+20 мкг/л хлорсульфурон) для селекции резистентных почек до появления всходов.

(3) Пазушные почки: пазушные почки берут из стеблей картофеля, разрезают продольно и переносят в среду CIMI разрезом вверх, помещают в среду CIMI с последующей бомбардировкой генной пушкой, культивируют в темноте в течение 1 дня после бомбардировки, их переносят в свежую среду CIMI и непрерывно культивируют в течение 1 недели, и затем переносят в среду SIMI, содержащую давление отбора, для проведения селекции резистентных почек до появления всходов.

Праймеры для выявления сайта StALS2 W561:

StALS561-Check F: 5’GTGGATTAGGAGCAATGGGATTT3’

StALS561-Check R: 5’ TTATTTTAGATAATACAATGCCTCG3’

После обнаружения, событие редактирования W561L происходит в сайте StALS2 W561 подвергнутой скринингу на резистентность рассады культур ткани картофеля поколения T0, что демонстрирует, что способ не трансгенного временного редактирования генов, предложенный в настоящем изобретении, подходит для сельскохозяйственных культур, таких как картофель, от которых трудно отделить и удалить экзогенный трансгенный элемент путем самоопыления или гибридизации.

Пример 13: Успешное использование запрограммированной схемы последовательного разрезания/редактирования для замены оснований в клетках 293T человека

Отбирают ген HBB (бета-субъединица гемоглобина) в эмбриональной клетке почки человека 293T (его последовательность ДНК показана в SEQ ID NO: 21, его последовательность CDS показана в SEQ ID NO: 22, и его аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO: 23), сайт-мишень для последовательного разрезания/редактирования sgРНК конструируют в области первого экзона, в котором первой мишенью является catggtgcaCctgactcctgAGG. sgРНК, которая распознает эту мишень, названа sgHBB, и по прогнозам, делеция одного основания C может быть создана на sgРНК разрезе этого сайта. Второй мишенью является ccatggtgcatctgactctgAGG, которая распознает последовательность с делецией одного основания C в результате разрезания/редактирования первой мишени, и sgРНК этой мишени названа sgHBB-c. Конструируют sgРНК без сайта-мишени в клетках 293T и называют sgNOTAR, ее используют в качестве комплементарной плазмиды для трансфекции в эксперименте.

В соответствии с описанной выше конструкцией, синтезируют комплементарные одноцепочечные фрагменты ДНК, соответственно. После отжига их лигируют в плазмиду рх458 (addgene: 48138), переваренную ферментом BbsI, и трансформируют в компетентную E. coli DH5a. После подтверждения полученных одиночных колоний E. coli секвенированием, плазмиду экстрагируют и очищают с помощью набора для экстракции плазмиды без эндотоксина (Tiangen Bio).

Энергично растущие клетки 293T переваривают и выделяют с 0,05% трипсином (Gibico), разбавляют средой DMEM (10% эмбриональной телячьей сыворотки; двойная резистентность к пенициллину+стрептомицину) и инокулируют в 24-луночные культуральные планшеты и помещают в инкубаторе с диоксидом углерода на ночь. На следующий день, их смешивают отдельно с, согласно последовательному разрезанию/редактированию: плазмиды sgHBB и sgHBB-c по 0,5 мкг; разрезание/редактирование одной мишени: плазмиды sgHBB и sgNOTAR по 0,5 мкг каждая; без контроля мишени: плазмида pEGFP-c1 1 мкг. Трансформацию проводят липофектамином 3000 (Invitrogen). Делают 3 повтора для каждой группы.

Через 48 часов после трансформации получают изображения с помощью флуоресцентного микроскопа для регистрации эффективности трансформации, и общую ДНК из каждой лунки экстрагируют с помощью набора для экстрагирования нуклеиновых кислот (Omega).

Сконструированы следующие праймеры секвенирования Hi-tom:

Hi-HBB-F: gaggtgagtacggtgtgcGCTTACATTTGCTTCTGACACAACT;

Hi-HBB-R: gagttggatgctggatggTCTATTGGTCTCCTTAAACCTGTCTTG.

Эти праймеры используют для проведения ПЦР для каждого образца ДНК. Высокопроизводительное секвенирование продуктов ПЦР проводят с использованием способа Hi-tom (Sci China Life Sci. 2019 Jan;62(1):1-7. doi: 10.1007/s11427-018-9402-9).

Статистические данные результатов секвенирования представлены в таблице 6 и таблице 7. Эти данные указывают на то, что способ последовательного разрезания/редактирования на сайте HBB дал результат редактирования от C к T (что приводит к мутации P6S) в соотношении примерно 1,67%, в то время как способ разрезания/редактирования одной мишени не может привести к такой замене оснований.

Примечание: WT представляет дикий тип; Делеция представляет генотип делеции; Вставка представляет генотип вставки; C->T SNP представляет генотип с заменой основания с C на T на разрезе; Всего представляет общий итог.

Кроме того, серповидно-клеточная анемия и β-талассемия являются наследственными анемиями, вызванными мутациями в гене HBB, кодирующем β-субъединицу гемоглобина взрослых. Пациентам с этими заболеваниями может потребоваться переливание крови или другие способы лечения на протяжении всей жизни. Результаты вышеуказанного эксперимента показали что посредством технического решения запрограммированного последовательного разрезания/редактирования, представленного в настоящем изобретении, можно сконструировать комбинацию crРНК или sgРНК для сайта мутации гена HBB, чтобы вызвать ожидаемую репарацию в сайте мутации, чтобы клетка продуцировала активный гемоглобин и восстановила функцию, тем самым достигнув терапевтического эффекта. То есть, композиция по настоящему изобретению может быть использована для лечения заболеваний.

После множества одновременных испытаний, поскольку этот новый способ полностью основан на существующих функциях Cas9, способ по настоящему изобретению будет полностью применим для достижения новых функций замены оснований, делеции и вставки специфических фрагментов в другие организмы (растения, животные, грибы или бактерии и т.д.), где Cas9 может хорошо работать.

Все публикации и заявки на патенты, упомянутые в описании, включены в настоящий документ посредством ссылки, как если бы каждая публикация или заявка на патент были индивидуально и специально включены в настоящий документ посредством ссылки.

Хотя вышеупомянутое изобретение было описано более подробно посредством примеров и вариантов осуществления для ясного понимания, очевидно, что определенные изменения и модификации могут быть осуществлены в пределах объема прилагаемой формулы изобретения, и все такие изменения и модификации входят в объем настоящего изобретения.

--->

Список последовательностей

<110> Qingdao Kingagroot Chemical Compound Co., Ltd.

<120> Способ создания новых мутаций в организмах и его применение

<130> IEC200334

<150> 201911081617X

<151> 2019-11-07

<150> 2020108218772

<151> 2020-08-15

<150> 2020109741512

<151> 2020-09-16

<160> 23

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 670

<212> БЕЛОК

<213> Аминокислотная последовательность белка ALS Arabidopsis thaliana

(аминокислотная последовательность)

<400> 1

Met Ala Ala Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ser Ser Ser Ile Ser Phe

1 5 10 15

Ser Thr Lys Pro Ser Pro Ser Ser Ser Lys Ser Pro Leu Pro Ile Ser

20 25 30

Arg Phe Ser Leu Pro Phe Ser Leu Asn Pro Asn Lys Ser Ser Ser Ser

35 40 45

Ser Arg Arg Arg Gly Ile Lys Ser Ser Ser Pro Ser Ser Ile Ser Ala

50 55 60

Val Leu Asn Thr Thr Thr Asn Val Thr Thr Thr Pro Ser Pro Thr Lys

65 70 75 80

Pro Thr Lys Pro Glu Thr Phe Ile Ser Arg Phe Ala Pro Asp Gln Pro

85 90 95

Arg Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Glu Ala Leu Glu Arg Gln Gly Val

100 105 110

Glu Thr Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala Ser Met Glu Ile His Gln

115 120 125

Ala Leu Thr Arg Ser Ser Ser Ile Arg Asn Val Leu Pro Arg His Glu

130 135 140

Gln Gly Gly Val Phe Ala Ala Glu Gly Tyr Ala Arg Ser Ser Gly Lys

145 150 155 160

Pro Gly Ile Cys Ile Ala Thr Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val

165 170 175

Ser Gly Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp Ser Val Pro Leu Val Ala Ile

180 185 190

Thr Gly Gln Val Pro Arg Arg Met Ile Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu

195 200 205

Thr Pro Ile Val Glu Val Thr Arg Ser Ile Thr Lys His Asn Tyr Leu

210 215 220

Val Met Asp Val Glu Asp Ile Pro Arg Ile Ile Glu Glu Ala Phe Phe

225 230 235 240

Leu Ala Thr Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val Leu Val Asp Val Pro Lys

245 250 255

Asp Ile Gln Gln Gln Leu Ala Ile Pro Asn Trp Glu Gln Ala Met Arg

260 265 270

Leu Pro Gly Tyr Met Ser Arg Met Pro Lys Pro Pro Glu Asp Ser His

275 280 285

Leu Glu Gln Ile Val Arg Leu Ile Ser Glu Ser Lys Lys Pro Val Leu

290 295 300

Tyr Val Gly Gly Gly Cys Leu Asn Ser Ser Asp Glu Leu Gly Arg Phe

305 310 315 320

Val Glu Leu Thr Gly Ile Pro Val Ala Ser Thr Leu Met Gly Leu Gly

325 330 335

Ser Tyr Pro Cys Asp Asp Glu Leu Ser Leu His Met Leu Gly Met His

340 345 350

Gly Thr Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Glu His Ser Asp Leu Leu Leu

355 360 365

Ala Phe Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys Leu Glu Ala

370 375 380

Phe Ala Ser Arg Ala Lys Ile Val His Ile Asp Ile Asp Ser Ala Glu

385 390 395 400

Ile Gly Lys Asn Lys Thr Pro His Val Ser Val Cys Gly Asp Val Lys

405 410 415

Leu Ala Leu Gln Gly Met Asn Lys Val Leu Glu Asn Arg Ala Glu Glu

420 425 430

Leu Lys Leu Asp Phe Gly Val Trp Arg Asn Glu Leu Asn Val Gln Lys

435 440 445

Gln Lys Phe Pro Leu Ser Phe Lys Thr Phe Gly Glu Ala Ile Pro Pro

450 455 460

Gln Tyr Ala Ile Lys Val Leu Asp Glu Leu Thr Asp Gly Lys Ala Ile

465 470 475 480

Ile Ser Thr Gly Val Gly Gln His Gln Met Trp Ala Ala Gln Phe Tyr

485 490 495

Asn Tyr Lys Lys Pro Arg Gln Trp Leu Ser Ser Gly Gly Leu Gly Ala

500 505 510

Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ile Gly Ala Ser Val Ala Asn Pro

515 520 525

Asp Ala Ile Val Val Asp Ile Asp Gly Asp Gly Ser Phe Ile Met Asn

530 535 540

Val Gln Glu Leu Ala Thr Ile Arg Val Glu Asn Leu Pro Val Lys Val

545 550 555 560

Leu Leu Leu Asn Asn Gln His Leu Gly Met Val Met Gln Trp Glu Asp

565 570 575

Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr Phe Leu Gly Asp Pro Ala

580 585 590

Gln Glu Asp Glu Ile Phe Pro Asn Met Leu Leu Phe Ala Ala Ala Cys

595 600 605

Gly Ile Pro Ala Ala Arg Val Thr Lys Lys Ala Asp Leu Arg Glu Ala

610 615 620

Ile Gln Thr Met Leu Asp Thr Pro Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Val Ile

625 630 635 640

Cys Pro His Gln Glu His Val Leu Pro Met Ile Pro Ser Gly Gly Thr

645 650 655

Phe Asn Asp Val Ile Thr Glu Gly Asp Gly Arg Ile Lys Tyr

660 665 670

<210> 2

<211> 2013

<212> ДНК

<213> ДНК последовательность гена ALS Arabidopsis thaliana (ДНК

последовательность)

<400> 2

atggcggcgg caacaacaac aacaacaaca tcttcttcga tctccttctc caccaaacca 60

tctccttcct cctccaaatc accattacca atctccagat tctccctccc attctcccta 120

aaccccaaca aatcatcctc ctcctcccgc cgccgcggta tcaaatccag ctctccctcc 180

tccatctccg ccgtgctcaa cacaaccacc aatgtcacaa ccactccctc tccaaccaaa 240

cctaccaaac ccgaaacatt catctcccga ttcgctccag atcaaccccg caaaggcgct 300

gatatcctcg tcgaagcttt agaacgtcaa ggcgtagaaa ccgtattcgc ttaccctgga 360

ggtgcatcaa tggagattca ccaagcctta acccgctctt cctcaatccg taacgtcctt 420

cctcgtcacg aacaaggagg tgtattcgca gcagaaggat acgctcgatc ctcaggtaaa 480

ccaggtatct gtatagccac ttcaggtccc ggagctacaa atctcgttag cggattagcc 540

gatgcgttgt tagatagtgt tcctcttgta gcaatcacag gacaagtccc tcgtcgtatg 600

attggtacag atgcgtttca agagactccg attgttgagg taacgcgttc gattacgaag 660

cataactatc ttgtgatgga tgttgaagat atccctagga ttattgagga agctttcttt 720

ttagctactt ctggtagacc tggacctgtt ttggttgatg ttcctaaaga tattcaacaa 780

cagcttgcga ttcctaattg ggaacaggct atgagattac ctggttatat gtctaggatg 840

cctaaacctc cggaagattc tcatttggag cagattgtta ggttgatttc tgagtctaag 900

aagcctgtgt tgtatgttgg tggtggttgt ttgaattcta gcgatgaatt gggtaggttt 960

gttgagctta cggggatccc tgttgcgagt acgttgatgg ggctgggatc ttatccttgt 1020

gatgatgagt tgtcgttaca tatgcttgga atgcatggga ctgtgtatgc aaattacgct 1080

gtggagcata gtgatttgtt gttggcgttt ggggtaaggt ttgatgatcg tgtcacgggt 1140

aagcttgagg cttttgctag tagggctaag attgttcata ttgatattga ctcggctgag 1200

attgggaaga ataagactcc tcatgtgtct gtgtgtggtg atgttaagct ggctttgcaa 1260

gggatgaata aggttcttga gaaccgagcg gaggagctta agcttgattt tggagtttgg 1320

aggaatgagt tgaacgtaca gaaacagaag tttccgttga gctttaagac gtttggggaa 1380

gctattcctc cacagtatgc gattaaggtc cttgatgagt tgactgatgg aaaagccata 1440

ataagtactg gtgtcgggca acatcaaatg tgggcggcgc agttctacaa ttacaagaaa 1500

ccaaggcagt ggctatcatc aggaggcctt ggagctatgg gatttggact tcctgctgcg 1560

attggagcgt ctgttgctaa ccctgatgcg atagttgtgg atattgacgg agatggaagc 1620

tttataatga atgtgcaaga gctagccact attcgtgtag agaatcttcc agtgaaggta 1680

cttttattaa acaaccagca tcttggcatg gttatgcaat gggaagatcg gttctacaaa 1740

gctaaccgag ctcacacatt tctcggggat ccggctcagg aggacgagat attcccgaac 1800

atgttgctgt ttgcagcagc ttgcgggatt ccagcggcga gggtgacaaa gaaagcagat 1860

ctccgagaag ctattcagac aatgctggat acaccaggac cttacctgtt ggatgtgatt 1920

tgtccgcacc aagaacatgt gttgccgatg atcccgagtg gtggcacttt caacgatgtc 1980

ataacggaag gagatggccg gattaaatac tga 2013

<210> 3

<211> 2320

<212> БЕЛОК

<213> Аминокислотная последовательность белка ACCase Alopecurus

myosuroides (аминокислотная последовательность)

<400> 3

Met Gly Ser Thr His Leu Pro Ile Val Gly Phe Asn Ala Ser Thr Thr

1 5 10 15

Pro Ser Leu Ser Thr Leu Arg Gln Ile Asn Ser Ala Ala Ala Ala Phe

20 25 30

Gln Ser Ser Ser Pro Ser Arg Ser Ser Lys Lys Lys Ser Arg Arg Val

35 40 45

Lys Ser Ile Arg Asp Asp Gly Asp Gly Ser Val Pro Asp Pro Ala Gly

50 55 60

His Gly Gln Ser Ile Arg Gln Gly Leu Ala Gly Ile Ile Asp Leu Pro

65 70 75 80

Lys Glu Gly Ala Ser Ala Pro Asp Val Asp Ile Ser His Gly Ser Glu

85 90 95

Asp His Lys Ala Ser Tyr Gln Met Asn Gly Ile Leu Asn Glu Ser His

100 105 110

Asn Gly Arg His Ala Ser Leu Ser Lys Val Tyr Glu Phe Cys Thr Glu

115 120 125

Leu Gly Gly Lys Thr Pro Ile His Ser Val Leu Val Ala Asn Asn Gly

130 135 140

Met Ala Ala Ala Lys Phe Met Arg Ser Val Arg Thr Trp Ala Asn Asp

145 150 155 160

Thr Phe Gly Ser Glu Lys Ala Ile Gln Leu Ile Ala Met Ala Thr Pro

165 170 175

Glu Asp Met Arg Ile Asn Ala Glu His Ile Arg Ile Ala Asp Gln Phe

180 185 190

Val Glu Val Pro Gly Gly Thr Asn Asn Asn Asn Tyr Ala Asn Val Gln

195 200 205

Leu Ile Val Glu Ile Ala Glu Arg Thr Gly Val Ser Ala Val Trp Pro

210 215 220

Gly Trp Gly His Ala Ser Glu Asn Pro Glu Leu Pro Asp Ala Leu Thr

225 230 235 240

Ala Lys Gly Ile Val Phe Leu Gly Pro Pro Ala Ser Ser Met Asn Ala

245 250 255

Leu Gly Asp Lys Val Gly Ser Ala Leu Ile Ala Gln Ala Ala Gly Val

260 265 270

Pro Thr Leu Ala Trp Ser Gly Ser His Val Glu Ile Pro Leu Glu Leu

275 280 285

Cys Leu Asp Ser Ile Pro Glu Glu Met Tyr Arg Lys Ala Cys Val Thr

290 295 300

Thr Ala Asp Glu Ala Val Ala Ser Cys Gln Met Ile Gly Tyr Pro Ala

305 310 315 320

Met Ile Lys Ala Ser Trp Gly Gly Gly Gly Lys Gly Ile Arg Lys Val

325 330 335

Asn Asn Asp Asp Glu Val Lys Ala Leu Phe Lys Gln Val Gln Gly Glu

340 345 350

Val Pro Gly Ser Pro Ile Phe Ile Met Arg Leu Ala Ser Gln Ser Arg

355 360 365

His Leu Glu Val Gln Leu Leu Cys Asp Glu Tyr Gly Asn Val Ala Ala

370 375 380

Leu His Ser Arg Asp Cys Ser Val Gln Arg Arg His Gln Lys Ile Ile

385 390 395 400

Glu Glu Gly Pro Val Thr Val Ala Pro Arg Glu Thr Val Lys Glu Leu

405 410 415

Glu Gln Ala Ala Arg Arg Leu Ala Lys Ala Val Gly Tyr Val Gly Ala

420 425 430

Ala Thr Val Glu Tyr Leu Tyr Ser Met Glu Thr Gly Glu Tyr Tyr Phe

435 440 445

Leu Glu Leu Asn Pro Arg Leu Gln Val Glu His Pro Val Thr Glu Ser

450 455 460

Ile Ala Glu Val Asn Leu Pro Ala Ala Gln Val Ala Val Gly Met Gly

465 470 475 480

Ile Pro Leu Trp Gln Ile Pro Glu Ile Arg Arg Phe Tyr Gly Met Asp

485 490 495

Asn Gly Gly Gly Tyr Asp Ile Trp Arg Lys Thr Ala Ala Leu Ala Thr

500 505 510

Pro Phe Asn Phe Asp Glu Val Asp Ser Gln Trp Pro Lys Gly His Cys

515 520 525

Val Ala Val Arg Ile Thr Ser Glu Asn Pro Asp Asp Gly Phe Lys Pro

530 535 540

Thr Gly Gly Lys Val Lys Glu Ile Ser Phe Lys Ser Lys Pro Asn Val

545 550 555 560

Trp Gly Tyr Phe Ser Val Lys Ser Gly Gly Gly Ile His Glu Phe Ala

565 570 575

Asp Ser Gln Phe Gly His Val Phe Ala Tyr Gly Glu Thr Arg Ser Ala

580 585 590

Ala Ile Thr Ser Met Ser Leu Ala Leu Lys Glu Ile Gln Ile Arg Gly

595 600 605

Glu Ile His Thr Asn Val Asp Tyr Thr Val Asp Leu Leu Asn Ala Pro

610 615 620

Asp Phe Arg Glu Asn Thr Ile His Thr Gly Trp Leu Asp Thr Arg Ile

625 630 635 640

Ala Met Arg Val Gln Ala Glu Arg Pro Pro Trp Tyr Ile Ser Val Val

645 650 655

Gly Gly Ala Leu Tyr Lys Thr Ile Thr Thr Asn Ala Glu Thr Val Ser

660 665 670

Glu Tyr Val Ser Tyr Leu Ile Lys Gly Gln Ile Pro Pro Lys His Ile

675 680 685

Ser Leu Val His Ser Thr Ile Ser Leu Asn Ile Glu Glu Ser Lys Tyr

690 695 700

Thr Ile Glu Ile Val Arg Ser Gly Gln Gly Ser Tyr Arg Leu Arg Leu

705 710 715 720

Asn Gly Ser Leu Ile Glu Ala Asn Val Gln Thr Leu Cys Asp Gly Gly

725 730 735

Leu Leu Met Gln Leu Asp Gly Asn Ser His Val Ile Tyr Ala Glu Glu

740 745 750

Glu Ala Gly Gly Thr Arg Leu Leu Ile Asp Gly Lys Thr Cys Leu Leu

755 760 765

Gln Asn Asp His Asp Pro Ser Arg Leu Leu Ala Glu Thr Pro Cys Lys

770 775 780

Leu Leu Arg Phe Leu Ile Ala Asp Gly Ala His Val Asp Ala Asp Val

785 790 795 800

Pro Tyr Ala Glu Val Glu Val Met Lys Met Cys Met Pro Leu Leu Ser

805 810 815

Pro Ala Ala Gly Val Ile Asn Val Leu Leu Ser Glu Gly Gln Ala Met

820 825 830

Gln Ala Gly Asp Leu Ile Ala Arg Leu Asp Leu Asp Asp Pro Ser Ala

835 840 845

Val Lys Arg Ala Glu Pro Phe Glu Gly Ser Phe Pro Glu Met Ser Leu

850 855 860

Pro Ile Ala Ala Ser Gly Gln Val His Lys Arg Cys Ala Ala Ser Leu

865 870 875 880

Asn Ala Ala Arg Met Val Leu Ala Gly Tyr Asp His Ala Ala Asn Lys

885 890 895

Val Val Gln Asp Leu Val Trp Cys Leu Asp Thr Pro Ala Leu Pro Phe

900 905 910

Leu Gln Trp Glu Glu Leu Met Ser Val Leu Ala Thr Arg Leu Pro Arg

915 920 925

Arg Leu Lys Ser Glu Leu Glu Gly Lys Tyr Asn Glu Tyr Lys Leu Asn

930 935 940

Val Asp His Val Lys Ile Lys Asp Phe Pro Thr Glu Met Leu Arg Glu

945 950 955 960

Thr Ile Glu Glu Asn Leu Ala Cys Val Ser Glu Lys Glu Met Val Thr

965 970 975

Ile Glu Arg Leu Val Asp Pro Leu Met Ser Leu Leu Lys Ser Tyr Glu

980 985 990

Gly Gly Arg Glu Ser His Ala His Phe Ile Val Lys Ser Leu Phe Glu

995 1000 1005

Glu Tyr Leu Ser Val Glu Glu Leu Phe Ser Asp Gly Ile Gln Ser Asp

1010 1015 1020

Val Ile Glu Arg Leu Arg Leu Gln Tyr Ser Lys Asp Leu Gln Lys Val

1025 1030 1035 1040

Val Asp Ile Val Leu Ser His Gln Gly Val Arg Asn Lys Thr Lys Leu

1045 1050 1055

Ile Leu Ala Leu Met Glu Lys Leu Val Tyr Pro Asn Pro Ala Ala Tyr

1060 1065 1070

Arg Asp Gln Leu Ile Arg Phe Ser Ser Leu Asn His Lys Arg Tyr Tyr

1075 1080 1085

Lys Leu Ala Leu Lys Ala Ser Glu Leu Leu Glu Gln Thr Lys Leu Ser

1090 1095 1100

Glu Leu Arg Thr Ser Ile Ala Arg Asn Leu Ser Ala Leu Asp Met Phe

1105 1110 1115 1120

Thr Glu Glu Lys Ala Asp Phe Ser Leu Gln Asp Arg Lys Leu Ala Ile

1125 1130 1135

Asn Glu Ser Met Gly Asp Leu Val Thr Ala Pro Leu Pro Val Glu Asp

1140 1145 1150

Ala Leu Val Ser Leu Phe Asp Cys Thr Asp Gln Thr Leu Gln Gln Arg

1155 1160 1165

Val Ile Gln Thr Tyr Ile Ser Arg Leu Tyr Gln Pro Gln Leu Val Lys

1170 1175 1180

Asp Ser Ile Gln Leu Lys Tyr Gln Asp Ser Gly Val Ile Ala Leu Trp

1185 1190 1195 1200

Glu Phe Thr Glu Gly Asn His Glu Lys Arg Leu Gly Ala Met Val Ile

1205 1210 1215

Leu Lys Ser Leu Glu Ser Val Ser Thr Ala Ile Gly Ala Ala Leu Lys

1220 1225 1230

Asp Ala Ser His Tyr Ala Ser Ser Ala Gly Asn Thr Val His Ile Ala

1235 1240 1245

Leu Leu Asp Ala Asp Thr Gln Leu Asn Thr Thr Glu Asp Ser Gly Asp

1250 1255 1260

Asn Asp Gln Ala Gln Asp Lys Met Asp Lys Leu Ser Phe Val Leu Lys

1265 1270 1275 1280

Gln Asp Val Val Met Ala Asp Leu Arg Ala Ala Asp Val Lys Val Val

1285 1290 1295

Ser Cys Ile Val Gln Arg Asp Gly Ala Ile Met Pro Met Arg Arg Thr

1300 1305 1310

Phe Leu Leu Ser Glu Glu Lys Leu Cys Tyr Glu Glu Glu Pro Ile Leu

1315 1320 1325

Arg His Val Glu Pro Pro Leu Ser Ala Leu Leu Glu Leu Asp Lys Leu

1330 1335 1340

Lys Val Lys Gly Tyr Asn Glu Met Lys Tyr Thr Pro Ser Arg Asp Arg

1345 1350 1355 1360

Gln Trp His Ile Tyr Thr Leu Arg Asn Thr Glu Asn Pro Lys Met Leu

1365 1370 1375

His Arg Val Phe Phe Arg Thr Leu Val Arg Gln Pro Ser Ala Gly Asn

1380 1385 1390

Arg Phe Thr Ser Asp His Ile Thr Asp Val Glu Val Gly His Ala Glu

1395 1400 1405

Glu Pro Leu Ser Phe Thr Ser Ser Ser Ile Leu Lys Ser Leu Lys Ile

1410 1415 1420

Ala Lys Glu Glu Leu Glu Leu His Ala Ile Arg Thr Gly His Ser His

1425 1430 1435 1440

Met Tyr Leu Cys Ile Leu Lys Glu Gln Lys Leu Leu Asp Leu Val Pro

1445 1450 1455

Val Ser Gly Asn Thr Val Val Asp Val Gly Gln Asp Glu Ala Thr Ala

1460 1465 1470

Cys Ser Leu Leu Lys Glu Met Ala Leu Lys Ile His Glu Leu Val Gly

1475 1480 1485

Ala Arg Met His His Leu Ser Val Cys Gln Trp Glu Val Lys Leu Lys

1490 1495 1500

Leu Val Ser Asp Gly Pro Ala Ser Gly Ser Trp Arg Val Val Thr Thr

1505 1510 1515 1520

Asn Val Thr Gly His Thr Cys Thr Val Asp Ile Tyr Arg Glu Val Glu

1525 1530 1535

Asp Thr Glu Ser Gln Lys Leu Val Tyr His Ser Thr Ala Leu Ser Ser

1540 1545 1550

Gly Pro Leu His Gly Val Ala Leu Asn Thr Ser Tyr Gln Pro Leu Ser

1555 1560 1565

Val Ile Asp Leu Lys Arg Cys Ser Ala Arg Asn Asn Lys Thr Thr Tyr

1570 1575 1580

Cys Tyr Asp Phe Pro Leu Thr Phe Glu Ala Ala Val Gln Lys Ser Trp

1585 1590 1595 1600

Ser Asn Ile Ser Ser Glu Asn Asn Gln Cys Tyr Val Lys Ala Thr Glu

1605 1610 1615

Leu Val Phe Ala Glu Lys Asn Gly Ser Trp Gly Thr Pro Ile Ile Pro

1620 1625 1630

Met Gln Arg Ala Ala Gly Leu Asn Asp Ile Gly Met Val Ala Trp Ile

1635 1640 1645

Leu Asp Met Ser Thr Pro Glu Phe Pro Ser Gly Arg Gln Ile Ile Val

1650 1655 1660

Ile Ala Asn Asp Ile Thr Phe Arg Ala Gly Ser Phe Gly Pro Arg Glu

1665 1670 1675 1680

Asp Ala Phe Phe Glu Ala Val Thr Asn Leu Ala Cys Glu Lys Lys Leu

1685 1690 1695

Pro Leu Ile Tyr Leu Ala Ala Asn Ser Gly Ala Arg Ile Gly Ile Ala

1700 1705 1710

Asp Glu Val Lys Ser Cys Phe Arg Val Gly Trp Thr Asp Asp Ser Ser

1715 1720 1725

Pro Glu Arg Gly Phe Arg Tyr Ile Tyr Met Thr Asp Glu Asp His Asp

1730 1735 1740

Arg Ile Gly Ser Ser Val Ile Ala His Lys Met Gln Leu Asp Ser Gly

1745 1750 1755 1760

Glu Ile Arg Trp Val Ile Asp Ser Val Val Gly Lys Glu Asp Gly Leu

1765 1770 1775

Gly Val Glu Asn Ile His Gly Ser Ala Ala Ile Ala Ser Ala Tyr Ser

1780 1785 1790

Arg Ala Tyr Glu Glu Thr Phe Thr Leu Thr Phe Val Thr Gly Arg Thr

1795 1800 1805

Val Gly Ile Gly Ala Tyr Leu Ala Arg Leu Gly Ile Arg Cys Ile Gln

1810 1815 1820

Arg Ile Asp Gln Pro Ile Ile Leu Thr Gly Phe Ser Ala Leu Asn Lys

1825 1830 1835 1840

Leu Leu Gly Arg Glu Val Tyr Ser Ser His Met Gln Leu Gly Gly Pro

1845 1850 1855

Lys Ile Met Ala Thr Asn Gly Val Val His Leu Thr Val Pro Asp Asp

1860 1865 1870

Leu Glu Gly Val Ser Asn Ile Leu Arg Trp Leu Ser Tyr Val Pro Ala

1875 1880 1885

Asn Ile Gly Gly Pro Leu Pro Ile Thr Lys Ser Leu Asp Pro Ile Asp

1890 1895 1900

Arg Pro Val Ala Tyr Ile Pro Glu Asn Thr Cys Asp Pro Arg Ala Ala

1905 1910 1915 1920

Ile Ser Gly Ile Asp Asp Ser Gln Gly Lys Trp Leu Gly Gly Met Phe

1925 1930 1935

Asp Lys Asp Ser Phe Val Glu Thr Phe Glu Gly Trp Ala Lys Thr Val

1940 1945 1950

Val Thr Gly Arg Ala Lys Leu Gly Gly Ile Pro Val Gly Val Ile Ala

1955 1960 1965

Val Glu Thr Gln Thr Met Met Gln Leu Val Pro Ala Asp Pro Gly Gln

1970 1975 1980

Pro Asp Ser His Glu Arg Ser Val Pro Arg Ala Gly Gln Val Trp Phe

1985 1990 1995 2000

Pro Asp Ser Ala Thr Lys Thr Ala Gln Ala Met Leu Asp Phe Asn Arg

2005 2010 2015

Glu Gly Leu Pro Leu Phe Ile Leu Ala Asn Trp Arg Gly Phe Ser Gly

2020 2025 2030

Gly Gln Arg Asp Leu Phe Glu Gly Ile Leu Gln Ala Gly Ser Thr Ile

2035 2040 2045

Val Glu Asn Leu Arg Thr Tyr Asn Gln Pro Ala Phe Val Tyr Ile Pro

2050 2055 2060

Lys Ala Ala Glu Leu Arg Gly Gly Ala Trp Val Val Ile Asp Ser Lys

2065 2070 2075 2080

Ile Asn Pro Asp Arg Ile Glu Cys Tyr Ala Glu Arg Thr Ala Lys Gly

2085 2090 2095

Asn Val Leu Glu Pro Gln Gly Leu Ile Glu Ile Lys Phe Arg Ser Glu

2100 2105 2110

Glu Leu Lys Glu Cys Met Gly Arg Leu Asp Pro Glu Leu Ile Asp Leu

2115 2120 2125

Lys Ala Arg Leu Gln Gly Ala Asn Gly Ser Leu Ser Asp Gly Glu Ser

2130 2135 2140

Leu Gln Lys Ser Ile Glu Ala Arg Lys Lys Gln Leu Leu Pro Leu Tyr

2145 2150 2155 2160

Thr Gln Ile Ala Val Arg Phe Ala Glu Leu His Asp Thr Ser Leu Arg

2165 2170 2175

Met Ala Ala Lys Gly Val Ile Arg Lys Val Val Asp Trp Glu Asp Ser

2180 2185 2190

Arg Ser Phe Phe Tyr Lys Arg Leu Arg Arg Arg Leu Ser Glu Asp Val

2195 2200 2205

Leu Ala Lys Glu Ile Arg Gly Val Ile Gly Glu Lys Phe Pro His Lys

2210 2215 2220

Ser Ala Ile Glu Leu Ile Lys Lys Trp Tyr Leu Ala Ser Glu Ala Ala

2225 2230 2235 2240

Ala Ala Gly Ser Thr Asp Trp Asp Asp Asp Asp Ala Phe Val Ala Trp

2245 2250 2255

Arg Glu Asn Pro Glu Asn Tyr Lys Glu Tyr Ile Lys Glu Leu Arg Ala

2260 2265 2270

Gln Arg Val Ser Arg Leu Leu Ser Asp Val Ala Gly Ser Ser Ser Asp

2275 2280 2285

Leu Gln Ala Leu Pro Gln Gly Leu Ser Met Leu Leu Asp Lys Met Asp

2290 2295 2300

Pro Ser Lys Arg Ala Gln Phe Ile Glu Glu Val Met Lys Val Leu Lys

2305 2310 2315 2320

<210> 4

<211> 6963

<212> ДНК

<213> ДНК последовательность гена ACCase Alopecurus myosuroides

(ДНК последовательность)

<400> 4

atgggatcca cacatctgcc cattgtcggg tttaatgcat ccacaacacc atcgctatcc 60

actcttcgcc agataaactc agctgctgct gcattccaat cttcgtcccc ttcaaggtca 120

tccaagaaga aaagccgacg tgttaagtca ataagggatg atggcgatgg aagcgtgcca 180

gaccctgcag gccatggcca gtctattcgc caaggtctcg ctggcatcat cgacctccca 240

aaggagggcg catcagctcc agatgtggac atttcacatg ggtctgaaga ccacaaggcc 300

tcctaccaaa tgaatgggat actgaatgaa tcacataacg ggaggcacgc ctctctgtct 360

aaagtttatg aattttgcac ggaattgggt ggaaaaacac caattcacag tgtattagtc 420

gccaacaatg gaatggcagc agctaagttc atgcggagtg tccggacatg ggctaatgat 480

acatttgggt cagagaaggc gattcagttg atagctatgg caactccgga agacatgaga 540

ataaatgcag agcacattag aattgctgat cagtttgttg aagtacctgg tggaacaaac 600

aataacaact atgcaaatgt ccaactcata gtggagatag cagagagaac tggtgtctcc 660

gccgtttggc ctggttgggg ccatgcatct gagaatcctg aacttccaga tgcactaact 720

gcaaaaggaa ttgtttttct tgggccacca gcatcatcaa tgaacgcact aggcgacaag 780

gttggttcag ctctcattgc tcaagcagca ggggttccca ctcttgcttg gagtggatca 840

catgtggaaa ttccattaga actttgtttg gactcgatac ctgaggagat gtataggaaa 900

gcctgtgtta caaccgctga tgaagcagtt gcaagttgtc agatgattgg ttaccctgcc 960

atgatcaagg catcctgggg tggtggtggt aaagggatta gaaaggttaa taatgatgac 1020

gaggtgaaag cactgtttaa gcaagtacag ggtgaagttc ctggctcccc gatatttatc 1080

atgagacttg catctcagag tcgtcatctt gaagtccagc tgctttgtga tgaatatggc 1140

aatgtagcag cacttcacag tcgtgattgc agtgtgcaac gacgacacca aaagattatc 1200

gaggaaggac cagttactgt tgctcctcgt gaaacagtga aagagctaga gcaagcagca 1260

aggaggcttg ctaaggccgt gggttacgtc ggtgctgcta ctgttgaata tctctacagc 1320

atggagactg gtgaatacta ttttctggag cttaatccac ggttgcaggt tgagcaccca 1380

gtcaccgagt cgatagctga agtaaatttg cctgcagccc aagttgcagt tgggatgggt 1440

ataccccttt ggcagattcc agagatcaga cgtttctacg gaatggacaa tggaggaggc 1500

tatgatattt ggaggaaaac agcagctctc gctactccat tcaactttga tgaagtagat 1560

tctcaatggc cgaagggtca ttgtgtggca gttaggataa ccagtgagaa tccagatgat 1620

ggattcaagc ctactggtgg aaaagtaaag gagataagtt ttaaaagtaa gccaaatgtc 1680

tggggatatt tctcagttaa gtctggtgga ggcattcatg aatttgcgga ttctcagttt 1740

ggacacgttt ttgcctatgg agagactaga tcagcagcaa taaccagcat gtctcttgca 1800

ctaaaagaga ttcaaattcg tggagaaatt catacaaacg ttgattacac ggttgatctc 1860

ttgaatgccc cagacttcag agaaaacacg atccataccg gttggctgga taccagaata 1920

gctatgcgtg ttcaagctga gaggcctccc tggtatattt cagtggttgg aggagctcta 1980

tataaaacaa taaccaccaa tgcggagacc gtttctgaat atgttagcta tctcatcaag 2040

ggtcagattc caccaaagca catatccctt gtccattcaa ctatttcttt gaatatagag 2100

gaaagcaaat atacaattga gattgtgagg agtggacagg gtagctacag attgagactg 2160

aatggatcac ttattgaagc caatgtacaa acattatgtg atggaggcct tttaatgcag 2220

ctggatggaa atagccatgt tatttatgct gaagaagaag cgggtggtac acggcttctt 2280

attgatggaa aaacatgctt gctacagaat gaccatgatc cgtcaaggtt attagctgag 2340

acaccctgca aacttcttcg tttcttgatt gccgatggtg ctcatgttga tgctgatgta 2400

ccatacgcgg aagttgaggt tatgaagatg tgcatgcccc tcttgtcgcc tgctgctggt 2460

gtcattaatg ttttgttgtc tgagggccag gcgatgcagg ctggtgatct tatagcgaga 2520

cttgatctcg atgacccttc tgctgtgaag agagccgagc catttgaagg atcttttcca 2580

gaaatgagcc ttcctattgc tgcttctggc caagttcaca aaagatgtgc tgcaagtttg 2640

aacgctgctc gaatggtcct tgcaggatat gaccatgcgg ccaacaaagt tgtgcaagat 2700

ttggtatggt gccttgatac acctgctctt cctttcctac aatgggaaga gcttatgtct 2760

gttttagcaa ctagacttcc aagacgtctt aagagcgagt tggagggcaa atacaatgaa 2820

tacaagttaa atgttgacca tgtgaagatc aaggatttcc ctaccgagat gcttagagag 2880

acaatcgagg aaaatcttgc atgtgtttcc gagaaggaaa tggtgacaat tgagaggctt 2940

gttgaccctc tgatgagcct gctgaagtca tacgagggtg ggagagaaag ccatgcccac 3000

tttattgtca agtccctttt tgaggagtat ctctcggttg aggaactatt cagtgatggc 3060

attcagtctg acgtgattga acgcctgcgc ctacaatata gtaaagacct ccagaaggtt 3120

gtagacattg ttttgtctca ccagggtgtg agaaacaaaa caaagctgat actcgcgctc 3180

atggagaaac tggtctatcc aaaccctgct gcctacagag atcagttgat tcgcttttct 3240

tccctcaacc ataaaagata ttataagttg gctcttaaag ctagtgaact tcttgaacaa 3300

accaagctca gcgaactccg cacaagcatt gcaaggaacc tttcagcgct ggatatgttc 3360

accgaggaaa aggcagattt ctccttgcaa gacagaaaat tggccattaa tgagagcatg 3420

ggagatttag tcactgcccc actgccagtt gaagatgcac ttgtttcttt gtttgattgt 3480

actgatcaaa ctcttcagca gagagtgatt cagacataca tatctcgatt ataccagcct 3540

caacttgtga aggatagcat ccagctgaaa tatcaggatt ctggtgttat tgctttatgg 3600

gaattcactg aaggaaatca tgagaagaga ttgggtgcta tggttatcct gaagtcacta 3660

gaatctgtgt caacagccat tggagctgct ctaaaggatg catcacatta tgcaagctct 3720

gcgggcaaca cggtgcatat tgctttgttg gatgctgata cccaactgaa tacaactgaa 3780

gatagtggtg ataatgacca agctcaagac aagatggata aactttcttt tgtactgaaa 3840

caagatgttg tcatggctga tctacgtgct gctgatgtca aggttgttag ttgcattgtt 3900

caaagagatg gagcaatcat gcctatgcgc cgtaccttcc tcttgtcaga ggaaaaactt 3960

tgttacgagg aagagccgat tcttcggcat gtggagcctc cactttctgc acttcttgag 4020

ttggataaat tgaaagtgaa aggatacaat gagatgaagt atacaccgtc acgtgatcgt 4080

cagtggcata tatacacact tagaaatact gaaaatccaa aaatgctgca cagggtattt 4140

ttccgaacac ttgtcagaca acccagtgca ggcaacaggt ttacatcaga ccatatcact 4200

gatgttgaag taggacacgc agaggaacct ctttcattta cttcaagcag catattaaaa 4260

tcgttgaaga ttgctaaaga agaattggag cttcacgcga tcaggactgg ccattctcat 4320

atgtacttgt gcatattgaa agagcaaaag cttcttgacc ttgttcctgt ttcagggaac 4380

actgttgtgg atgttggtca agatgaagct actgcatgct ctcttttgaa agaaatggct 4440

ttaaagatac atgaacttgt tggtgcaaga atgcatcatc tttctgtatg ccagtgggaa 4500

gtgaaactta agttggtgag cgatgggcct gccagtggta gctggagagt tgtaacaacc 4560

aatgttactg gtcacacctg cactgtggat atctaccggg aggtcgaaga tacagaatca 4620

cagaaactag tataccactc caccgcattg tcatctggtc ctttgcatgg tgttgcactg 4680

aatacttcgt atcagccttt gagtgttatt gatttaaaac gttgctctgc caggaacaac 4740

aaaactacat actgctatga ttttccattg acatttgaag ctgcagtgca gaagtcgtgg 4800

tctaacattt ccagtgaaaa caaccaatgt tatgttaaag cgacagagct tgtgtttgct 4860

gaaaagaatg ggtcgtgggg cactcctata attcctatgc agcgtgctgc tgggctgaat 4920

gacattggta tggtagcctg gatcttggac atgtccactc ctgaatttcc cagcggcaga 4980

cagatcattg ttatcgcaaa tgatattaca tttagagctg gatcatttgg cccaagggaa 5040

gatgcatttt tcgaagctgt aaccaacctg gcttgtgaga agaagcttcc acttatctac 5100

ttggctgcaa actctggtgc tcggattggc attgctgatg aagtaaaatc ttgcttccgt 5160

gttggatgga ctgatgatag cagccctgaa cgtggattta ggtacattta tatgactgac 5220

gaagaccatg atcgtattgg ctcttcagtt atagcacaca agatgcagct agatagtggc 5280

gagatcaggt gggttattga ttctgttgtg ggaaaagagg atggactagg tgtggagaac 5340

atacatggaa gtgctgctat tgccagtgcc tattctaggg cgtacgagga gacatttaca 5400

cttacattcg ttactggacg aactgttgga atcggagcct atcttgctcg acttggcata 5460

cggtgcatac agcgtattga ccagcccatt attttgaccg ggttttctgc cctgaacaag 5520

cttcttgggc gggaggtgta cagctcccac atgcagttgg gtggtcccaa aatcatggcg 5580

acgaatggtg ttgtccatct gactgttcca gatgaccttg aaggtgtttc taatatattg 5640

aggtggctca gctatgttcc tgcaaacatt ggtggacctc ttcctattac aaaatctttg 5700

gacccaatag acagacccgt tgcatacatc cctgagaata catgtgatcc tcgtgcagcc 5760

atcagtggca ttgatgacag ccaagggaaa tggttgggtg gcatgtttga caaagacagt 5820

tttgtggaga catttgaagg atgggcgaag acagtagtta ctggcagagc aaaacttgga 5880

gggattcctg ttggtgttat agctgtggag acacagacca tgatgcagct cgtccccgct 5940

gatccaggcc agcctgattc ccacgagcgg tctgttcctc gtgctgggca agtttggttt 6000

ccagattctg ctaccaagac agcgcaggcg atgttggact tcaaccgtga aggattacct 6060

ctgttcatac ttgctaactg gagaggcttc tctggagggc aaagagatct ttttgaagga 6120

attctgcagg ctgggtcaac aattgttgag aaccttagga catacaatca gcctgccttt 6180

gtatatatcc ccaaggctgc agagctacgt ggaggagcct gggtcgtgat tgatagcaag 6240

ataaacccag atcgcatcga gtgctatgct gagaggactg caaagggtaa tgttctcgaa 6300

cctcaagggt tgattgagat caagttcagg tcagaggaac tcaaagaatg catgggtagg 6360

cttgatccag aattgataga tctgaaagca agactccagg gagcaaatgg aagcctatct 6420

gatggagaat cccttcagaa gagcatagaa gctcggaaga aacagttgct gcctctgtac 6480

acccaaatcg cggtacgttt tgcggaattg cacgacactt cccttagaat ggctgctaaa 6540

ggtgtgatca ggaaagttgt agactgggaa gactctcggt ctttcttcta caagagatta 6600

cggaggaggc tatccgagga cgttctggca aaggagatta gaggtgtaat tggtgagaag 6660

tttcctcaca aatcagcgat cgagctgatc aagaaatggt acttggcttc tgaggcagct 6720

gcagcaggaa gcaccgactg ggatgacgac gatgcttttg tcgcctggag ggagaaccct 6780

gaaaactata aggagtatat caaagagctt agggctcaaa gggtatctcg gttgctctca 6840

gatgttgcag gctccagttc ggatttacaa gccttgccgc agggtctttc catgctacta 6900

gataagatgg atccctctaa gagagcacag tttatcgagg aggtcatgaa ggtcctgaaa 6960

tga 6963

<210> 5

<211> 446

<212> БЕЛОК

<213> Аминокислотная последовательность белка HPPD Oryza sativa L.

(аминокислотная последовательность)

<400> 5

Met Pro Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ala Thr Thr Gly Ala Val Ser Ala

1 5 10 15

Ala Ala Ala Ala Gly Glu Asn Ala Gly Phe Arg Leu Val Gly His Arg

20 25 30

Arg Phe Val Arg Ala Asn Pro Arg Ser Asp Arg Phe Gln Ala Leu Ala

35 40 45

Phe His His Val Glu Leu Trp Cys Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala Gly

50 55 60

Arg Phe Ala Phe Ala Leu Gly Ala Pro Leu Ala Ala Arg Ser Asp Leu

65 70 75 80

Ser Thr Gly Asn Ser Ala His Ala Ser Leu Leu Leu Arg Ser Ala Ser

85 90 95

Val Ala Phe Leu Phe Thr Ala Pro Tyr Gly Gly Asp His Gly Val Gly

100 105 110

Ala Asp Ala Ala Thr Thr Ala Ser Ile Pro Ser Phe Ser Pro Gly Ala

115 120 125

Ala Arg Arg Phe Ala Ala Asp His Gly Leu Ala Val His Ala Val Ala

130 135 140

Leu Arg Val Ala Asp Ala Ala Asp Ala Phe Arg Ala Ser Val Ala Ala

145 150 155 160

Gly Ala Arg Pro Ala Phe Gln Pro Ala Asp Leu Gly Gly Gly Phe Gly

165 170 175

Leu Ala Glu Val Glu Leu Tyr Gly Asp Val Val Leu Arg Phe Val Ser

180 185 190

His Pro Asp Gly Ala Asp Ala Pro Phe Leu Pro Gly Phe Glu Gly Val

195 200 205

Ser Asn Pro Gly Ala Val Asp Tyr Gly Leu Arg Arg Phe Asp His Val

210 215 220

Val Gly Asn Val Pro Glu Leu Ala Pro Val Ala Ala Tyr Ile Ser Gly

225 230 235 240

Phe Thr Gly Phe His Glu Phe Ala Glu Phe Thr Ala Glu Asp Val Gly

245 250 255

Thr Ala Glu Ser Gly Leu Asn Ser Val Val Leu Ala Asn Asn Ala Glu

260 265 270

Thr Val Leu Leu Pro Leu Asn Glu Pro Val His Gly Thr Lys Arg Arg

275 280 285

Ser Gln Ile Gln Thr Tyr Leu Asp His His Gly Gly Pro Gly Val Gln

290 295 300

His Ile Ala Leu Ala Ser Asp Asp Val Leu Gly Thr Leu Arg Glu Met

305 310 315 320

Arg Ala Arg Ser Ala Met Gly Gly Phe Glu Phe Leu Ala Pro Pro Pro

325 330 335

Pro Asn Tyr Tyr Asp Gly Val Arg Arg Arg Ala Gly Asp Val Leu Ser

340 345 350

Glu Glu Gln Ile Asn Glu Cys Gln Glu Leu Gly Val Leu Val Asp Arg

355 360 365

Asp Asp Gln Gly Val Leu Leu Gln Ile Phe Thr Lys Pro Val Gly Asp

370 375 380

Arg Pro Thr Phe Phe Leu Glu Met Ile Gln Arg Ile Gly Cys Met Glu

385 390 395 400

Lys Asp Glu Ser Gly Gln Glu Tyr Gln Lys Gly Gly Cys Gly Gly Phe

405 410 415

Gly Lys Gly Asn Phe Ser Glu Leu Phe Lys Ser Ile Glu Glu Tyr Glu

420 425 430

Lys Ser Leu Glu Ala Lys Gln Ala Pro Thr Val Gln Gly Ser

435 440 445

<210> 6

<211> 2099

<212> ДНК

<213> ДНК последовательность генома HPPD Oryza sativa L. (ДНК

последовательность)

<400> 6

atgcctccca ctcccacccc caccgccacc accggcgccg tctcggccgc tgcggcggcg 60

ggggagaacg cggggttccg cctcgtcggg caccgccgct tcgtccgcgc caacccgcgg 120

agcgaccggt tccaggcgct cgcgttccac cacgtcgagc tctggtgcgc cgacgccgcg 180

tccgccgcgg gccggttcgc cttcgccctg ggcgcgccgc tcgccgccag gtccgacctc 240

tccacgggga actccgcgca cgcctccctc ctcctccgct ccgcctccgt cgcgttcctc 300

ttcaccgccc cctacggcgg cgaccacggc gtcggcgcgg acgcggccac caccgcctcc 360

atcccttcct tctccccagg cgccgcgcgg aggttcgccg cggaccacgg cctcgcggtg 420

cacgccgtgg cgctgcgcgt cgccgacgcg gccgacgcct tccgcgccag cgtcgcggcc 480

ggtgcgcgcc cggcgttcca gcccgccgac ctcggcggtg gcttcggcct cgcggaggtg 540

gagctctacg gcgacgtcgt gctccgcttc gtcagccacc cggacggcgc cgacgcgccc 600

ttcctcccgg gtttcgaggg cgtcagcaac ccgggcgccg tggactacgg cctccgccgg 660

ttcgaccacg tcgtcggcaa cgtgccggag ctcgctccgg tagccgcgta catctccggg 720

ttcaccgggt tccacgagtt cgccgagttc accgccgagg acgtgggcac cgccgagagc 780

ggcctcaact cggtggtgct cgccaacaac gcggagaccg tgctgctgcc gctcaacgag 840

ccggtgcacg gcaccaagcg gcggagccag atacagacgt acctggacca ccacggcggc 900

ccgggggtgc agcacatcgc gctggccagc gacgacgtgc tcgggacgct gagggagatg 960

cgggcgcgct ccgccatggg cggcttcgag ttcttggcgc cgccgccgcc caactactac 1020

gacggcgtgc ggcggcgcgc cggggacgtg ctctcggagg agcagatcaa cgagtgccag 1080

gagctcgggg tgctcgtgga cagggatgac cagggggtgt tgctccagat cttcaccaag 1140

ccagtaggag acaggtaaaa tcctcacctc tttcatgatg aaaatggctt atgaattcag 1200

atttgcagtt atttgttggc acatagcatc gattaggcgc agaaaggtgt caagcattat 1260

gaaattaatc cagaatgctt gaataataca gtataatata tgatagtgag ctctgtgata 1320

ctccatggat actctttatg tgtctccatg aatccatgat gcgcctttct gaagattgtg 1380

acactagaaa gggaataaag ctgaatgtgc ataggaaaaa aatgaaaagc caatgtgtgt 1440

ctgtttatgc cttcttgcaa gcatatccca gttccttttt gccggcatgt tgtaatgcag 1500

atagccagcc acatatagct acttaattag tgagtactcc ctctcacaat gtaagtcatt 1560

ctagtatttt ccacattcat attgatgcta atctatctag attcattagc atcaatatga 1620

atatgggaaa tactagaatg acttacattg tgaaacggag gaagtattac ttactacatc 1680

taaggtccat ggattccttt ttttacaaaa gaaagaaaga atcttatggc aactccatca 1740

gcataaacca gcaatgctgc tgggaacaac ttaaacttta ggttcaggag gttgtaattg 1800

tctttaagct taatagtctg attcagtcag tattctaatt tctgctgcat ctttgctatt 1860

gttatttcct ctctgtgact ccaaatctaa ctggatcagc tatttcactc aggccaacct 1920

ttttcttgga gatgatacaa aggattgggt gcatggagaa ggatgagagt gggcaggagt 1980

accagaaggg cggctgcggc gggtttggga agggcaactt ctcggagctg ttcaagtcca 2040

ttgaggagta tgagaaatcc cttgaagcca agcaagcccc tacagttcaa ggatcctag 2099

<210> 7

<211> 536

<212> БЕЛОК

<213> Аминокислотная последовательность белка PPO1 Oryza sativa L.

(аминокислотная последовательность)

<400> 7

Met Ala Ala Ala Ala Ala Ala Met Ala Thr Ala Thr Ser Ala Thr Ala

1 5 10 15

Ala Pro Pro Leu Arg Ile Arg Asp Ala Ala Arg Arg Thr Arg Arg Arg

20 25 30

Gly His Val Arg Cys Ala Val Ala Ser Gly Ala Ala Glu Ala Pro Ala

35 40 45

Ala Pro Gly Ala Arg Val Ser Ala Asp Cys Val Val Val Gly Gly Gly

50 55 60

Ile Ser Gly Leu Cys Thr Ala Gln Ala Leu Ala Thr Lys His Gly Val

65 70 75 80

Gly Asp Val Leu Val Thr Glu Ala Arg Ala Arg Pro Gly Gly Asn Ile

85 90 95

Thr Thr Ala Glu Arg Ala Gly Glu Gly Tyr Leu Trp Glu Glu Gly Pro

100 105 110

Asn Ser Phe Gln Pro Ser Asp Pro Val Leu Thr Met Ala Val Asp Ser

115 120 125

Gly Leu Lys Asp Asp Leu Val Phe Gly Asp Pro Asn Ala Pro Arg Phe

130 135 140

Val Leu Trp Glu Gly Lys Leu Arg Pro Val Pro Ser Lys Pro Gly Asp

145 150 155 160

Leu Pro Phe Phe Asp Leu Met Ser Ile Pro Gly Lys Leu Arg Ala Gly

165 170 175

Leu Gly Ala Leu Gly Val Arg Ala Pro Pro Pro Gly Arg Glu Glu Ser

180 185 190

Val Glu Asp Phe Val Arg Arg Asn Leu Gly Ala Glu Val Phe Glu Arg

195 200 205

Leu Ile Glu Pro Phe Cys Ser Gly Val Tyr Ala Gly Asp Pro Ser Lys

210 215 220

Leu Ser Met Lys Ala Ala Phe Gly Lys Val Trp Arg Leu Glu Asp Thr

225 230 235 240

Gly Gly Ser Ile Ile Gly Gly Thr Ile Lys Thr Ile Gln Glu Arg Gly

245 250 255

Lys Asn Pro Lys Pro Pro Arg Asp Pro Arg Leu Pro Thr Pro Lys Gly

260 265 270

Gln Thr Val Ala Ser Phe Arg Lys Gly Leu Thr Met Leu Pro Asp Ala

275 280 285

Ile Thr Ser Arg Leu Gly Ser Lys Val Lys Leu Ser Trp Lys Leu Thr

290 295 300

Ser Ile Thr Lys Ser Asp Asn Lys Gly Tyr Ala Leu Val Tyr Glu Thr

305 310 315 320

Pro Glu Gly Val Val Ser Val Gln Ala Lys Thr Val Val Met Thr Ile

325 330 335

Pro Ser Tyr Val Ala Ser Asp Ile Leu Arg Pro Leu Ser Ser Asp Ala

340 345 350

Ala Asp Ala Leu Ser Ile Phe Tyr Tyr Pro Pro Val Ala Ala Val Thr

355 360 365

Val Ser Tyr Pro Lys Glu Ala Ile Arg Lys Glu Cys Leu Ile Asp Gly

370 375 380

Glu Leu Gln Gly Phe Gly Gln Leu His Pro Arg Ser Gln Gly Val Glu

385 390 395 400

Thr Leu Gly Thr Ile Tyr Ser Ser Ser Leu Phe Pro Asn Arg Ala Pro

405 410 415

Ala Gly Arg Val Leu Leu Leu Asn Tyr Ile Gly Gly Ser Thr Asn Thr

420 425 430

Gly Ile Val Ser Lys Thr Glu Ser Glu Leu Val Glu Ala Val Asp Arg

435 440 445

Asp Leu Arg Lys Met Leu Ile Asn Pro Lys Ala Val Asp Pro Leu Val

450 455 460

Leu Gly Val Arg Val Trp Pro Gln Ala Ile Pro Gln Phe Leu Ile Gly

465 470 475 480

His Leu Asp His Leu Glu Ala Ala Lys Ser Ala Leu Gly Lys Gly Gly

485 490 495

Tyr Asp Gly Leu Phe Leu Gly Gly Asn Tyr Val Ala Gly Val Ala Leu

500 505 510

Gly Arg Cys Val Glu Gly Ala Tyr Glu Ser Ala Ser Gln Ile Ser Asp

515 520 525

Tyr Leu Thr Lys Tyr Ala Tyr Lys

530 535

<210> 8

<211> 3246

<212> ДНК

<213> ДНК последовательность генома PPO1 Oryza sativa L. (ДНК

последовательность)

<400> 8

atggccgccg ccgccgcagc catggccacc gccacctccg ccacggcagc gccgccgctc 60

cgcattcgcg acgccgcgag gaggacccgc cgacgcggcc acgttcgctg cgccgtcgcc 120

agcggcgcgg ccgaggcgcc cgcggcgccc ggggcgcggg tgtcggcgga ctgcgtcgtg 180

gtgggcggcg gcatcagcgg gctctgcacc gcgcaggcgc tggccacaaa gcacggcgtc 240

ggcgacgtgc tcgtcacgga ggcccgcgcc cgccccggcg gcaacatcac caccgccgag 300

cgcgccggcg agggctacct ctgggaggag gggcccaaca gcttccagcc ttccgacccc 360

gtcctcacca tggccgtacg tcttcttgct ccccttctct tctgattctc tcgcggcgga 420

gacgacatga atgggaatgg tggtgcatgg attggggcgc gcaggtggac agcgggctca 480

aggacgatct cgtgttcggg gaccccaacg cgccgcggtt cgtgctgtgg gaggggaagc 540

taaggccggt gccgtccaag cccggcgacc tgccgttctt cgacctcatg agcatccccg 600

gcaagctcag ggccggcctt ggcgcgctcg gcgttcgagc gccacctcca gtttgtgtgc 660

tctccccgct gtgcattctt gattcacttg tgaaattcga ttgtgctgag cgtttccggc 720

gaaggtttca ggggcgtgag gagtcggtgg aggacttcgt gcggcgcaac ctcggcgcgg 780

aggtctttga gcgcctcatt gagcctttct gctcaggtgt ttattgtagt gtgcaattgc 840

tgttttgttt ttgatgattc agataagaat acggtgattt cggtgcttag gtgtgtatgc 900

tggtgatcct tcaaagctca gtatgaaggc tgcatttggg aaggtgtgga ggctggagga 960

tactggaggt agcattattg gtggaaccat caaaacaatc caggagaggg ggaaaaaccc 1020

caaaccgccg agggatccgt gagtgagaaa ttgccttctt tgttggatta attgtccatt 1080

gtgttacact gatatgcctt caccattttt agccgccttc caacgccaaa ggggcagaca 1140

gttgcatctt tcaggaaggg tctgactatg ctcccggatg ctattacatc taggtttgtt 1200

atcattgtct ttgtaattta cctagttctt caactatgga tattaggtgc tgtagattgt 1260

tcagatagat gcacattgta caacaatcta ggtagattga ttgctatggc ttgttgaatt 1320

aactgtttca cttgcatcat tgcctcagca catatgaagc atatggatag attcttcaat 1380

catttatccc tcaataacac aattttgaca ccagtgcttc tccttttttt catcctgctt 1440

catctggcta tccacaatat aattaagcat acaaaagagg cactctttga tggacaattc 1500

atagtgttgt gggttaatat tcatttgcat tctttgaggg acaattcgtt acaccctaac 1560

atgaactagt aatgattggg gtgcttaacc atttgttctg catttcctcc attttcaggt 1620

tgggtagcaa agtcaaactt tcatggaagt tgacaagcat tacaaagtca gacaacaaag 1680

gatatgcatt agtgtatgaa acaccagaag gggtggtctc ggtgcaagct aaaactgttg 1740

tcatgaccat cccatcatat gttgctagtg atatcttgcg gccactttca gtaagttata 1800

tatatttaat taactttctg ttcccaaaat acactgcagc acttcattgc ttcctgaggt 1860

cctcgattca tttttcggta gacaggaagt agtattcatt tgcacttttt aagggattaa 1920

ttcaacatat ccactggaaa tatacatatc ctacacatcc tgtcaacata cttgctaaac 1980

agcattttgt ttgagttgac tggcatctca gcagccaatt actatcttta ggggacaagc 2040

cacattctta ataaatcctg tcggaaatca ctttttgatt tttatagatt agtgttgtca 2100

tagaatttgg cttggtgatc tacttggtaa ggttaactga ttcacaagtc ggacaatttc 2160

ttcaccaatc tagcagtatg tttaagtgtg ttggtactta attctaaatg tcctgcgcat 2220

ggtaacatat catatgcaaa aattcctcag taaccgaaat ttatactgta agttttaact 2280

gtctttacac tgttaatttt agacatactt cttccttgct tgttcattga acttgtttcc 2340

cccttccaca gagtgatgca gcagatgctc tgtcaatatt ctattatcca ccagttgctg 2400

ctgtaactgt ttcatatcca aaagaagcaa ttagaaaaga atgcttaatt gacggagagc 2460

tccagggttt cggccagctg catccgcgta gtcagggagt tgagacttta ggtacttata 2520

ggaattcaac cttattattc ttctaacata taaatgaact aatctttctt gtctagtttg 2580

catttattgt ggattaagtt tggttatatt gttcttacaa gtttgtggta ttattttgta 2640

taggaacaat atatagctca tcactctttc caaatcgtgc tccagctgga agggtgttac 2700

ttctgaacta cataggaggt tctacaaata cagggattgt ttccaaggta tcgctgtcaa 2760

gttgtttatt ttgcgactat atgattacag tatcctgttt ttcaactcca gctgctgtta 2820

gactgtcata ataaatctgc tactacatgt ttgcacacta tttgactgca tttaaaaact 2880

cagatagcct atatttttag ttgcctgcta ctgggtgtat ttctaatgat cccatcatgt 2940

ttgcagactg aaagtgagct ggtagaagca gttgaccgtg acctcaggaa gatgctgata 3000

aatcctaaag cagtggaccc tttggtcctt ggcgtccggg tatggccaca agccatacca 3060

cagttcctca ttggccatct tgatcatctt gaggctgcaa aatctgccct gggcaaaggt 3120

ggttatgatg gattgttcct cggagggaac tatgttgcag gagttgccct gggccgatgc 3180

gttgaaggtg catatgagag tgcctcacaa atatctgact acttgaccaa gtacgcctac 3240

aagtga 3246

<210> 9

<211> 587

<212> БЕЛОК

<213> Аминокислотная последовательность белка TIR1 Oryza sativa L.

(аминокислотная последовательность)

<400> 9

Met Gly Arg Gly Gly Ser Arg Ala Ala Cys Ala Ala Ala Ala Pro Pro

1 5 10 15

Trp His Ser Leu Pro Asp Glu Val Trp Glu His Ala Phe Ser Phe Leu

20 25 30

Pro Ala Ala Ala Asp Arg Gly Ala Ala Ala Gly Ala Cys Ser Ser Trp

35 40 45

Leu Arg Ala Glu Arg Arg Ser Arg Arg Arg Leu Ala Val Ala Asn Cys

50 55 60

Tyr Ala Ala Ala Pro Arg Asp Ala Val Glu Arg Phe Pro Ser Val Arg

65 70 75 80

Ala Ala Glu Val Lys Gly Lys Pro His Phe Ala Asp Phe Gly Leu Val

85 90 95

Pro Pro Ala Trp Gly Ala Ala Ala Ala Pro Trp Ile Ala Ala Ala Ala

100 105 110

Asp Gly Trp Pro Leu Leu Glu Glu Leu Ser Phe Lys Arg Met Val Val

115 120 125

Thr Asp Glu Cys Leu Glu Met Ile Ala Ala Ser Phe Arg Asn Phe Gln

130 135 140

Val Leu Arg Leu Val Ser Cys Asp Gly Phe Ser Thr Ala Gly Leu Ala

145 150 155 160

Ala Ile Ala Ala Gly Cys Arg His Leu Arg Glu Leu Asp Leu Gln Glu

165 170 175

Asn Glu Ile Glu Asp Cys Ser Ile His Trp Leu Ser Leu Phe Pro Glu

180 185 190

Ser Phe Thr Ser Leu Val Thr Leu Asn Phe Ser Cys Leu Glu Gly Glu

195 200 205

Val Asn Ile Thr Val Leu Glu Arg Leu Val Thr Arg Cys His Asn Leu

210 215 220

Lys Thr Leu Lys Leu Asn Asn Ala Ile Pro Leu Asp Lys Leu Ala Ser

225 230 235 240

Leu Leu His Lys Ala Pro Gln Leu Val Glu Leu Gly Thr Gly Lys Phe

245 250 255

Ser Ala Asp Tyr His Ser Asp Leu Phe Ala Lys Leu Glu Ala Ala Phe

260 265 270

Gly Gly Cys Lys Ser Leu Arg Arg Leu Ser Gly Ala Trp Asp Ala Val

275 280 285

Pro Asp Tyr Leu Pro Ala Phe Tyr Cys Val Cys Glu Gly Leu Thr Ser

290 295 300

Leu Asn Leu Ser Tyr Ala Thr Val Arg Gly Pro Glu Leu Ile Lys Phe

305 310 315 320

Ile Ser Arg Cys Arg Asn Leu Gln Gln Leu Trp Val Met Asp Leu Ile

325 330 335

Glu Asp His Gly Leu Ala Val Val Ala Ser Ser Cys Asn Lys Leu Gln

340 345 350

Glu Leu Arg Val Phe Pro Ser Asp Pro Phe Gly Ala Gly Phe Leu Thr

355 360 365

Glu Arg Gly Leu Val Asp Val Ser Ala Ser Cys Pro Met Leu Glu Ser

370 375 380

Val Leu Tyr Phe Cys Arg Arg Met Thr Asn Glu Ala Leu Ile Thr Ile

385 390 395 400

Ala Lys Asn Arg Pro Asn Phe Thr Cys Phe Arg Leu Cys Ile Leu Glu

405 410 415

Pro His Thr Pro Asp Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Leu Asp Ala Gly Phe

420 425 430

Ser Ala Ile Val Glu Ser Cys Arg Gly Leu Arg Arg Leu Ser Ile Ser

435 440 445

Gly Leu Leu Thr Asp Leu Val Phe Lys Ser Ile Gly Ala His Ala Asp

450 455 460

Arg Leu Glu Met Leu Ser Ile Ala Phe Ala Gly Asn Ser Asp Leu Gly

465 470 475 480

Leu His Tyr Ile Leu Ser Gly Cys Lys Ser Leu Lys Lys Leu Glu Ile

485 490 495

Arg Asp Cys Pro Phe Gly Asp Lys Pro Leu Leu Ala Asn Ala Ala Lys

500 505 510

Leu Glu Thr Met Arg Ser Leu Trp Met Ser Ser Cys Leu Leu Thr Leu

515 520 525

Gly Ala Cys Arg Gln Leu Ala Arg Lys Met Pro Arg Leu Ser Val Glu

530 535 540

Ile Met Asn Asp Pro Gly Arg Ser Cys Pro Leu Asp Ser Leu Pro Asp

545 550 555 560

Glu Thr Pro Val Glu Lys Leu Tyr Val Tyr Arg Thr Ile Ala Gly Pro

565 570 575

Arg Ser Asp Thr Pro Ala Cys Val Gln Ile Val

580 585

<210> 10

<211> 5791

<212> ДНК

<213> ДНК последовательность генома TIR1 Oryza sativa L. (ДНК

последовательность)

<400> 10

atggggcgcg gcggctcgcg cgcggcgtgc gccgccgcgg cgccgccgtg gcactcgctc 60

ccggacgagg tctgggagca cgccttctcc ttcctccccg ccgccgcgga caggggcgcc 120

gcggcggggg cgtgcagctc gtggctccgc gccgagcgcc ggtcgcgccg ccgcctcgcc 180

gtcgccaact gctacgccgc cgcgccgcgg gacgccgtcg agcggttccc gtccgtgcgc 240

gccgccgagg tcaagggcaa gccccacttc gccgacttcg gcctcgtccc ccccgcctgg 300

ggcgccgccg cggcgccgtg gatcgccgcc gccgccgacg ggtggccgct gctcgaggag 360

ctcagcttca agcgcatggt cgtcaccgac gagtgcctcg agatgatcgc cgcgtccttc 420

aggaacttcc aggtgctccg cctcgtctcc tgcgacggct tcagcaccgc gggcctcgcc 480

gccattgctg ccggttgcag gtgaggtgga gagtgttgtt tgggtcaaat ctttttagct 540

aaataagcat gggatctttg ggttgttctt ggatttgaga ggaatctttc acggcccaag 600

ctttgattcg tcttcttttt agctaaaaca tgacagattt cttggtgcca tttctttctt 660

cacagtgttc tttagtgagt tcatggtcta gctgaagtga tttgttcttc catgattcct 720

atattaactt tgttttgaac ttcattgagt agtatgtgga agtagatgtg gctttctgct 780

aagatttgat ctattcttgg tgtttaattt gcaaagggac agtttttttt tctgtttact 840

tgtgtatgat ctggatttac ttttggtgtt tcctaagttg aagaccaaga agtcttcttg 900

tgacagtatt ttagatgctt ataacgtgtt aatgtcaaag gaatgattcc catgaaaatt 960

ctgctgtgat ttgtacattt tattaggagt taagtaacag agtgaattga gtgatgctca 1020

cgtcttcttt aaatcttagc tatgatttgt tcctaggaag ctttgacttg tatttgagtg 1080

cctggtttgc gaagatgtga ttctcttgca cggatctgtg tgattgacag aagaaatatt 1140

tctacctgtt taagcaatga tggatccatc tctttgtttc tttttgtgct ttttacccaa 1200

aagaatggga tatttcaagt ttacaaacaa ctggtgatgc gcctttataa ttttgggctt 1260

ttttaaaaga atgtattctt cccatcatga gttactagat ctgagttgaa ctgttttcct 1320

ttatattttc ctgatattta agtgaatttg ttgagttcct atcctgattt gaacttccag 1380

attctaaaga accaggtctt ttaagcatgt ttttgtcatg tagattccca gtttatcccc 1440

tccccctcct tttgtgctca agaatctact accttttatc ttgcttttgg tgagggaaag 1500

tgatttttgc tccaatattt gtgatgtcct catgtaatgg acagttaaaa caaacagatt 1560

tgttcttgcg agtatcttct ggactccccc cagaaaagaa ttaggaatgt gtgggattcc 1620

tatcattggg gaatttatat cctaaaccag atagaaggat ctaatagtgg gagtttcgat 1680

cctgattcat ccattagtag tagtttaata tgccaaagca gtatcatttg catcattttg 1740

aggaactcga aacagttgaa ctgtgaagtt taactactgt acacttcaaa caggcagatt 1800

agaataggtt gtgagataac taaatttggt tcggtgatcg tataaggcca tattcttgga 1860

tattaggacg aaatgagcct gagcaccaca tgtgtacttg ctgatggttg agaacttagc 1920

atagatacta gtttttatgc tagactagag ggctactggt acattcactt gtttgataaa 1980

tccagatgta tttaagtttt gattcaaaat attttgactc tagattggag actacatttt 2040

agagcattca aaatttacaa tggaagcagg attttagcaa aactattttc atacatttac 2100

tctgttattg agccagaatc attttttagt tcttgctact tttttgttaa cactgttatg 2160

catgtaaact cagcgttaca tttatttcaa ttacaaggat ctacacttgt agctctgggt 2220

gcagatggta gttaacattg atgaatctta gctatatcga aatactatct tctaagtaca 2280

aacttttctt gtgtgattct tatccttgtt gttactgttg ctacttatat ccattgattg 2340

agcatgcttt gaattacctt aagaatttct ctctccagtc aaatttattt gactttgaga 2400

gaactgtgtt tatttctccc aacgtcaaat gttttgaatt ttgaatggac agagtatgta 2460

gtagtgggca gcacattggt gccctagctg caaataaaac cttttttttt tgttaaaaca 2520

atgattatga ggatgtcggt ttacactgtc cactcagaaa tttgacttga ttatggatag 2580

ggtacacctt gttgttttag atggttcctt cttaacaaga tgctagattt tgatgatttg 2640

attctttaca aggagtagtc taaaatactg gaagtgtcaa cttaaaaagt tcaaacttgc 2700

cctagccata cgtgatacat tagacaactg atgtgctgtg ttatctgcaa ctgacaatta 2760

ttgttgttgc tatctccttt ttttgcttta gagtaggcag gtattttgtg tcaactaaaa 2820

gtgtgtttca cgtgttgcct ttcttaatac cttttgaata atagggtata agaaaatttt 2880

catgaatggt ttgctttcca attgttgatg ttgctttcct tcaccttatt ttttaaacca 2940

ccatgattaa tctatttatc taggtaatat tgctcatgct gattcatgat acgtggtaaa 3000

aaaataggtc ttttcaactt tcagaggctg ctggactcca tttatttagt tgattttgat 3060

ccctacaccg attttatcca ttggtttata ttcactgcta acatatgata ctcgctatca 3120

tttacttcac tgttgatcat caatgtttta attttgacca ttattaactt ttatatgatt 3180

aatttagtat taatgaaagt tgtgcggttg tatttatggc atgacacaca tttctaacat 3240

ggcatacttt taagcataca taactttttt tgtaaaaagg acaagcgatc aaaggtaaaa 3300

aggtgaatag catacagtga gaagtatttg agaccaaagg gagtataatc attatctact 3360

aaacaaatac aataccattc attataagct gagttcgcat agtgtaattg aaagtgggga 3420

atgctagtat agctcacaca tgaaatcaag tccctgtgaa atgatagtaa accctacgtg 3480

ttcattgttt tagtcttatg atatgttcca gttatgtttg ccatggttgt tgaatgcagt 3540

agtcaaagtt tgcttctgtt tgtttgagtg gattctcatt taccttgcct tttccaccat 3600

atactcatat gggctttgtt tcacaagtga taacattggt taatggctat atgctatcct 3660

tacagtttca ttcttctttt aagatatgag tcaccatgca catttcttca acttctgatt 3720

ttgtctaata ttgcagacac ctaagagaac ttgacctgca agagaacgag attgaggatt 3780

gttctattca ttggctcagc ctcttcccgg aatcgttcac ttctctagta actctaaact 3840

tttcatgctt agagggggag gtcaatatca ctgtacttga acggttagtg accagatgtc 3900

acaacctgaa gactcttaag ctcaacaatg ctatccccct tgacaagctt gctagcctcc 3960

ttcataaggc tcctcagcta gttgaactcg gaactggcaa attctctgct gattaccatt 4020

ccgatctgtt tgcaaagctg gaggcggcgt ttggaggttg taaaagcttg agaaggcttt 4080

ctggggcttg ggatgctgtt ccagattatc tgccagcatt ctattgtgta tgtgaaggcc 4140

tcacatcact taatctgagt tatgctactg tgcgaggtcc tgagctcatc aaattcatta 4200

gtagatgcag aaatttgcaa caattatggg tatgcaactc ttgtcaattc ttttttacta 4260

ctatgtattc atcccattcg aatctgttaa cttttgaaaa actgttgcat atctctttgc 4320

aatacaagca cttgattccc tacaagtgga ttttgcaaat tttttctttt cttctgtgac 4380

ctccagtaaa aaagttcctg atgttttctt acttatcatg gtcactagta aaagtccgac 4440

tacatgtatt cttttttcac aatgtagttt tatcaattat attggtatag ggctgcaata 4500

gcattttatg atgaaactga ctgcactttt cccatgacaa caagaatttg tggcttggaa 4560

taatctattg agtgttaaat catgcatatg tttttcatgt ttgtcaatac agttttgtag 4620

gatgcatgtt acattcaatg gcatgctgtt gggtgcctcc aatgaataga ttgaaattac 4680

cactcttatc ttttggggaa gtaggatatt tatatggaaa aaacatagat gacaatggta 4740

tcctatcctt attagaatca ttgtgaaaag actgccagat gaatccattt gctctagggc 4800

agcattcttt gcctttcttg gcaaactgag ttattgtctg aaccctcata gtttccatcc 4860

tttaactgtt aactgctaga tgagttgctt gctctacggc agatatttta aactgaatta 4920

tgatctgaac cccaatggct attaacctgg tcatgttagc tctttatgca atcttttttc 4980

tctatatttt tcttctaaaa gttaagctgc aatttttcag gtgatggacc tcattgagga 5040

tcatggttta gctgttgtgg catcatcttg caataaactt caagagttgc gggtcttccc 5100

ttctgaccct tttggtgcag gattcttgac tgaaagaggt cttgttgatg tctctgcaag 5160

ttgtccaatg ttggagtcag tgctctactt ctgcagacgg atgacaaatg aggcacttat 5220

taccattgca aagaaccgtc ccaacttcac ttgcttccgc ctatgcatcc ttgagccaca 5280

cactccagac tacatcacac gggagcctct tgatgcaggt ttcagcgcca ttgtggagtc 5340

atgcaggggc cttaggcgtc tctctatctc aggccttctc acagatcttg tgtttaaatc 5400

cattggggca catgctgatc gtcttgagat gctttcaatc gccttcgctg ggaacagcga 5460

cttgggcctg cattacatcc tctcaggctg caagagcctg aagaaactgg agatcaggga 5520

ctgcccattt ggtgataagc cattgctggc gaacgcagca aagctggaga caatgcgatc 5580

cctttggatg tcgtcgtgct tgttgaccct gggcgcatgc cgacagcttg cacgcaagat 5640

gccccgcctt agtgtggaga tcatgaacga tcctggaagg tcatgcccct tggattcgct 5700

tccggatgaa acacctgttg agaaactgta cgtctaccgg acgatcgcag gtccaaggtc 5760

cgacacacca gcctgcgtcc agattgtgta g 5791

<210> 11

<211> 644

<212> БЕЛОК

<213> Аминокислотная последовательность белка ALS Oryza sativa L.

(аминокислотная последовательность)

<400> 11

Met Ala Thr Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Thr Leu Ser Ala Ala Ala

1 5 10 15

Thr Ala Lys Thr Gly Arg Lys Asn His Gln Arg His His Val Leu Pro

20 25 30

Ala Arg Gly Arg Val Gly Ala Ala Ala Val Arg Cys Ser Ala Val Ser

35 40 45

Pro Val Thr Pro Pro Ser Pro Ala Pro Pro Ala Thr Pro Leu Arg Pro

50 55 60

Trp Gly Pro Ala Glu Pro Arg Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Glu Ala

65 70 75 80

Leu Glu Arg Cys Gly Val Ser Asp Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala

85 90 95

Ser Met Glu Ile His Gln Ala Leu Thr Arg Ser Pro Val Ile Thr Asn

100 105 110

His Leu Phe Arg His Glu Gln Gly Glu Ala Phe Ala Ala Ser Gly Tyr

115 120 125

Ala Arg Ala Ser Gly Arg Val Gly Val Cys Val Ala Thr Ser Gly Pro

130 135 140

Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser Ala Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp Ser

145 150 155 160

Val Pro Met Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Pro Arg Arg Met Ile Gly

165 170 175

Thr Asp Ala Phe Gln Glu Thr Pro Ile Val Glu Val Thr Arg Ser Ile

180 185 190

Thr Lys His Asn Tyr Leu Val Leu Asp Val Glu Asp Ile Pro Arg Val

195 200 205

Ile Gln Glu Ala Phe Phe Leu Ala Ser Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val

210 215 220

Leu Val Asp Ile Pro Lys Asp Ile Gln Gln Gln Met Ala Val Pro Val

225 230 235 240

Trp Asp Thr Ser Met Asn Leu Pro Gly Tyr Ile Ala Arg Leu Pro Lys

245 250 255

Pro Pro Ala Thr Glu Leu Leu Glu Gln Val Leu Arg Leu Val Gly Glu

260 265 270

Ser Arg Arg Pro Ile Leu Tyr Val Gly Gly Gly Cys Ser Ala Ser Gly

275 280 285

Asp Glu Leu Arg Arg Phe Val Glu Leu Thr Gly Ile Pro Val Thr Thr

290 295 300

Thr Leu Met Gly Leu Gly Asn Phe Pro Ser Asp Asp Pro Leu Ser Leu

305 310 315 320

Arg Met Leu Gly Met His Gly Thr Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Asp

325 330 335

Lys Ala Asp Leu Leu Leu Ala Phe Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val

340 345 350

Thr Gly Lys Ile Glu Ala Phe Ala Ser Arg Ala Lys Ile Val His Ile

355 360 365

Asp Ile Asp Pro Ala Glu Ile Gly Lys Asn Lys Gln Pro His Val Ser

370 375 380

Ile Cys Ala Asp Val Lys Leu Ala Leu Gln Gly Leu Asn Ala Leu Leu

385 390 395 400

Asp Gln Ser Thr Thr Lys Thr Ser Ser Asp Phe Ser Ala Trp His Asn

405 410 415

Glu Leu Asp Gln Gln Lys Arg Glu Phe Pro Leu Gly Tyr Lys Thr Phe

420 425 430

Gly Glu Glu Ile Pro Pro Gln Tyr Ala Ile Gln Val Leu Asp Glu Leu

435 440 445

Thr Lys Gly Glu Ala Ile Ile Ala Thr Gly Val Gly Gln His Gln Met

450 455 460

Trp Ala Ala Gln Tyr Tyr Thr Tyr Lys Arg Pro Arg Gln Trp Leu Ser

465 470 475 480

Ser Ala Gly Leu Gly Ala Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ala Gly

485 490 495

Ala Ser Val Ala Asn Pro Gly Val Thr Val Val Asp Ile Asp Gly Asp

500 505 510

Gly Ser Phe Leu Met Asn Ile Gln Glu Leu Ala Leu Ile Arg Ile Glu

515 520 525

Asn Leu Pro Val Lys Val Met Val Leu Asn Asn Gln His Leu Gly Met

530 535 540

Val Val Gln Trp Glu Asp Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr

545 550 555 560

Tyr Leu Gly Asn Pro Glu Cys Glu Ser Glu Ile Tyr Pro Asp Phe Val

565 570 575

Thr Ile Ala Lys Gly Phe Asn Ile Pro Ala Val Arg Val Thr Lys Lys

580 585 590

Ser Glu Val Arg Ala Ala Ile Lys Lys Met Leu Glu Thr Pro Gly Pro

595 600 605

Tyr Leu Leu Asp Ile Ile Val Pro His Gln Glu His Val Leu Pro Met

610 615 620

Ile Pro Asn Gly Gly Ala Phe Lys Asp Met Ile Leu Asp Gly Asp Gly

625 630 635 640

Arg Thr Met Tyr

<210> 12

<211> 1935

<212> ДНК

<213> ДНК последовательность гена ALS Oryza sativa L. (ДНК

последовательность)

<400> 12

atggctacga ccgccgcggc cgcggccgcc accttgtccg ccgccgcgac ggccaagacc 60

ggccgtaaga accaccagcg acaccacgtc cttcccgctc gaggccgggt gggggcggcg 120

gcggtcaggt gctcggcggt gtccccggtc accccgccgt ccccggcgcc gccggccacg 180

ccgctccggc cgtgggggcc ggccgagccc cgcaagggcg cggacatcct cgtggaggcg 240

ctggagcggt gcggcgtcag cgacgtgttc gcctacccgg gcggcgcgtc catggagatc 300

caccaggcgc tgacgcgctc cccggtcatc accaaccacc tcttccgcca cgagcagggc 360

gaggcgttcg cggcgtccgg gtacgcgcgc gcgtccggcc gcgtcggggt ctgcgtcgcc 420

acctccggcc ccggggcaac caacctcgtg tccgcgctcg ccgacgcgct gctcgactcc 480

gtcccgatgg tcgccatcac gggccaggtc ccccgccgca tgatcggcac cgacgccttc 540

caggagacgc ccatagtcga ggtcacccgc tccatcacca agcacaatta ccttgtcctt 600

gatgtggagg acatcccccg cgtcatacag gaagccttct tcctcgcgtc ctcgggccgt 660

cctggcccgg tgctggtcga catccccaag gacatccagc agcagatggc tgtgccagtc 720

tgggacacct cgatgaatct accggggtac attgcacgcc tgcccaagcc acccgcgaca 780

gaattgcttg agcaggtctt gcgtctggtt ggcgagtcac ggcgcccgat tctctatgtc 840

ggtggtggct gctctgcatc tggtgatgaa ttgcgccggt ttgttgagct gaccggcatc 900

ccagttacaa ccactctgat gggcctcggc aatttcccca gtgatgatcc gttgtccctg 960

cgcatgcttg ggatgcatgg cacggtgtac gcaaattatg cggtggataa ggctgacctg 1020

ttgcttgcat ttggcgtgcg gtttgatgat cgtgtgacag ggaaaattga ggcttttgca 1080

agcagggcca agattgtgca cattgacatt gatccagcgg agattggaaa gaacaagcaa 1140

ccacatgtgt caatttgcgc agatgttaag cttgctttac agggcttgaa tgctctgcta 1200

gaccagagca caacaaagac aagttctgat tttagtgcat ggcacaatga gttggaccag 1260

cagaagaggg agtttcctct ggggtacaag acttttggtg aagagatccc accgcaatat 1320

gctattcagg tgctggatga gctgacgaaa ggggaggcaa tcatcgctac tggtgttgga 1380

cagcaccaga tgtgggcggc acaatattac acctacaagc ggccacggca gtggctgtct 1440

tcggctggtc tgggcgcaat gggatttggg ctgcctgctg cagctggtgc ttctgtggct 1500

aacccaggtg tcacagttgt tgatattgat ggggatggta gcttcctcat gaacattcag 1560

gagttggcat tgatccgcat tgagaacctc ccggtgaagg tgatggtgtt gaacaaccaa 1620

catttgggta tggttgtgca atgggaggat aggttttaca aggcaaatag ggcgcataca 1680

tacttgggca acccagaatg tgagagcgag atatatccag attttgtgac tattgctaaa 1740

gggttcaata ttcctgcagt ccgtgtaaca aagaagagtg aagtccgtgc cgccatcaag 1800

aagatgctcg agaccccagg gccatacttg ttggatatca tcgtcccaca ccaggagcat 1860

gtgctgccta tgatcccaaa tgggggcgca ttcaaggaca tgatcctgga tggtgatggc 1920

aggactatgt attaa 1935

<210> 13

<211> 2327

<212> БЕЛОК

<213> Аминокислотная последовательность белка ACCase2 Oryza sativa L.

(аминокислотная последовательность)

<400> 13

Met Thr Ser Thr His Val Ala Thr Leu Gly Val Gly Ala Gln Ala Pro

1 5 10 15

Pro Arg His Gln Lys Lys Ser Ala Gly Thr Ala Phe Val Ser Ser Gly

20 25 30

Ser Ser Arg Pro Ser Tyr Arg Lys Asn Gly Gln Arg Thr Arg Ser Leu

35 40 45

Arg Glu Glu Ser Asn Gly Gly Val Ser Asp Ser Lys Lys Leu Asn His

50 55 60

Ser Ile Arg Gln Gly Leu Ala Gly Ile Ile Asp Leu Pro Asn Asp Ala

65 70 75 80

Ala Ser Glu Val Asp Ile Ser His Gly Ser Glu Asp Pro Arg Gly Pro

85 90 95

Thr Val Pro Gly Ser Tyr Gln Met Asn Gly Ile Ile Asn Glu Thr His

100 105 110

Asn Gly Arg His Ala Ser Val Ser Lys Val Val Glu Phe Cys Thr Ala

115 120 125

Leu Gly Gly Lys Thr Pro Ile His Ser Val Leu Val Ala Asn Asn Gly

130 135 140

Met Ala Ala Ala Lys Phe Met Arg Ser Val Arg Thr Trp Ala Asn Asp

145 150 155 160

Thr Phe Gly Ser Glu Lys Ala Ile Gln Leu Ile Ala Met Ala Thr Pro

165 170 175

Glu Asp Leu Arg Ile Asn Ala Glu His Ile Arg Ile Ala Asp Gln Phe

180 185 190

Val Glu Val Pro Gly Gly Thr Asn Asn Asn Asn Tyr Ala Asn Val Gln

195 200 205

Leu Ile Val Glu Ile Ala Glu Arg Thr Gly Val Ser Ala Val Trp Pro

210 215 220

Gly Trp Gly His Ala Ser Glu Asn Pro Glu Leu Pro Asp Ala Leu Thr

225 230 235 240

Ala Lys Gly Ile Val Phe Leu Gly Pro Pro Ala Ser Ser Met His Ala

245 250 255

Leu Gly Asp Lys Val Gly Ser Ala Leu Ile Ala Gln Ala Ala Gly Val

260 265 270

Pro Thr Leu Ala Trp Ser Gly Ser His Val Glu Val Pro Leu Glu Cys

275 280 285

Cys Leu Asp Ser Ile Pro Asp Glu Met Tyr Arg Lys Ala Cys Val Thr

290 295 300

Thr Thr Glu Glu Ala Val Ala Ser Cys Gln Val Val Gly Tyr Pro Ala

305 310 315 320

Met Ile Lys Ala Ser Trp Gly Gly Gly Gly Lys Gly Ile Arg Lys Val

325 330 335

His Asn Asp Asp Glu Val Arg Thr Leu Phe Lys Gln Val Gln Gly Glu

340 345 350

Val Pro Gly Ser Pro Ile Phe Ile Met Arg Leu Ala Ala Gln Ser Arg

355 360 365

His Leu Glu Val Gln Leu Leu Cys Asp Gln Tyr Gly Asn Val Ala Ala

370 375 380

Leu His Ser Arg Asp Cys Ser Val Gln Arg Arg His Gln Lys Ile Ile

385 390 395 400

Glu Glu Gly Pro Val Thr Val Ala Pro Arg Glu Thr Val Lys Glu Leu

405 410 415

Glu Gln Ala Ala Arg Arg Leu Ala Lys Ala Val Gly Tyr Val Gly Ala

420 425 430

Ala Thr Val Glu Tyr Leu Tyr Ser Met Glu Thr Gly Glu Tyr Tyr Phe

435 440 445

Leu Glu Leu Asn Pro Arg Leu Gln Val Glu His Pro Val Thr Glu Trp

450 455 460

Ile Ala Glu Val Asn Leu Pro Ala Ala Gln Val Ala Val Gly Met Gly

465 470 475 480

Ile Pro Leu Trp Gln Ile Pro Glu Ile Arg Arg Phe Tyr Gly Met Asn

485 490 495

His Gly Gly Gly Tyr Asp Leu Trp Arg Lys Thr Ala Ala Leu Ala Thr

500 505 510

Pro Phe Asn Phe Asp Glu Val Asp Ser Lys Trp Pro Lys Gly His Cys

515 520 525

Val Ala Val Arg Ile Thr Ser Glu Asp Pro Asp Asp Gly Phe Lys Pro

530 535 540

Thr Gly Gly Lys Val Lys Glu Ile Ser Phe Lys Ser Lys Pro Asn Val

545 550 555 560

Trp Ala Tyr Phe Ser Val Lys Ser Gly Gly Gly Ile His Glu Phe Ala

565 570 575

Asp Ser Gln Phe Gly His Val Phe Ala Tyr Gly Thr Thr Arg Ser Ala

580 585 590

Ala Ile Thr Thr Met Ala Leu Ala Leu Lys Glu Val Gln Ile Arg Gly

595 600 605

Glu Ile His Ser Asn Val Asp Tyr Thr Val Asp Leu Leu Asn Ala Ser

610 615 620

Asp Phe Arg Glu Asn Lys Ile His Thr Gly Trp Leu Asp Thr Arg Ile

625 630 635 640

Ala Met Arg Val Gln Ala Glu Arg Pro Pro Trp Tyr Ile Ser Val Val

645 650 655

Gly Gly Ala Leu Tyr Lys Thr Val Thr Ala Asn Thr Ala Thr Val Ser

660 665 670

Asp Tyr Val Gly Tyr Leu Thr Lys Gly Gln Ile Pro Pro Lys His Ile

675 680 685

Ser Leu Val Tyr Thr Thr Val Ala Leu Asn Ile Asp Gly Lys Lys Tyr

690 695 700

Thr Ile Asp Thr Val Arg Ser Gly His Gly Ser Tyr Arg Leu Arg Met

705 710 715 720

Asn Gly Ser Thr Val Asp Ala Asn Val Gln Ile Leu Cys Asp Gly Gly

725 730 735

Leu Leu Met Gln Leu Asp Gly Asn Ser His Val Ile Tyr Ala Glu Glu

740 745 750

Glu Ala Ser Gly Thr Arg Leu Leu Ile Asp Gly Lys Thr Cys Met Leu

755 760 765

Gln Asn Asp His Asp Pro Ser Lys Leu Leu Ala Glu Thr Pro Cys Lys

770 775 780

Leu Leu Arg Phe Leu Val Ala Asp Gly Ala His Val Asp Ala Asp Val

785 790 795 800

Pro Tyr Ala Glu Val Glu Val Met Lys Met Cys Met Pro Leu Leu Ser

805 810 815

Pro Ala Ser Gly Val Ile His Val Val Met Ser Glu Gly Gln Ala Met

820 825 830

Gln Ala Gly Asp Leu Ile Ala Arg Leu Asp Leu Asp Asp Pro Ser Ala

835 840 845

Val Lys Arg Ala Glu Pro Phe Glu Asp Thr Phe Pro Gln Met Gly Leu

850 855 860

Pro Ile Ala Ala Ser Gly Gln Val His Lys Leu Cys Ala Ala Ser Leu

865 870 875 880

Asn Ala Cys Arg Met Ile Leu Ala Gly Tyr Glu His Asp Ile Asp Lys

885 890 895

Val Val Pro Glu Leu Val Tyr Cys Leu Asp Thr Pro Glu Leu Pro Phe

900 905 910

Leu Gln Trp Glu Glu Leu Met Ser Val Leu Ala Thr Arg Leu Pro Arg

915 920 925

Asn Leu Lys Ser Glu Leu Glu Gly Lys Tyr Glu Glu Tyr Lys Val Lys

930 935 940

Phe Asp Ser Gly Ile Ile Asn Asp Phe Pro Ala Asn Met Leu Arg Val

945 950 955 960

Ile Ile Glu Glu Asn Leu Ala Cys Gly Ser Glu Lys Glu Lys Ala Thr

965 970 975

Asn Glu Arg Leu Val Glu Pro Leu Met Ser Leu Leu Lys Ser Tyr Glu

980 985 990

Gly Gly Arg Glu Ser His Ala His Phe Val Val Lys Ser Leu Phe Glu

995 1000 1005

Glu Tyr Leu Tyr Val Glu Glu Leu Phe Ser Asp Gly Ile Gln Ser Asp

1010 1015 1020

Val Ile Glu Arg Leu Arg Leu Gln His Ser Lys Asp Leu Gln Lys Val

1025 1030 1035 1040

Val Asp Ile Val Leu Ser His Gln Ser Val Arg Asn Lys Thr Lys Leu

1045 1050 1055

Ile Leu Lys Leu Met Glu Ser Leu Val Tyr Pro Asn Pro Ala Ala Tyr

1060 1065 1070

Arg Asp Gln Leu Ile Arg Phe Ser Ser Leu Asn His Lys Ala Tyr Tyr

1075 1080 1085

Lys Leu Ala Leu Lys Ala Ser Glu Leu Leu Glu Gln Thr Lys Leu Ser

1090 1095 1100

Glu Leu Arg Ala Arg Ile Ala Arg Ser Leu Ser Glu Leu Glu Met Phe

1105 1110 1115 1120

Thr Glu Glu Ser Lys Gly Leu Ser Met His Lys Arg Glu Ile Ala Ile

1125 1130 1135

Lys Glu Ser Met Glu Asp Leu Val Thr Ala Pro Leu Pro Val Glu Asp

1140 1145 1150

Ala Leu Ile Ser Leu Phe Asp Cys Ser Asp Thr Thr Val Gln Gln Arg

1155 1160 1165

Val Ile Glu Thr Tyr Ile Ala Arg Leu Tyr Gln Pro His Leu Val Lys

1170 1175 1180

Asp Ser Ile Lys Met Lys Trp Ile Glu Ser Gly Val Ile Ala Leu Trp

1185 1190 1195 1200

Glu Phe Pro Glu Gly His Phe Asp Ala Arg Asn Gly Gly Ala Val Leu

1205 1210 1215

Gly Asp Lys Arg Trp Gly Ala Met Val Ile Val Lys Ser Leu Glu Ser

1220 1225 1230

Leu Ser Met Ala Ile Arg Phe Ala Leu Lys Glu Thr Ser His Tyr Thr

1235 1240 1245

Ser Ser Glu Gly Asn Met Met His Ile Ala Leu Leu Gly Ala Asp Asn

1250 1255 1260

Lys Met His Ile Ile Gln Glu Ser Gly Asp Asp Ala Asp Arg Ile Ala

1265 1270 1275 1280

Lys Leu Pro Leu Ile Leu Lys Asp Asn Val Thr Asp Leu His Ala Ser

1285 1290 1295

Gly Val Lys Thr Ile Ser Phe Ile Val Gln Arg Asp Glu Ala Arg Met

1300 1305 1310

Thr Met Arg Arg Thr Phe Leu Trp Ser Asp Glu Lys Leu Ser Tyr Glu

1315 1320 1325

Glu Glu Pro Ile Leu Arg His Val Glu Pro Pro Leu Ser Ala Leu Leu

1330 1335 1340

Glu Leu Asp Lys Leu Lys Val Lys Gly Tyr Asn Glu Met Lys Tyr Thr

1345 1350 1355 1360

Pro Ser Arg Asp Arg Gln Trp His Ile Tyr Thr Leu Arg Asn Thr Glu

1365 1370 1375

Asn Pro Lys Met Leu His Arg Val Phe Phe Arg Thr Leu Val Arg Gln

1380 1385 1390

Pro Ser Val Ser Asn Lys Phe Ser Ser Gly Gln Ile Gly Asp Met Glu

1395 1400 1405

Val Gly Ser Ala Glu Glu Pro Leu Ser Phe Thr Ser Thr Ser Ile Leu

1410 1415 1420

Arg Ser Leu Met Thr Ala Ile Glu Glu Leu Glu Leu His Ala Ile Arg

1425 1430 1435 1440

Thr Gly His Ser His Met Tyr Leu His Val Leu Lys Glu Gln Lys Leu

1445 1450 1455

Leu Asp Leu Val Pro Val Ser Gly Asn Thr Val Leu Asp Val Gly Gln

1460 1465 1470

Asp Glu Ala Thr Ala Tyr Ser Leu Leu Lys Glu Met Ala Met Lys Ile

1475 1480 1485

His Glu Leu Val Gly Ala Arg Met His His Leu Ser Val Cys Gln Trp

1490 1495 1500

Glu Val Lys Leu Lys Leu Asp Cys Asp Gly Pro Ala Ser Gly Thr Trp

1505 1510 1515 1520

Arg Ile Val Thr Thr Asn Val Thr Ser His Thr Cys Thr Val Asp Ile

1525 1530 1535

Tyr Arg Glu Met Glu Asp Lys Glu Ser Arg Lys Leu Val Tyr His Pro

1540 1545 1550

Ala Thr Pro Ala Ala Gly Pro Leu His Gly Val Ala Leu Asn Asn Pro

1555 1560 1565

Tyr Gln Pro Leu Ser Val Ile Asp Leu Lys Arg Cys Ser Ala Arg Asn

1570 1575 1580

Asn Arg Thr Thr Tyr Cys Tyr Asp Phe Pro Leu Ala Phe Glu Thr Ala

1585 1590 1595 1600

Val Arg Lys Ser Trp Ser Ser Ser Thr Ser Gly Ala Ser Lys Gly Val

1605 1610 1615

Glu Asn Ala Gln Cys Tyr Val Lys Ala Thr Glu Leu Val Phe Ala Asp

1620 1625 1630

Lys His Gly Ser Trp Gly Thr Pro Leu Val Gln Met Asp Arg Pro Ala

1635 1640 1645

Gly Leu Asn Asp Ile Gly Met Val Ala Trp Thr Leu Lys Met Ser Thr

1650 1655 1660

Pro Glu Phe Pro Ser Gly Arg Glu Ile Ile Val Val Ala Asn Asp Ile

1665 1670 1675 1680

Thr Phe Arg Ala Gly Ser Phe Gly Pro Arg Glu Asp Ala Phe Phe Glu

1685 1690 1695

Ala Val Thr Asn Leu Ala Cys Glu Lys Lys Leu Pro Leu Ile Tyr Leu

1700 1705 1710

Ala Ala Asn Ser Gly Ala Arg Ile Gly Ile Ala Asp Glu Val Lys Ser

1715 1720 1725

Cys Phe Arg Val Gly Trp Ser Asp Asp Gly Ser Pro Glu Arg Gly Phe

1730 1735 1740

Gln Tyr Ile Tyr Leu Ser Glu Glu Asp Tyr Ala Arg Ile Gly Thr Ser

1745 1750 1755 1760

Val Ile Ala His Lys Met Gln Leu Asp Ser Gly Glu Ile Arg Trp Val

1765 1770 1775

Ile Asp Ser Val Val Gly Lys Glu Asp Gly Leu Gly Val Glu Asn Ile

1780 1785 1790

His Gly Ser Ala Ala Ile Ala Ser Ala Tyr Ser Arg Ala Tyr Lys Glu

1795 1800 1805

Thr Phe Thr Leu Thr Phe Val Thr Gly Arg Thr Val Gly Ile Gly Ala

1810 1815 1820

Tyr Leu Ala Arg Leu Gly Ile Arg Cys Ile Gln Arg Leu Asp Gln Pro

1825 1830 1835 1840

Ile Ile Leu Thr Gly Tyr Ser Ala Leu Asn Lys Leu Leu Gly Arg Glu

1845 1850 1855

Val Tyr Ser Ser His Met Gln Leu Gly Gly Pro Lys Ile Met Ala Thr

1860 1865 1870

Asn Gly Val Val His Leu Thr Val Ser Asp Asp Leu Glu Gly Val Ser

1875 1880 1885

Asn Ile Leu Arg Trp Leu Ser Tyr Val Pro Ala Tyr Ile Gly Gly Pro

1890 1895 1900

Leu Pro Val Thr Thr Pro Leu Asp Pro Pro Asp Arg Pro Val Ala Tyr

1905 1910 1915 1920

Ile Pro Glu Asn Ser Cys Asp Pro Arg Ala Ala Ile Arg Gly Val Asp

1925 1930 1935

Asp Ser Gln Gly Lys Trp Leu Gly Gly Met Phe Asp Lys Asp Ser Phe

1940 1945 1950

Val Glu Thr Phe Glu Gly Trp Ala Lys Thr Val Val Thr Gly Arg Ala

1955 1960 1965

Lys Leu Gly Gly Ile Pro Val Gly Val Ile Ala Val Glu Thr Gln Thr

1970 1975 1980

Met Met Gln Thr Ile Pro Ala Asp Pro Gly Gln Leu Asp Ser Arg Glu

1985 1990 1995 2000

Gln Ser Val Pro Arg Ala Gly Gln Val Trp Phe Pro Asp Ser Ala Thr

2005 2010 2015

Lys Thr Ala Gln Ala Leu Leu Asp Phe Asn Arg Glu Gly Leu Pro Leu

2020 2025 2030

Phe Ile Leu Ala Asn Trp Arg Gly Phe Ser Gly Gly Gln Arg Asp Leu

2035 2040 2045

Phe Glu Gly Ile Leu Gln Ala Gly Ser Thr Ile Val Glu Asn Leu Arg

2050 2055 2060

Thr Tyr Asn Gln Pro Ala Phe Val Tyr Ile Pro Met Ala Ala Glu Leu

2065 2070 2075 2080

Arg Gly Gly Ala Trp Val Val Val Asp Ser Lys Ile Asn Pro Asp Arg

2085 2090 2095

Ile Glu Cys Tyr Ala Glu Arg Thr Ala Lys Gly Asn Val Leu Glu Pro

2100 2105 2110

Gln Gly Leu Ile Glu Ile Lys Phe Arg Ser Glu Glu Leu Gln Asp Cys

2115 2120 2125

Met Ser Arg Leu Asp Pro Thr Leu Ile Asp Leu Lys Ala Lys Leu Glu

2130 2135 2140

Val Ala Asn Lys Asn Gly Ser Ala Asp Thr Lys Ser Leu Gln Glu Asn

2145 2150 2155 2160

Ile Glu Ala Arg Thr Lys Gln Leu Met Pro Leu Tyr Thr Gln Ile Ala

2165 2170 2175

Ile Arg Phe Ala Glu Leu His Asp Thr Ser Leu Arg Met Ala Ala Lys

2180 2185 2190

Gly Val Ile Lys Lys Val Val Asp Trp Glu Glu Ser Arg Ser Phe Phe

2195 2200 2205

Tyr Lys Arg Leu Arg Arg Arg Ile Ser Glu Asp Val Leu Ala Lys Glu

2210 2215 2220

Ile Arg Ala Val Ala Gly Glu Gln Phe Ser His Gln Pro Ala Ile Glu

2225 2230 2235 2240

Leu Ile Lys Lys Trp Tyr Ser Ala Ser His Ala Ala Glu Trp Asp Asp

2245 2250 2255

Asp Asp Ala Phe Val Ala Trp Met Asp Asn Pro Glu Asn Tyr Lys Asp

2260 2265 2270

Tyr Ile Gln Tyr Leu Lys Ala Gln Arg Val Ser Gln Ser Leu Ser Ser

2275 2280 2285

Leu Ser Asp Ser Ser Ser Asp Leu Gln Ala Leu Pro Gln Gly Leu Ser

2290 2295 2300

Met Leu Leu Asp Lys Met Asp Pro Ser Arg Arg Ala Gln Leu Val Glu

2305 2310 2315 2320

Glu Ile Arg Lys Val Leu Gly

2325

<210> 14

<211> 11927

<212> ДНК

<213> ДНК последовательность генома ACCase2 Oryza sativa L. (ДНК

последовательность)

<400> 14

atgacatcca cacatgtggc gacattggga gttggtgccc aggcacctcc tcgtcaccag 60

aaaaagtcag ctggcactgc atttgtatca tctgggtcat caagaccctc ataccgaaag 120

aatggtcagc gtactcggtc acttagggaa gaaagcaatg gaggagtgtc tgattccaaa 180

aagcttaacc actctattcg ccaaggtgac cactagctac tttacatatg ctataatttg 240

tgccaaacat aaacatgcaa tggctgctat tatttaaacg ttaatgttga aatagctgct 300

ataggataca gcaaaaatat ataattgact gggcaagatg caacaattgt ttttcactaa 360

agttagttat cttttgctgt aaaagacaac tgttttttac ataaaatggt attaataacc 420

ttgtaatatt caatgcaaca tgttctcaag taaaaaaaaa cattgcctgg ttgtataagc 480

aaatgtgtcg ttgtagacat cttattaaac ctttttgtga tatctattac cgtagggaac 540

aggggagctg tttaaatctg ttatcataga gtaatatgag aaaagtggat tgtgcgactt 600

tggcatgtat acctgctcaa tttcaaatat atgtctatgt gcaggtcttg ctggcatcat 660

tgacctccca aatgacgcag cttcagaagt tgatatttca cagtaaggac tttatatttt 720

ataataatta ttatataatt ttctgacatg ttttgagaac ctcaaaacat gtgattgcac 780

cttccttttt tatgtctggt tcagaaactg ataagttttg acagtgttta ggatggatct 840

ttgatgcgca cagtgctttc taatgttttc atttttgaaa gtaatgtttt aggaagaaat 900

atctgattaa atttatactt tatctttaca aaagtcaaat gcgttctgta tcaattgcgg 960

tttgtaatat ggcaagaaca tgctttcaga atttgttcat acaatgcttt ctttctatta 1020

ttatgtagaa caaataccta atactttgtt caccttttat agtggacacc tctcacagct 1080

ttttcagtaa gtgatgcaat tttgtacatt tgtaagatgt gttccagaaa ccttttctcc 1140

tgcaattcta atgtacccac tcaaactggt atcaccaaag atctccatct gattgaaaaa 1200

aagctgcgtg aagtatgctt atttatgcta accatacatg atttatactg ttttatagta 1260

caatgcttat ttatgctaac catacataat tttattctgt tttctagtac attatttgtg 1320

cccctgacca taaatgatcc tttcttttac agtggttccg aagatcccag ggggcctacg 1380

gtcccaggtt cctaccaaat gaatgggatt atcaatgaaa cacataatgg gaggcatgct 1440

tcagtctcca aggttgttga gttttgtacg gcacttggtg gcaaaacacc aattcacagt 1500

gtattagtgg ccaacaatgg aatggcagca gctaagttca tgcggagtgt ccgaacatgg 1560

gctaatgata cttttggatc agagaaggca attcagctga tagctatggc aactccggag 1620

gatctgagga taaatgcaga gcacatcaga attgccgatc aatttgtaga ggtacctggt 1680

ggaacaaaca acaacaacta tgcaaatgtc caactcatag tggaggttag ttcagctcat 1740

ccctcaacac aacattttcg tttctattta agttagggaa aaatctctac gaccctccaa 1800

tttctgaaca tccaattttc accatcaact gcaatcacag atagcagaga gaacaggtgt 1860

ttctgctgtt tggcctggtt ggggtcatgc atctgagaat cctgaacttc cagatgcgct 1920

gactgcaaaa ggaattgttt ttcttgggcc accagcatca tcaatgcatg cattaggaga 1980

caaggttggc tcagctctca ttgctcaagc agctggagtt ccaacacttg cttggagtgg 2040

atcacatgtg agccttgtct tctctttttt agcttatcat cttatctttt cggtgatgca 2100

ttatcccaat gacactaaac cataggtgga agttcctctg gagtgttgct tggactcaat 2160

acctgatgag atgtatagaa aagcttgtgt tactaccaca gaggaagcag ttgcaagttg 2220

tcaggtggtt ggttatcctg ccatgattaa ggcatcttgg ggtggtggtg gtaaaggaat 2280

aaggaaggtt tgttcttctt gtagttatca agagattgtt tggattgcaa gtgtttagtg 2340

cccatagtta actctggtct ttctaacatg agtaactcaa ctttcttgca ggttcataat 2400

gatgatgagg ttaggacatt atttaagcaa gttcaaggcg aagtacctgg ttccccaata 2460

tttatcatga ggctagctgc tcaggtgggg ccttttatgg aagttacacc ttttccctta 2520

atgttgagtt attccggagt tattatggtt atgttctgta tgtttgatct gtaaattatt 2580

gaaattcacc tccattggtt ctccagatta gcagacctac aattctacat atggtttata 2640

ctttataaat actaggattt agggatcttc atatagttta tacatggtat ttagatttca 2700

tttgtaaccc tattgaagac atcctgattg ttgtcttatg tagagtcgac atcttgaagt 2760

tcagttgctt tgtgatcaat atggcaacgt agcagcactt cacagtcgag attgcagtgt 2820

acaacggcga caccaaaagg tctgctgtct cagttaaatc acccctctga atgatctact 2880

tcttgcctgc tgcgttggtc agaggaataa tggttgtatt ctactgaaca gataatcgag 2940

gaaggaccag ttactgttgc tcctcgtgag actgtgaaag agcttgagca ggcagcacgg 3000

aggcttgcta aagctgtggg ttatgttggt gctgctactg ttgaatacct ttacagcatg 3060

gaaactggtg aatattattt tctggaactt aatccacggc tacaggtcgg ctcctttgac 3120

attcttcagg aattaatttc tgttgaccac atgatttaca ttgtcaaatg gtctcacagg 3180

ttgagcatcc tgtcactgag tggatagctg aagtaaattt gcctgcggct caagttgctg 3240

ttggaatggg tatacccctt tggcagattc caggtaatgc ttcttcattt agttcctgct 3300

ctttgttaat tgaatgagct cttatacaga ccatgagaca cattctactg ttaattcata 3360

gtatcccctg acttgttagt gttagagata cagagatgta tcacaaattc attgtatctc 3420

ctcaaggact gtaaaaatcc tataattaaa tttctgaaaa tttgttcttt taagcagaaa 3480

aaaaatctct aaattatctc cctgtataca gagatcaggc gcttctacgg aatgaaccat 3540

ggaggaggct atgacctttg gaggaaaaca gcagctctag cgactccatt taactttgat 3600

gaagtagatt ctaaatggcc aaaaggccac tgcgtagctg ttagaataac tagcgaggat 3660

ccagatgatg ggtttaagcc tactggtgga aaagtaaagg tgcggtttcc tgatgttagg 3720

tgtatgaatt gaacacattg ctatattgca gctagtgaaa tgactggatc atggttctct 3780

tattttcagg agataagttt caagagtaaa ccaaatgttt gggcctattt ctcagtaaag 3840

gtagtcctca atattgttgc actgccacat tatttgagtt gtcctaacaa ttgtgctgca 3900

attgttagtt ttcaactatt tgttgttctg tttggttgac tggtaccctc tctttgcagt 3960

ctggtggagg catccatgaa ttcgctgatt ctcagttcgg tatgtaaagt taaaagagta 4020

atattgtctt tgctatttat gtttgtcctc acttttaaaa gatattgcct tccattacag 4080

gacatgtttt tgcgtatgga actactagat cggcagcaat aactaccatg gctcttgcac 4140

taaaagaggt tcaaattcgt ggagaaattc attcaaacgt agactacaca gttgacctat 4200

taaatgtaag gactaaatat ctgcttattg aaccttgctt tttggttccc taatgccatt 4260

ttagtctggc tactgaagaa cttatccatc atgccatttc tgttatctta aattcaggcc 4320

tcagatttta gagaaaataa gattcatact ggttggctgg ataccaggat agccatgcgt 4380

gttcaagctg agaggcctcc atggtatatt tcagtcgttg gaggggcttt atatgtaaga 4440

caaactatgc cactcattag catttatgtg aagcaaatgc ggaaaacatg atcaatatgt 4500

cgtcttattt aaatttattt atttttgtgc tgcagaaaac agtaactgcc aacacggcca 4560

ctgtttctga ttatgttggt tatcttacca agggccagat tccaccaaag gtactattct 4620

gttttttcag gatatgaatg ctgtttgaat gtgaaaacca ttgaccataa atccttgttt 4680

gcagcatata tcccttgtct atacgactgt tgctttgaat atagatggga aaaaatatac 4740

agtaagtgtg acattcttaa tggggaaact taatttgttg taaataatca atatcatatt 4800

gactcgtgta tgctgcatca tagatcgata ctgtgaggag tggacatggt agctacagat 4860

tgcgaatgaa tggatcaacg gttgacgcaa atgtacaaat attatgtgat ggtgggcttt 4920

taatgcaggt aatatcttct tcctagttaa agaagatata tcttgttcaa agaattctga 4980

ttattgatct tttaatgttt tcagctggat ggaaacagcc atgtaattta tgctgaagaa 5040

gaggccagtg gtacacgact tcttattgat ggaaagacat gcatgttaca ggtaatgata 5100

gccttgttct ttttagttct agtcacggtg tttgcttgct atttgttgta tctatttaat 5160

gcattcacta attactatat tagtttgcat catcaagtta aaatggaact tctttcttgc 5220

agaatgacca tgacccatca aagttattag ctgagacacc atgcaaactt cttcgtttct 5280

tggttgctga tggtgctcat gttgatgctg atgtaccata tgcggaagtt gaggttatga 5340

agatgtgcat gcccctctta tcacccgctt ctggtgtcat acatgttgta atgtctgagg 5400

gccaagcaat gcaggtacat tcctacattc cattcattgt gctgtgctga catgaacatt 5460

tcaagtaaat acctgtaact tgtttattat tctaggctgg tgatcttata gctaggctgg 5520

atcttgatga cccttctgct gttaagagag ctgagccgtt cgaagatact tttccacaaa 5580

tgggtctccc tattgctgct tctggccaag ttcacaaatt atgtgctgca agtctgaatg 5640

cttgtcgaat gatccttgcg gggtatgagc atgatattga caaggtaaac atcatgtcct 5700

cttgtttttt cttttgttta tcatgcattc ttatgttcat catgtcctct ggcaaatcta 5760

gattccgctg tcgtttcaca cagatttttc tcattctcat aatggtgcca aacataaata 5820

tgctgctata ttcatcaatg ttttcactcg atttctaatt ttgcttttga gttttaaact 5880

ttagtacaat ccatatctaa tctcctttgg caacagtgaa tccattatat atatttttat 5940

taaactgctt tctttttcag gttgtgccag agttggtata ctgcctagac actccggagc 6000

ttcctttcct gcagtgggag gagcttatgt ctgttttagc aactagactt ccaagaaatc 6060

ttaaaagtga ggtatattat ggttgacaag atagctagtc tcatgctcta aggacttgta 6120

catttcgcca cataggttaa ttttccatat caagttctaa tgtacgatat aaaagtagta 6180

ctggcctaaa acagtattgg tggttgacta tctttgttgt gtaagatcaa gtatttcttt 6240

ttcatgctta gtttgtcaat acttcacatt tatcactgac ttgtcgagct aaatgagatt 6300

ttatttgatt tctgtgctcc attatttttg tatatatata tatatattta actatgacta 6360

tatgttatgc ctcaaacgtt tcaaactctt tcagttggag ggcaaatatg aggaatacaa 6420

agtaaaattt gactctggga taatcaatga tttccctgcc aatatgctac gagtgataat 6480

tgaggtcagt tattcaattt gttgtgataa tcactgcctt aactgttcgt tcttttaaca 6540

agcggtttta taggaaaatc ttgcatgtgg ttctgagaag gagaaggcta caaatgagag 6600

gcttgttgag cctcttatga gcctactgaa gtcatatgag ggtgggagag aaagtcatgc 6660

tcactttgtt gtcaagtccc tttttgagga gtatctctat gttgaagaat tgttcagtga 6720

tggaattcag gttaacttac ctattcgcat taaacaaatc atcagttgtt ttatgataaa 6780

gtcaaaatgt ttatatttcc cattcttctg tggatcaaat atatcacgga catgatatag 6840

tttccttagg ctatataatg gttcttcatc aaataatatt gcaggaaaca gtatagcaaa 6900

ctatttgtat atactcgaga tggaaattgt tagaaacatc attgactaaa tctgtccttt 6960

gttacgctgt ttttgtagtc tgatgtgatt gagcgtctgc gccttcaaca tagtaaagac 7020

ctacagaagg tcgtagacat tgtgttgtcc caccaggtaa atttcttcat ggtctgatga 7080

cttcactgcg aatggttact gaactgtctt cttgttctga caatgtgact tttctttgta 7140

gagtgttaga aataaaacta agctgatact aaaactcatg gagagtctgg tctatccaaa 7200

tcctgctgcc tacagggatc aattgattcg cttttcttcc cttaatcaca aagcgtatta 7260

caaggtgacc aggataaaca taaataaacg tgaatttttc aatgaccttt tcttctgaca 7320

tctgaatctg atgaatttct tgcatattaa tacagttggc acttaaagct agtgaacttc 7380

ttgaacaaac aaaacttagt gagctccgtg caagaatagc aaggagcctt tcagagctgg 7440

agatgtttac tgaggaaagc aagggtctct ccatgcataa gcgagaaatt gccattaagg 7500

agagcatgga agatttagtc actgctccac tgccagttga agatgcgctc atttctttat 7560

ttgattgtag tgatacaact gttcaacaga gagtgattga gacttatata gctcgattat 7620

accaggtatg agaagaaaga ccttttgaaa ttatttatat taacatatcc tagtaaaaca 7680

gcatgctcat catttcttaa aaaaagttta cagcacctga tgtttggtta ctgaccgcat 7740

cattaaaata aagttacttg ttgtggagag atgtattttg gaacttgtgg cacatgcagt 7800

aacatgctac tgctcgatat gtttgctaac ttgacaacaa tatttttcag cctcatcttg 7860

taaaggacag tatcaaaatg aaatggatag aatcgggtgt tattgcttta tgggaatttc 7920

ctgaagggca ttttgatgca agaaatggag gagcggttct tggtgacaaa agatggggtg 7980

ccatggtcat tgtcaagtct cttgaatcac tttcaatggc cattagattt gcactaaagg 8040

agacatcaca ctacactagc tctgagggca atatgatgca tattgctttg ttgggtgctg 8100

ataataagat gcatataatt caagaaaggt atgttcatat gctatgttgg tgctgaaata 8160

gttatatatg tagttagctg gtggagttct ggtaattaac ctatcccatt gttcagtggt 8220

gatgatgctg acagaatagc caaacttccc ttgatactaa aggataatgt aaccgatctg 8280

catgcctctg gtgtgaaaac aataagtttc attgttcaaa gagatgaagc acggatgaca 8340

atgcgtcgta ccttcctttg gtctgatgaa aagctttctt atgaggaaga gccaattctc 8400

cggcatgtgg aacctcctct ttctgcactt cttgagttgg tacgtgatat catcaaaatg 8460

ataatgtttt ggtatggcat tgattatctt ctatgctctt tgtatttatt cagcctattg 8520

tggatacagg acaagttgaa agtgaaagga tacaatgaaa tgaagtatac cccatcacgg 8580

gatcgtcaat ggcatatcta cacacttaga aatactgaaa accccaaaat gttgcaccgg 8640

gtatttttcc gaacccttgt caggcaaccc agtgtatcca acaagttttc ttcgggccag 8700

attggtgaca tggaagttgg gagtgctgaa gaacctctgt catttacatc aaccagcata 8760

ttaagatctt tgatgactgc tatagaggaa ttggagcttc acgcaattag aactggccat 8820

tcacacatgt atttgcatgt attgaaagaa caaaagcttc ttgatcttgt tccagtttca 8880

gggtaagtgc gcatatttct ttttgggaac atatgcttgc ttatgaggtt ggtcttctca 8940

atgatcttct tatcttactc aggaatacag ttttggatgt tggtcaagat gaagctactg 9000

catattcact tttaaaagaa atggctatga agatacatga acttgttggt gcaagaatgc 9060

accatctttc tgtatgccaa tgggaagtga aacttaagtt ggactgcgat ggtcctgcca 9120

gtggtacctg gaggattgta acaaccaatg ttactagtca cacttgcact gtggatgtaa 9180

gtttaatcct ctagcatttt gttttctttg gaaaagcatg tgattttaag ccggctggtc 9240

ctcataccca gacctagtga tctttatata gtgtagacat ttttctaact gcttttaatt 9300

gttttagatc taccgtgaga tggaagataa agaatcacgg aagttagtat accatcccgc 9360

cactccggcg gctggtcctc tgcatggtgt ggcactgaat aatccatatc agcctttgag 9420

tgtcattgat ctcaaacgct gttctgctag gaataataga actacatact gctatgattt 9480

tccactggtg agttgactgc tcccttatat tcaatgcatt accatagcaa attcatattc 9540

gttcatgttg tcaaaataag ccgatgaaaa ttcaaaactg taggcatttg aaactgcagt 9600

gaggaagtca tggtcctcta gtacctctgg tgcttctaaa ggtgttgaaa atgcccaatg 9660

ttatgttaaa gctacagagt tggtatttgc ggacaaacat gggtcatggg gcactccttt 9720

agttcaaatg gaccggcctg ctgggctcaa tgacattggt atggtagctt ggaccttgaa 9780

gatgtccact cctgaatttc ctagtggtag ggagattatt gttgttgcaa atgatattac 9840

gttcagagct ggatcatttg gcccaaggga agatgcattt tttgaagctg ttaccaacct 9900

agcctgtgag aagaaacttc ctcttattta tttggcagca aattctggtg ctcgaattgg 9960

catagcagat gaagtgaaat cttgcttccg tgttgggtgg tctgatgatg gcagccctga 10020

acgtgggttt cagtacattt atctaagcga agaagactat gctcgtattg gcacttctgt 10080

catagcacat aagatgcagc tagacagtgg tgaaattagg tgggttattg attctgttgt 10140

gggcaaggaa gatggacttg gtgtggagaa tatacatgga agtgctgcta ttgccagtgc 10200

ttattctagg gcatataagg agacatttac acttacattt gtgactggaa gaactgttgg 10260

aataggagct tatcttgctc gacttggcat ccggtgcata cagcgtcttg accagcctat 10320

tattcttaca ggctattctg cactgaacaa gcttcttggg cgggaagtgt acagctccca 10380

catgcagttg ggtggtccca aaatcatggc aactaatggt gttgtccatc ttactgtttc 10440

agatgacctt gaaggcgttt ctaatatatt gaggtggctc agttatgttc ctgcctacat 10500

tggtggacca cttccagtaa caacaccgtt ggacccaccg gacagacctg ttgcatacat 10560

tcctgagaac tcgtgtgatc ctcgagcggc tatccgtggt gttgatgaca gccaagggaa 10620

atggttaggt ggtatgtttg ataaagacag ctttgtggaa acatttgaag gttgggctaa 10680

gacagtggtt actggcagag caaagcttgg tggaattcca gtgggtgtga tagctgtgga 10740

gactcagacc atgatgcaaa ctatccctgc tgaccctggt cagcttgatt cccgtgagca 10800

atctgttcct cgtgctggac aagtgtggtt tccagattct gcaaccaaga ctgcgcaggc 10860

attgctggac ttcaaccgtg aaggattacc tctgttcatc ctcgctaact ggagaggctt 10920

ctctggtgga caaagagatc tttttgaagg aattcttcag gctggctcga ctattgttga 10980

gaaccttagg acatacaatc agcctgcctt tgtctacatt cccatggctg cagagctacg 11040

aggaggggct tgggttgtgg ttgatagcaa gataaaccca gaccgcattg agtgctatgc 11100

tgagaggact gcaaaaggca atgttctgga accgcaaggg ttaattgaga tcaagttcag 11160

gtcagaggaa ctccaggatt gcatgagtcg gcttgaccca acattaattg atctgaaagc 11220

aaaactcgaa gtagcaaata aaaatggaag tgctgacaca aaatcgcttc aagaaaatat 11280

agaagctcga acaaaacagt tgatgcctct atatactcag attgcgatac ggtttgctga 11340

attgcatgat acatccctca gaatggctgc gaaaggtgtg attaagaaag ttgtggactg 11400

ggaagaatca cgatctttct tctataagag attacggagg aggatctctg aggatgttct 11460

tgcaaaagaa attagagctg tagcaggtga gcagttttcc caccaaccag caatcgagct 11520

gatcaagaaa tggtattcag cttcacatgc agctgaatgg gatgatgacg atgcttttgt 11580

tgcttggatg gataaccctg aaaactacaa ggattatatt caatatctta aggctcaaag 11640

agtatcccaa tccctctcaa gtctttcaga ttccagctca gatttgcaag ccctgccaca 11700

gggtctttcc atgttactag ataaggtaat tagcttactg atgcttatat aaattctttt 11760

tcattacata tggctggaga actatctaat caaataatga ttataattcc aatcgttctt 11820

tttatgccat tatgatcttc tgaaatttcc ttctttggac acttattcag atggatccct 11880

ctagaagagc tcaacttgtt gaagaaatca ggaaggtcct tggttga 11927

<210> 15

<211> 4203

<212> ДНК

<213> ДНК последовательность SpCas9 (ДНК последовательность)

<400> 15

atggctccga agaagaagag gaaggttggc atccacgggg tgccagctgc tgacaagaag 60

tactcgatcg gcctcgatat tgggactaac tctgttggct gggccgtgat caccgacgag 120

tacaaggtgc cctcaaagaa gttcaaggtc ctgggcaaca ccgatcggca ttccatcaag 180

aagaatctca ttggcgctct cctgttcgac agcggcgaga cggctgaggc tacgcggctc 240

aagcgcaccg cccgcaggcg gtacacgcgc aggaagaatc gcatctgcta cctgcaggag 300

attttctcca acgagatggc gaaggttgac gattctttct tccacaggct ggaggagtca 360

ttcctcgtgg aggaggataa gaagcacgag cggcatccaa tcttcggcaa cattgtcgac 420

gaggttgcct accacgagaa gtaccctacg atctaccatc tgcggaagaa gctcgtggac 480

tccacagata aggcggacct ccgcctgatc tacctcgctc tggcccacat gattaagttc 540

aggggccatt tcctgatcga gggggatctc aacccggaca atagcgatgt tgacaagctg 600

ttcatccagc tcgtgcagac gtacaaccag ctcttcgagg agaaccccat taatgcgtca 660

ggcgtcgacg cgaaggctat cctgtccgct aggctctcga agtctcggcg cctcgagaac 720

ctgatcgccc agctgccggg cgagaagaag aacggcctgt tcgggaatct cattgcgctc 780

agcctggggc tcacgcccaa cttcaagtcg aatttcgatc tcgctgagga cgccaagctg 840

cagctctcca aggacacata cgacgatgac ctggataacc tcctggccca gatcggcgat 900

cagtacgcgg acctgttcct cgctgccaag aatctgtcgg acgccatcct cctgtctgat 960

attctcaggg tgaacaccga gattacgaag gctccgctct cagcctccat gatcaagcgc 1020

tacgacgagc accatcagga tctgaccctc ctgaaggcgc tggtcaggca gcagctcccc 1080

gagaagtaca aggagatctt cttcgatcag tcgaagaacg gctacgctgg gtacattgac 1140

ggcggggcct ctcaggagga gttctacaag ttcatcaagc cgattctgga gaagatggac 1200

ggcacggagg agctgctggt gaagctcaat cgcgaggacc tcctgaggaa gcagcggaca 1260

ttcgataacg gcagcatccc acaccagatt catctcgggg agctgcacgc tatcctgagg 1320

aggcaggagg acttctaccc tttcctcaag gataaccgcg agaagatcga gaagattctg 1380

actttcagga tcccgtacta cgtcggccca ctcgctaggg gcaactcccg cttcgcttgg 1440

atgacccgca agtcagagga gacgatcacg ccgtggaact tcgaggaggt ggtcgacaag 1500

ggcgctagcg ctcagtcgtt catcgagagg atgacgaatt tcgacaagaa cctgccaaat 1560

gagaaggtgc tccctaagca ctcgctcctg tacgagtact tcacagtcta caacgagctg 1620

actaaggtga agtatgtgac cgagggcatg aggaagccgg ctttcctgtc tggggagcag 1680

aagaaggcca tcgtggacct cctgttcaag accaaccgga aggtcacggt taagcagctc 1740

aaggaggact acttcaagaa gattgagtgc ttcgattcgg tcgagatctc tggcgttgag 1800

gaccgcttca acgcctccct ggggacctac cacgatctcc tgaagatcat taaggataag 1860

gacttcctgg acaacgagga gaatgaggat atcctcgagg acattgtgct gacactcact 1920

ctgttcgagg accgggagat gatcgaggag cgcctgaaga cttacgccca tctcttcgat 1980

gacaaggtca tgaagcagct caagaggagg aggtacaccg gctgggggag gctgagcagg 2040

aagctcatca acggcattcg ggacaagcag tccgggaaga cgatcctcga cttcctgaag 2100

agcgatggct tcgcgaaccg caatttcatg cagctgattc acgatgacag cctcacattc 2160

aaggaggata tccagaaggc tcaggtgagc ggccaggggg actcgctgca cgagcatatc 2220

gcgaacctcg ctggctcgcc agctatcaag aaggggattc tgcagaccgt gaaggttgtg 2280

gacgagctgg tgaaggtcat gggcaggcac aagcctgaga acatcgtcat tgagatggcc 2340

cgggagaatc agaccacgca gaagggccag aagaactcac gcgagaggat gaagaggatc 2400

gaggagggca ttaaggagct ggggtcccag atcctcaagg agcacccggt ggagaacacg 2460

cagctgcaga atgagaagct ctacctgtac tacctccaga atggccgcga tatgtatgtg 2520

gaccaggagc tggatattaa caggctcagc gattacgacg tcgatcatat cgttccacag 2580

tcattcctga aggatgactc cattgacaac aaggtcctca ccaggtcgga caagaaccgg 2640

ggcaagtctg ataatgttcc ttcagaggag gtcgttaaga agatgaagaa ctactggcgc 2700

cagctcctga atgccaagct gatcacgcag cggaagttcg ataacctcac aaaggctgag 2760

aggggcgggc tctctgagct ggacaaggcg ggcttcatca agaggcagct ggtcgagaca 2820

cggcagatca ctaagcacgt tgcgcagatt ctcgactcac ggatgaacac taagtacgat 2880

gagaatgaca agctgatccg cgaggtgaag gtcatcaccc tgaagtcaaa gctcgtctcc 2940

gacttcagga aggatttcca gttctacaag gttcgggaga tcaacaatta ccaccatgcc 3000

catgacgcgt acctgaacgc ggtggtcggc acagctctga tcaagaagta cccaaagctc 3060

gagagcgagt tcgtgtacgg ggactacaag gtttacgatg tgaggaagat gatcgccaag 3120

tcggagcagg agattggcaa ggctaccgcc aagtacttct tctactctaa cattatgaat 3180

ttcttcaaga cagagatcac tctggccaat ggcgagatcc ggaagcgccc cctcatcgag 3240

acgaacggcg agacggggga gatcgtgtgg gacaagggca gggatttcgc gaccgtcagg 3300

aaggttctct ccatgccaca agtgaatatc gtcaagaaga cagaggtcca gactggcggg 3360

ttctctaagg agtcaattct gcctaagcgg aacagcgaca agctcatcgc ccgcaagaag 3420

gactgggatc cgaagaagta cggcgggttc gacagcccca ctgtggccta ctcggtcctg 3480

gttgtggcga aggttgagaa gggcaagtcc aagaagctca agagcgtgaa ggagctgctg 3540

gggatcacga ttatggagcg ctccagcttc gagaagaacc cgatcgattt cctggaggcg 3600

aagggctaca aggaggtgaa gaaggacctg atcattaagc tccccaagta ctcactcttc 3660

gagctggaga acggcaggaa gcggatgctg gcttccgctg gcgagctgca gaaggggaac 3720

gagctggctc tgccgtccaa gtatgtgaac ttcctctacc tggcctccca ctacgagaag 3780

ctcaagggca gccccgagga caacgagcag aagcagctgt tcgtcgagca gcacaagcat 3840

tacctcgacg agatcattga gcagatttcc gagttctcca agcgcgtgat cctggccgac 3900

gcgaatctgg ataaggtcct ctccgcgtac aacaagcacc gcgacaagcc aatcagggag 3960

caggctgaga atatcattca tctcttcacc ctgacgaacc tcggcgcccc tgctgctttc 4020

aagtacttcg acacaactat cgatcgcaag aggtacacaa gcactaagga ggtcctggac 4080

gcgaccctca tccaccagtc gattaccggc ctctacgaga cgcgcatcga cctgtctcag 4140

ctcgggggcg acaagcggcc agcggcgacg aagaaggcgg ggcaggcgaa gaagaagaag 4200

tga 4203

<210> 16

<211> 4203

<212> ДНК

<213> ДНК последовательность NGA-Cas9 (ДНК последовательность)

<400> 16

atggctccga agaagaagag gaaggttggc atccacgggg tgccagctgc tgacaagaag 60

tactcgatcg gcctcgatat tgggactaac tctgttggct gggccgtgat caccgacgag 120

tacaaggtgc cctcaaagaa gttcaaggtc ctgggcaaca ccgatcggca ttccatcaag 180

aagaatctca ttggcgctct cctgttcgac agcggcgaga cggctgaggc tacgcggctc 240

aagcgcaccg cccgcaggcg gtacacgcgc aggaagaatc gcatctgcta cctgcaggag 300

attttctcca acgagatggc gaaggttgac gattctttct tccacaggct ggaggagtca 360

ttcctcgtgg aggaggataa gaagcacgag cggcatccaa tcttcggcaa cattgtcgac 420

gaggttgcct accacgagaa gtaccctacg atctaccatc tgcggaagaa gctcgtggac 480

tccacagata aggcggacct ccgcctgatc tacctcgctc tggcccacat gattaagttc 540

aggggccatt tcctgatcga gggggatctc aacccggaca atagcgatgt tgacaagctg 600

ttcatccagc tcgtgcagac gtacaaccag ctcttcgagg agaaccccat taatgcgtca 660

ggcgtcgacg cgaaggctat cctgtccgct aggctctcga agtctcggcg cctcgagaac 720

ctgatcgccc agctgccggg cgagaagaag aacggcctgt tcgggaatct cattgcgctc 780

agcctggggc tcacgcccaa cttcaagtcg aatttcgatc tcgctgagga cgccaagctg 840

cagctctcca aggacacata cgacgatgac ctggataacc tcctggccca gatcggcgat 900

cagtacgcgg acctgttcct cgctgccaag aatctgtcgg acgccatcct cctgtctgat 960

attctcaggg tgaacaccga gattacgaag gctccgctct cagcctccat gatcaagcgc 1020

tacgacgagc accatcagga tctgaccctc ctgaaggcgc tggtcaggca gcagctcccc 1080

gagaagtaca aggagatctt cttcgatcag tcgaagaacg gctacgctgg gtacattgac 1140

ggcggggcct ctcaggagga gttctacaag ttcatcaagc cgattctgga gaagatggac 1200

ggcacggagg agctgctggt gaagctcaat cgcgaggacc tcctgaggaa gcagcggaca 1260

ttcgataacg gcagcatccc acaccagatt catctcgggg agctgcacgc tatcctgagg 1320

aggcaggagg acttctaccc tttcctcaag gataaccgcg agaagatcga gaagattctg 1380

actttcagga tcccgtacta cgtcggccca ctcgctaggg gcaactcccg cttcgcttgg 1440

atgacccgca agtcagagga gacgatcacg ccgtggaact tcgaggaggt ggtcgacaag 1500

ggcgctagcg ctcagtcgtt catcgagagg atgacgaatt tcgacaagaa cctgccaaat 1560

gagaaggtgc tccctaagca ctcgctcctg tacgagtact tcacagtcta caacgagctg 1620

actaaggtga agtatgtgac cgagggcatg aggaagccgg ctttcctgtc tggggagcag 1680

aagaaggcca tcgtggacct cctgttcaag accaaccgga aggtcacggt taagcagctc 1740

aaggaggact acttcaagaa gattgagtgc ttcgattcgg tcgagatctc tggcgttgag 1800

gaccgcttca acgcctccct ggggacctac cacgatctcc tgaagatcat taaggataag 1860

gacttcctgg acaacgagga gaatgaggat atcctcgagg acattgtgct gacactcact 1920

ctgttcgagg accgggagat gatcgaggag cgcctgaaga cttacgccca tctcttcgat 1980

gacaaggtca tgaagcagct caagaggagg aggtacaccg gctgggggag gctgagcagg 2040

aagctcatca acggcattcg ggacaagcag tccgggaaga cgatcctcga cttcctgaag 2100

agcgatggct tcgcgaaccg caatttcatg cagctgattc acgatgacag cctcacattc 2160

aaggaggata tccagaaggc tcaggtgagc ggccaggggg actcgctgca cgagcatatc 2220

gcgaacctcg ctggctcgcc agctatcaag aaggggattc tgcagaccgt gaaggttgtg 2280

gacgagctgg tgaaggtcat gggcaggcac aagcctgaga acatcgtcat tgagatggcc 2340

cgggagaatc agaccacgca gaagggccag aagaactcac gcgagaggat gaagaggatc 2400

gaggagggca ttaaggagct ggggtcccag atcctcaagg agcacccggt ggagaacacg 2460

cagctgcaga atgagaagct ctacctgtac tacctccaga atggccgcga tatgtatgtg 2520

gaccaggagc tggatattaa caggctcagc gattacgacg tcgatcatat cgttccacag 2580

tcattcctga aggatgactc cattgacaac aaggtcctca ccaggtcgga caagaaccgg 2640

ggcaagtctg ataatgttcc ttcagaggag gtcgttaaga agatgaagaa ctactggcgc 2700

cagctcctga atgccaagct gatcacgcag cggaagttcg ataacctcac aaaggctgag 2760

aggggcgggc tctctgagct ggacaaggcg ggcttcatca agaggcagct ggtcgagaca 2820

cggcagatca ctaagcacgt tgcgcagatt ctcgactcac ggatgaacac taagtacgat 2880

gagaatgaca agctgatccg cgaggtgaag gtcatcaccc tgaagtcaaa gctcgtctcc 2940

gacttcagga aggatttcca gttctacaag gttcgggaga tcaacaatta ccaccatgcc 3000

catgacgcgt acctgaacgc ggtggtcggc acagctctga tcaagaagta cccaaagctc 3060

gagagcgagt tcgtgtacgg ggactacaag gtttacgatg tgaggaagat gatcgccaag 3120

tcggagcagg agattggcaa ggctaccgcc aagtacttct tctactctaa cattatgaat 3180

ttcttcaaga cagagatcac tctggccaat ggcgagatcc ggaagcgccc cctcatcgag 3240

acgaacggcg agacggggga gatcgtgtgg gacaagggca gggatttcgc gaccgtcagg 3300

aaggttctct ccatgccaca agtgaatatc gtcaagaaga cagaggtcca gactggcggg 3360

ttctctaagg agtcaattct gcctaagcgg aacagcgaca agctcatcgc ccgcaagaag 3420

gactgggatc cgaagaagta cggcgggttc gtcagcccca ctgtggccta ctcggtcctg 3480

gttgtggcga aggttgagaa gggcaagtcc aagaagctca agagcgtgaa ggagctgctg 3540

gggatcacga ttatggagcg ctccagcttc gagaagaacc cgatcgattt cctggaggcg 3600

aagggctaca aggaggtgaa gaaggacctg atcattaagc tccccaagta ctcactcttc 3660

gagctggaga acggcaggaa gcggatgctg gcttccgctg gcgagctgca gaaggggaac 3720

gagctggctc tgccgtccaa gtatgtgaac ttcctctacc tggcctccca ctacgagaag 3780

ctcaagggca gccccgagga caacgagcag aagcagctgt tcgtcgagca gcacaagcat 3840

tacctcgacg agatcattga gcagatttcc gagttctcca agcgcgtgat cctggccgac 3900

gcgaatctgg ataaggtcct ctccgcgtac aacaagcacc gcgacaagcc aatcagggag 3960

caggctgaga atatcattca tctcttcacc ctgacgaacc tcggcgcccc tgctgctttc 4020

aagtacttcg acacaactat cgatcgcaag cagtaccgga gcactaagga ggtcctggac 4080

gcgaccctca tccaccagtc gattaccggc ctctacgaga cgcgcatcga cctgtctcag 4140

ctcgggggcg acaagcggcc agcggcgacg aagaaggcgg ggcaggcgaa gaagaagaag 4200

tga 4203

<210> 17

<211> 5860

<212> ДНК

<213> ДНК последовательность генома OsBADH2 Oryza sativa L. (ДНК

последовательность)

<400> 17

atggccacgg cgatcccgca gcggcagctc ttcgtcgccg gcgagtggcg cgcccccgcg 60

ctcggccgcc gcctccccgt cgtcaacccc gccaccgagt cccccatcgg taccctcctc 120

ttcaccctct ccaccctctg cttctgcctc tgattagcct ttttgttgtt gttgttgttg 180

ctgctgtttt ttgcgtgtcg gtgcgcaggc gagatcccgg cgggcacggc ggaggacgtg 240

gacgcggcgg tggcggcggc gcgggaggcg ctgaagagga accggggccg cgactgggcg 300

cgcgcgccgg gcgccgtccg ggccaagtac ctccgcgcaa tcgcggccaa ggtagggtgg 360

tgactacccc cacccccccc ccccccccca acgcgacccg cgtgcgtgtg ttccgtacag 420

ggggaggagc tccgcgtggc tctccagtag gtttttgagc cccaaatcga tcgatatgct 480

ctagttttaa gtttgctgct taaattcctc aagggtttag tttgcaacca aatccttatt 540

ttagcttcgg tataagcccc ccatatgatg tgcgtgcgtc ggcatcggaa gtgcgtatcc 600

tctgttctgg actaggaatt ggccataggt tgatcgacag ttcgagtatt ctgcttctgt 660

ttggaataag ttggaagcat ggctgattgt gtatctggat gctgtttttg tggtgattcg 720

tttcaagctc ttgttaattg atgggttcaa gcggagaggg tgcgcaacaa caagtgtata 780

tggctcacgg ccatgggtgt gcacatttga ttggtgcgca acaacaagtg tatattgttt 840

gtgtgcttcg ttagttggca ggtcctagtc actaaatcac tattggattg gtactagtta 900

cttttgtgcc ttgacgatgg gactggatta ctagcctttt ggttgccttt gtggtattcc 960

gttgttatgg gcctgttgat ggatggatcc ctttaatttc tagtgccaaa tgcatgctag 1020

atttctcaca gtttttctct tcaggttata tttctcgtat ttccttttcc taaaggattg 1080

ctttttcatg tattttctgg catatatagg ttattattat tattattctc cagaacaaga 1140

ttacccatat tatggatcac tagtgtacac ttttttggat gaaaaaccta cttactgaaa 1200

gtaaaacagt gaccagtgca cactttactt gaactgtcaa accatcaatt ttctagcaaa 1260

gcaggggatg ctagccttcc agtctaaatg acagtaaact actatacttt tgtccgtagg 1320

tttggaaata tgctaatttc tatcataaaa attttcatgg catatgcgag cattttatga 1380

tcaccttttc cctttttctt cagataatcg agaggaaatc tgagctggct agactagaga 1440

cgcttgattg tgggaagcct cttgatgaag cagcatggga catggtatgt ggccagttat 1500

ccactgtatg aatatgtagt tgcctacaca gcaatctttc ctgaacatga atcctgatgt 1560

atgatattcc atttgtcagg acgatgttgc tggatgcttt gagtactttg cagatcttgc 1620

agaatccttg gacaaaaggc aaaatgcacc tgtctctctt ccaatggaaa actttaaatg 1680

ctatcttcgg aaagagccta tcggtgtagt tgggttgatc acaccttggt atttcacatt 1740

tttctctcat cctgcgctta tatttattta tgacccaagc atggtactaa atagtactag 1800

taacatgcat atactgaatg agtttacaac tttacatgat ttttttgaac tatgaaagtt 1860

gaagacattt gagattttat tcctcttctc ttgtgcaaac atattattgt ctcacaaatt 1920

gtacctagca gctactctct ccgtttcata ttataagtcg tttgactttt ttcctagtca 1980

aaatgtgtta agtttgacca agtttataga aaaatttagc aacatctaaa atatcaaagt 2040

catgttttag tgttttttca ggctctcatg taagcaattt tgatgtgccc tctcctttct 2100

tcttaatata atgatacaca gctcttgtgt attcaaagga aaatatatat atatataatg 2160

atacacacct ctcctccgtg ttaatgcagc tcatttgttc tgtcccggtt caaatatcta 2220

tttttctcat atgttgtcag catgattcac ttaatttagt atatagaaga tgccattatt 2280

tatgtctgga atcttactgc agaagggaaa acaattgata acggaattga ttgcattcta 2340

atttgttgtt tctttgttat gttcttatcg acaattacaa atttgattct gagaatcatg 2400

ttcgggatgt gtatttctac tgcaggaact atcctctcct gatggcaaca tggaaggtag 2460

ctcctgccct ggctgctggc tgtacagctg tactaaaacc atctgaattg gcttccgtgt 2520

aagtttaaca tgttaacttg ttaatgtcat acccatgcta gttgcaatga catttgattt 2580

taaaatgttg tggcatgtcc atgctgcaag caatgtaatt tgaaatctct ctctatcatt 2640

aattaccagg acttgtttgg agcttgctga tgtgtgtaaa gaggttggtc ttccttcagg 2700

tgtgctaaac atagtgactg gattaggttc tgaagccggt gctcctttgt catcacaccc 2760

tggtgtagac aaggtacagc tattcctcct gtaatcatgt ataccccatc aatggaaatg 2820

atattcctct caatacatgg tttatgtttt ctgttaggtt gcatttactg ggagttatga 2880

aactggtaaa aagattatgg cttcagctgc tcctatggtt aaggtttgtt tccaaatttc 2940

tgtggatatt ttttgttctc tttctactaa ctctctatta tcaattctca atgttgtcct 3000

tttcttttaa ctcctttact ttttagaatt gtgatcaaga cactttgagc atcattctag 3060

tagccagttc tatcctgttt cttacctttt tatggttcgt cttttcttga cagcctgttt 3120

cactggaact tggtggaaaa agtcctatag tggtgtttga tgatgttgat gttgaaaaag 3180

gtacatgcca cttgctatga ttaactaatt ctgaagtgcg ggactttgta aagcacttaa 3240

ctgagctgga tgctagaccc ccaaaagccc tttttggtgt cttgggcttg ttgcagaaat 3300

actggtccca gacgagcagg atgcaagaaa attaactact tttgccactg attagtattt 3360

cttagaagtt acacctcaag gattagcaat actttcttaa aatgtgctat tgattaaaaa 3420

gatgtcctgt attattttga gcagatcttg tactggttga tcggcttgca tgaaaatatt 3480

gttgaggatt ataatgccat gccaactgag taaagaaaag agttgtaaaa tatgttatgc 3540

aacatgaata tatatgtgat ttcatttttc ctttttcttt tcgtggcaag gaaggcagtt 3600

aggaaggact gatgtgaaaa gcacaagtac tattcttagt tctggaaaac tgtgttcttt 3660

attttcctaa ctacaattca ccttgattag tcagtaactt gatattggca attctagctg 3720

attatgaatt ctgtttatat ttcactaatt ttgaatcttt aattacattt tatggttgaa 3780

atttaacgtt ttgtctggtt atggactctg tttgtattca ctcaatttgg atcttccatt 3840

agatttcatt gttggtcctt cttcttgtac agctgttgag tggactctct ttggttgctt 3900

ttggaccaat ggccagattt gcagtgcaac atcgcgtctt attcttcatg taagcattga 3960

atatatccgt caatcataat ctattgttgt acttgatttt ttttctgatc aactcctgag 4020

ttcagattat tatatgatgc cattactatt gcacagagcg aataaaattg tatttatgca 4080

cagcatgtat tttgagtaat atatgcattg cctattattt aatatataga ttgtagcact 4140

taattttgtg tccatgtctc tatgatgttt attactttat tattgccggc atgaagcaac 4200

tttgaactct atgttgatct tgaactaaaa ttgaaattaa ttggcttatt gctattaatg 4260

atatagcttt cagcttcttg ctcctgacca tgaaagtttt gcagaaaaaa atcgctaaag 4320

aatttcaaga aaggatggtt gcatgggcca aaaatattaa ggtgtcagat ccacttgaag 4380

agggttgcag gcttgggccc gttgttagtg aaggacaggt accacatgta aactttttct 4440

aaattcaaaa aagaaatgcc actgatcaat ggtaggtcct tccaagcctt attgctggat 4500

tgttgcactg ttttgtcaat tttgtgtaat atagttctga atgaattagt cggtgtatgc 4560

tcttgctagt tgctagtatg tggtacaggg tcttcctact ttgagcaaat tcgtgttaaa 4620

atgcattgat gaaaaggcca cctttccgta ggtttatctt gtcataattt aaaccccaat 4680

aaaattttaa ttttttgttt tgaccccatg gcactttaat gaaatcactt agccatgagc 4740

ttttgtatat attttcaaag caccagaatg tttagatggt ttgttggaaa tcttacacat 4800

cctattgcct tgtgtcagta tgagaagatt aagcaatttg tatctaccgc caaaagccaa 4860

ggtgctacca ttctgactgg tggggttaga cccaaggtaa taatctacta cacggttgta 4920

tatataggta cccacatatc attatgaagt agaaataatc ttgtatgttt ttgtcagcat 4980

ctggagaaag gtttctatat tgaacccaca atcattactg atgtcgatac atcaatgcaa 5040

atttggaggg aagaagtttt tggtccagtg ctctgtgtga aagaatttag cactgaagaa 5100

gaagccattg aattggccaa cgatactcag tgagtttttt ttttaataca gttcattgtc 5160

ctgttcaatc ttgcagcata tgtatatact ctgtggcata tgaacttatt ctgctactac 5220

tacttttgat agttatggtc tggctggtgc tgtgctttcc ggtgaccgcg agcgatgcca 5280

gagattaact gaggtatatc caagtgaagg gggttggcat tgtttgattc atatgacatg 5340

gttgcatcaa gctgatattc aagaatctca tttattactt gcattctatg catctccagt 5400

tcttccctgg actccggtca atgttaatat agtttgtttg ctagtagtat gctactccaa 5460

ttaagttgct cttcacttcc acatcatctg atccatgact ttatatttga cccctttttt 5520

ttgcaaaaga aagggaaata cttaacgaaa atttcctact gcaggagatc gatgccggaa 5580

ttatctgggt gaactgctcg caaccctgct tctgccaagc tccatggggc gggaacaagc 5640

gcagcggctt tggacgcgag ctcggagaag ggtgggtagc acacaacaat ctcactttaa 5700

aacaccattt cgatcgtctg atgatctcga cctgacatca tgcctttggt attttcattc 5760

acttttcagg ggcattgaca actacctaag cgtcaagcaa gtgacggagt acgcctccga 5820

tgagccgtgg ggatggtaca aatccccttc caagctgtaa 5860

<210> 18

<211> 2192

<212> ДНК

<213> ДНК последовательность генома OsSWEET14 Oryza sativa L. (ДНК

последовательность)

<400> 18

atggctggca tgtctcttca gcatccctgg gccttcgcct ttggtctcct aggtgtgttg 60

cctttgatct gatccaagga attctcttga gaattaatct tgcatggtta tttacttttg 120

ttgttattat tctctacatt tttaatcatg tacttttcca tgttccactt ttgttgccaa 180

agctactata tttttcctac caattcatcc aaaactacta tattatagca aggcagctag 240

tggatcgact ttgcactttt ggatgcaatt gtgagtggtt tacattagag gggccatgca 300

tagccaaata aattgtttgg caaaatatga tttcccttgt agttagcaca atattgtgat 360

ctttcattcc tttactcttt ttgttccacc accctcatta ttgcaaagcc ccctctttta 420

gaaccaaact aaagataaga aacatttgat tcatcattag aggagattag atatacatac 480

atactacaca tgcattgctg tgataagcct agccaggcac agaaagagcc aagacaaaag 540

gagctcaaaa gaaaaggggc tccaatatct tgcccggcct gatcagtgta acatgacgtc 600

acccacacaa ttattaaaag gatagatgca tatgtgttcg ttacgtatct ccttgtgtca 660

cgttgctgtg catggttcac tcgcttaatt ataacgtccg tcgcatttta tgcatgcact 720

tcgtttttag ttaatcaaat taaacaagat cctaacatat gatttctatt ttattctctt 780

tgcaggcaac atcatctcct tcatgaccta cctggcccca ctgtaagtcc cacacatccg 840

gatattttct tttctttagc gaaattttac attgctccag aaagtacctt ttacactaaa 900

atttcttata caccaccata aaattaatgt ggtactattg gtaccttatc aaaaatgata 960

aaattacctt tttcttcaga taaaaacact ccccgtctct gtataactaa gatgtagaca 1020

accaatacac atgtctagag ctaatcctat caattaacat tgctagtaaa tacaaggaaa 1080

aatataaaga attaaccaat tgcttggatg tcttgcaggc cgacgttcta caggatctac 1140

aagagcaagt cgacgcaggg gttccagtcg gtaccctacg tggtggcgct gttcagcgcg 1200

atgctgtgga tctactacgc gctgctcaag tccgacgagt gcctcctcat caccatcaac 1260

tccgctggct gcgtcatcga gaccatctac atcgccgtct acctcgtcta cgcccccaag 1320

aaggccaaga tgttcaccgc caagctcctc ctcctcgtca acgtcggcgt cttcggcctc 1380

atcctcctcc tcaccctcct cctctccgcc ggcgaccgcc gcatcgtggt tcttggttgg 1440

gtctgcgttg gcttctccgt cagcgtcttc gtcgcccccc ttagcatcat cgtaagaaac 1500

cctagaattg cctgtaaaca ataataactt tcggtctctg caccaactaa ggatgcacat 1560

atttacgcac cgcttttgct atctctgcag aggctggtgg tgcgcaccaa gagcgtggag 1620

ttcatgccgt tctcgctctc cttctccctc accatcagcg ccgtcgtctg gttcctctac 1680

ggcctcctca tcaaggacaa atatgtcgct gtgagtagct ccgattcgac ccgttcttct 1740

tcctaaattt tccgctgctc gatttaattt ctatttctaa ttgtggaaga ttgtttaatt 1800

atagtgatta tggctagctg ataaccgatt ttaatttctg atggtgatcc aaaatggaac 1860

agcttcccaa cgtgctgggc ttctccttcg gcgtcatcca gatggggctg tacgccatgt 1920

acaggaactc gacgcccaag gccgtgctga ccaaggaggt cgaggcggcg acggccaccg 1980

gcgacgacga ccactccgcc gccggcgtca aggagcacgt cgtcaacatc gccaagctct 2040

ctgccgccgt cgacgtcgtc aagacccgcg aggtgcaccc cgtcgacgtc gagtccccgc 2100

cggcagaggc gccgcctgag gaggacgaca aggccgccgc cgccaccgcc gccgccgtcg 2160

ccggcgccgg cgagaagaag gtagctgcat ga 2192

<210> 19

<211> 657

<212> БЕЛОК

<213> Аминокислотная последовательность белка StALS2 Solanum tuberosum

L. (аминокислотная последовательность)

<400> 19

Met Ala Ala Ala Ser Pro Ser Pro Cys Phe Ser Lys Asn Leu Pro Pro

1 5 10 15

Ser Ser Ser Lys Ser Ser Ile Leu Leu Pro Lys Ser Thr Phe Thr Phe

20 25 30

His Asn His Pro Lys Asn Thr Ser Pro Leu His Leu Thr His Thr Gln

35 40 45

His His Ser Arg Phe Thr Val Ser Asn Val Ile Leu Ser Thr Thr Thr

50 55 60

His Asn Asp Val Ser Glu Pro Glu Ile Phe Val Ser Arg Phe Ala Pro

65 70 75 80

Asp Glu Pro Arg Lys Gly Cys Asp Val Leu Val Glu Ala Leu Glu Arg

85 90 95

Glu Gly Val Lys Asp Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala Ser Met Glu

100 105 110

Ile His Gln Ala Leu Thr Arg Ser Asn Ile Ile Arg Asn Val Leu Pro

115 120 125

Arg His Glu Gln Gly Gly Val Phe Ala Ala Glu Gly Tyr Ala Arg Ala

130 135 140

Thr Gly Phe Pro Gly Val Cys Ile Ala Thr Ser Gly Pro Gly Ala Thr

145 150 155 160

Asn Leu Val Ser Gly Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp Ser Ile Pro Ile

165 170 175

Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Pro Arg Arg Met Ile Gly Thr Asp Ala

180 185 190

Phe Gln Glu Thr Pro Ile Val Glu Val Thr Arg Ser Ile Thr Lys His

195 200 205

Asn Tyr Leu Val Met Asp Val Glu Asp Ile Pro Arg Val Val Arg Glu

210 215 220

Ala Phe Phe Leu Ala Lys Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val Leu Ile Asp

225 230 235 240

Val Pro Lys Asp Ile Gln Gln Gln Leu Val Ile Pro Asn Trp Asp Gln

245 250 255

Pro Met Arg Leu Pro Gly Tyr Ile Ser Arg Leu Pro Lys Leu Pro Asn

260 265 270

Glu Met Leu Leu Glu Gln Ile Val Arg Leu Ile Ser Glu Ser Lys Lys

275 280 285

Pro Val Leu Tyr Val Gly Gly Gly Cys Thr Gln Ser Ser Glu Glu Leu

290 295 300

Arg Arg Phe Val Glu Leu Thr Gly Ile Pro Val Ala Ser Thr Leu Met

305 310 315 320

Gly Leu Gly Thr Phe Pro Cys Gly Asp Glu Leu Ser Leu Gln Met Leu

325 330 335

Gly Met His Gly Thr Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Asp Ser Ser Asp

340 345 350

Leu Leu Leu Ala Phe Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys

355 360 365

Leu Glu Ala Phe Ala Ser Arg Ala Lys Ile Val His Ile Asp Ile Asp

370 375 380

Ser Ala Glu Ile Gly Lys Asn Lys Gln Pro His Val Ser Ile Cys Ala

385 390 395 400

Asp Ile Lys Leu Ala Leu Gln Gly Leu Asn Ser Ile Leu Glu Gly Lys

405 410 415

Glu Gly Lys Leu Lys Leu Asp Phe Ser Ala Trp Arg Gln Glu Leu Thr

420 425 430

Glu Gln Lys Val Lys Tyr Pro Leu Asn Tyr Lys Thr Phe Gly Glu Ala

435 440 445

Ile Pro Pro Gln Tyr Ala Ile Gln Val Leu Asp Glu Leu Thr Asn Gly

450 455 460

Asn Ala Ile Ile Ser Thr Gly Val Gly Gln His Gln Met Trp Ala Ala

465 470 475 480

Gln Tyr Tyr Lys Tyr Lys Lys Pro Arg Gln Trp Leu Thr Ser Gly Gly

485 490 495

Leu Gly Ala Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ile Gly Ala Ala Val

500 505 510

Gly Arg Pro Gly Glu Ile Val Val Asp Ile Asp Gly Asp Gly Ser Phe

515 520 525

Ile Met Asn Val Gln Glu Leu Ala Thr Ile Lys Val Glu Asn Leu Pro

530 535 540

Val Lys Ile Met Leu Leu Asn Asn Gln His Leu Gly Met Val Val Gln

545 550 555 560

Trp Glu Asp Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr Tyr Leu Gly

565 570 575

Asn Pro Ala Asn Glu Glu Glu Ile Phe Pro Asn Met Leu Lys Phe Ala

580 585 590

Glu Ala Cys Gly Val Pro Ala Ala Arg Val Ser His Arg Asp Asp Leu

595 600 605

Arg Ala Ala Ile Gln Lys Met Leu Asp Thr Pro Gly Pro Tyr Leu Leu

610 615 620

Asp Val Ile Val Pro His Gln Glu His Val Leu Pro Met Ile Pro Ser

625 630 635 640

Gly Gly Ala Phe Lys Asp Val Ile Thr Glu Gly Asp Gly Arg Arg Ser

645 650 655

Tyr

<210> 20

<211> 1974

<212> ДНК

<213> ДНК последовательность гена StALS2 Solanum tuberosum L. (ДНК

последовательность)

<400> 20

atggcggctg catctccatc tccttgtttt tccaaaaacc tacctccatc ttcatcaaaa 60

tcttccatcc ttcttcccaa atctaccttt actttccaca atcaccccaa aaatacctca 120

ccccttcacc ttacccacac ccaacatcat agccgtttca ctgtctcaaa tgtcatccta 180

tcaaccacga cccataacga cgtttctgaa cccgaaatct tcgtttcacg tttcgcccct 240

gacgaaccca gaaagggttg tgatgttctt gtggaggcac ttgaaaggga aggggttaag 300

gatgtatttg catacccagg aggtgcttcc atggagattc atcaggcttt gacacgttcc 360

aatattattc gtaatgtgct gccacgtcat gaacagggtg gtgtgtttgc tgcagagggt 420

tacgcacggg ccactgggtt ccctggtgtt tgcattgcta catctggtcc gggagctacg 480

aatcttgtta gcggtcttgc ggatgctttg ttggatagta ttccgattgt tgctattacg 540

ggtcaagtgc cgaggaggat gattggtact gatgcgtttc aggaaactcc tattgttgag 600

gtaacgagat ccattacgaa gcataattat cttgttatgg atgtagagga tattcctagg 660

gttgttcgtg aagcgttttt tctagcgaaa tcgggacggc ctggaccggt tctgattgat 720

gttcctaagg atattcagca acaattggtg atacctaatt gggatcagcc aatgaggttg 780

cctggttaca tctctaggtt gcctaaattg cctaatgaga tgcttttgga acaaattgtt 840

aggctgattt cggagtcgaa gaagcctgtt ttgtatgtgg gtggtgggtg tacacaatcg 900

agtgaggagc tgagacgatt tgtggagctt acgggtattc ctgtggcgag tactttgatg 960

ggtcttggaa cttttccatg tggggatgag ctttctcttc aaatgttggg tatgcatggg 1020

actgtgtatg ctaattatgc ggtggatagt agtgatttgt tgcttgcatt tggggtgagg 1080

tttgatgatc gagttactgg taaattggaa gcttttgcta gccgagcgaa aattgtccac 1140

attgatattg attcggctga gattggaaag aacaagcaac ctcatgtttc catttgtgca 1200

gatatcaagt tggcattaca gggtttgaat tccatattgg agggtaaaga aggtaagctg 1260

aagttggact tttctgcttg gaggcaggag ttaacggagc agaaggtgaa gtacccattg 1320

aattataaga cttttggtga agccatccct ccacaatatg ctattcaggt tcttgatgag 1380

ttaactaacg gaaatgccat tattagtact ggtgtggggc aacaccaaat gtgggctgcc 1440

caatactata agtacaaaaa gccacgccaa tggttgacat ctggtggatt aggagcaatg 1500

ggatttggtt tgcctgctgc tataggtgcg gctgttggaa gaccgggtga gattgtggtt 1560

gacattgatg gtgacgggag ttttatcatg aatgtgcagg agttagcaac aattaaggtg 1620

gagaatctcc cagttaagat tatgttactg aataatcaac acttgggaat ggtggttcag 1680

tgggaggatc gattctataa ggctaacaga gcacacactt acttgggtaa tcctgctaat 1740

gaggaagaaa tcttccctaa tatgctgaaa tttgcagagg cttgtggcgt acctgctgca 1800

agagtgtcac acagggatga tcttagagct gccattcaaa agatgttaga cactcctggg 1860

ccatacttgt tggatgtgat tgtacctcat caggagcacg ttctacctat gattcccagt 1920

ggtggcgctt tcaaagatgt gattacggag ggtgatggga gacgttccta ttga 1974

<210> 21

<211> 1424

<212> ДНК

<213> ДНК последовательность гена HBB (содержащая интрон)(ДНК

последовательность)

<400> 21

atggtgcacc tgactcctga ggagaagtct gccgttactg ccctgtgggg caaggtgaac 60

gtggatgaag ttggtggtga ggccctgggc aggttggtat caaggttaca agacaggttt 120

aaggagacca atagaaactg ggcatgtgga gacagagaag actcttgggt ttctgatagg 180

cactgactct ctctgcctat tggtctattt tcccaccctt aggctgctgg tggtctaccc 240

ttggacccag aggttctttg agtcctttgg ggatctgtcc actcctgatg ctgttatggg 300

caaccctaag gtgaaggctc atggcaagaa agtgctcggt gcctttagtg atggcctggc 360

tcacctggac aacctcaagg gcacctttgc cacactgagt gagctgcact gtgacaagct 420

gcacgtggat cctgagaact tcagggtgag tctatgggac gcttgatgtt ttctttcccc 480

ttcttttcta tggttaagtt catgtcatag gaaggggata agtaacaggg tacagtttag 540

aatgggaaac agacgaatga ttgcatcagt gtggaagtct caggatcgtt ttagtttctt 600

ttatttgctg ttcataacaa ttgttttctt ttgtttaatt cttgctttct ttttttttct 660

tctccgcaat ttttactatt atacttaatg ccttaacatt gtgtataaca aaaggaaata 720

tctctgagat acattaagta acttaaaaaa aaactttaca cagtctgcct agtacattac 780

tatttggaat atatgtgtgc ttatttgcat attcataatc tccctacttt attttctttt 840

atttttaatt gatacataat cattatacat atttatgggt taaagtgtaa tgttttaata 900

tgtgtacaca tattgaccaa atcagggtaa ttttgcattt gtaattttaa aaaatgcttt 960

cttcttttaa tatacttttt tgtttatctt atttctaata ctttccctaa tctctttctt 1020

tcagggcaat aatgatacaa tgtatcatgc ctctttgcac cattctaaag aataacagtg 1080

ataatttctg ggttaaggca atagcaatat ctctgcatat aaatatttct gcatataaat 1140

tgtaactgat gtaagaggtt tcatattgct aatagcagct acaatccagc taccattctg 1200

cttttatttt atggttggga taaggctgga ttattctgag tccaagctag gcccttttgc 1260

taatcatgtt catacctctt atcttcctcc cacagctcct gggcaacgtg ctggtctgtg 1320

tgctggccca tcactttggc aaagaattca ccccaccagt gcaggctgcc tatcagaaag 1380

tggtggctgg tgtggctaat gccctggccc acaagtatca ctaa 1424

<210> 22

<211> 444

<212> ДНК

<213> CDS последовательность гена HBB (ДНК последовательность)

<400> 22

atggtgcacc tgactcctga ggagaagtct gccgttactg ccctgtgggg caaggtgaac 60

gtggatgaag ttggtggtga ggccctgggc aggctgctgg tggtctaccc ttggacccag 120

aggttctttg agtcctttgg ggatctgtcc actcctgatg ctgttatggg caaccctaag 180

gtgaaggctc atggcaagaa agtgctcggt gcctttagtg atggcctggc tcacctggac 240

aacctcaagg gcacctttgc cacactgagt gagctgcact gtgacaagct gcacgtggat 300

cctgagaact tcaggctcct gggcaacgtg ctggtctgtg tgctggccca tcactttggc 360

aaagaattca ccccaccagt gcaggctgcc tatcagaaag tggtggctgg tgtggctaat 420

gccctggccc acaagtatca ctaa 444

<210> 23

<211> 147

<212> БЕЛОК

<213> Аминокислотная последовательность гена HBB (аминокислотная

последовательность)

<400> 23

Met Val His Leu Thr Pro Glu Glu Lys Ser Ala Val Thr Ala Leu Trp

1 5 10 15

Gly Lys Val Asn Val Asp Glu Val Gly Gly Glu Ala Leu Gly Arg Leu

20 25 30

Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe Phe Glu Ser Phe Gly Asp

35 40 45

Leu Ser Thr Pro Asp Ala Val Met Gly Asn Pro Lys Val Lys Ala His

50 55 60

Gly Lys Lys Val Leu Gly Ala Phe Ser Asp Gly Leu Ala His Leu Asp

65 70 75 80

Asn Leu Lys Gly Thr Phe Ala Thr Leu Ser Glu Leu His Cys Asp Lys

85 90 95

Leu His Val Asp Pro Glu Asn Phe Arg Leu Leu Gly Asn Val Leu Val

100 105 110

Cys Val Leu Ala His His Phe Gly Lys Glu Phe Thr Pro Pro Val Gln

115 120 125

Ala Ala Tyr Gln Lys Val Val Ala Gly Val Ala Asn Ala Leu Ala His

130 135 140

Lys Tyr His

145

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу создания новой мутации в организме, который включает следующие стадии: последовательное создание двух или нескольких разрывов ДНК в специфичном сайте генома организма и их спонтанная репарация, соответственно, где более поздний разрыв ДНК создается на основе новой последовательности, созданной в результате предыдущей репарации разрыва ДНК, к способу лизиса ДНК-мишени, включающему контакт ДНК-мишени с комплексом, включающему полипептид Cas и, по меньшей мере, две таргетирующие РНК, а также к композиции и набору для их выполнения. Также раскрыты способ скрининга событий редактирования независимо от экзогенного трансгенного маркера, включающий последовательное создание двух или несколько разрывов ДНК в специфичном сайте первого гена-мишени клетки-реципиента и спонтанную репарацию, соответственно, где более поздний разрыв ДНК создают на основе новой последовательности, полученной в результате репарации предыдущего разрыва ДНК, а также способ нетрансгенного временного редактирования генома организма. Изобретение эффективно для создания новой мутации в организме. 6 н. и 20 з.п. ф-лы, 29 ил., 7 табл., 13 пр.

1. Способ создания новой мутации в организме, который включает следующие стадии: последовательное создание двух или нескольких разрывов ДНК в специфичном сайте генома организма и их спонтанная репарация, соответственно, где более поздний разрыв ДНК создается на основе новой последовательности, созданной в результате предыдущей репарации разрыва ДНК,

где «разрыв ДНК» достигается путем доставки нуклеазы с таргетирующим свойством в клетку организма для контакта со специфичным сайтом геномной ДНК, и

где «нуклеазой с таргетным свойством» является система CRISPR/Cas, где «последовательное создание двух или нескольких разрывов ДНК в специфичном сайте» относится к такому, которое основано на новой последовательности, образованной предыдущим событием репарации разрыва ДНК, созданным CRISPR/Cas системой, конструируют новую таргетирующую РНК для направления нуклеазы для повторного разрезания указанного сайта, где указанная таргетирующая РНК представляет собой sgРНК или CRISPR-РНК (crРНК).

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что «два или несколько разрывов ДНК» создаются путем последовательной доставки разных таргетных нуклеаз в клетки-реципиенты разных поколений, где мутантную клетку, завершившую предыдущее редактирование, используют в качестве реципиента для получения доставки таргетной нуклеазы для последующего редактирования, тем самым выполняя второе редактирование для создания сайт-специфичной мутации; или

«два или несколько разрывов ДНК» создаются путем доставки разных таргетных нуклеаз для разных мишеней в одну и ту же клетку-реципиент; или

«два или несколько разрывов ДНК» создаются, когда комплексы RNP, образованные одной и той же CRISPR/Cas нуклеазой, соответственно, с разными crРНК или sgРНК, последовательно разрезают соответствующие последовательности-мишени; или

«два или несколько разрывов ДНК» создаются, когда комплексы RNP, соответственно, образованные каждой из двух или нескольких CRISPR/Cas нуклеаз, которые распознают разные последовательности PAM, с соответствующими crРНК или sgРНК, последовательно разрезают соответствующие последовательности-мишени.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что таргетной нуклеазой является любая CRISPR/Cas нуклеаза, способная осуществлять редактирование генома.

4. Способ по п.2, отличающийся тем, что целевая нуклеаза находится в форме ДНК;

или в форме mРНК или белка вместо ДНК.

5. Способ по п.2, отличающийся тем, что способ доставки таргетной нуклеазы в клетку выбран из: 1) способа ПЭГ-опосредованной трансфекции клеток; 2) способа липосомно-опосредованной трансфекции клеток; 3) способа электропорационной трансформации; 4) микроинъекции; 5) бомбардировки генной пушкой; или 6) способа Agrobacterium-опосредованной трансформации.

6. Способ лизиса ДНК-мишени, включающий контакт ДНК-мишени с комплексом, где комплекс включает:

(а) полипептид Cas; и

(b) по меньшей мере, две таргетирующие РНК, в которых первая таргетирующая РНК таргетирует ДНК-мишень, чтобы вызвать разрыв в специфичном сайте ДНК-мишени, и последняя таргетирующая РНК таргетирует последовательность, созданную в результате предыдущего события репарации разрыва, и снова создает разрыв в указанном специфичном сайте, где указанная таргетирующая РНК представляет собой sgРНК или crРНК.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что контакт включает введение в клетку следующего: (а) Cas полипептида или полинуклеотида, кодирующего Cas полипептид, и (b) тергетирующей РНК или ДНК полинуклеотида, кодирующего таргетирующую РНК.

8. Композиция для выполнения способа по п. 6 или 7, содержащая:

(а) Cas полипептид или полинуклеотид, кодирующий Cas полипептид; и

(b) по меньшей мере, две таргетирующие РНК или ДНК полинуклеотида, кодирующих указанные таргетирующие РНК, где первая РНК таргетирует ДНК-мишень, чтобы вызвать разрыв в специфичном сайте ДНК-мишени, и последняя таргетирующая РНК таргетирует последовательность, созданную в результате предыдущего события репарации разрыва, и снова создает разрыв в указанном специфичном сайте, где указанная таргетирующая РНК представляет собой sgРНК или crРНК.

9. Набор для выполнения способа по п. 6 или 7, включающий:

(а) Cas полипептид или нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую Cas полипептид; и

(b) по меньшей мере, две таргетирующие РНК или нуклеиновые кислоты, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие указанные таргетирующие РНК, где первая РНК таргетирует ДНК-мишень, чтобы вызвать разрыв в специфичном сайте ДНК-мишени, и последняя таргетирующая РНК таргетирует последовательность, созданную в результате предыдущего события репарации разрыва, и снова создает разрыв в указанном специфичном сайте, где указанная таргетирующая РНК представляет собой sgРНК или crРНК;

где (а) и (b) находятся в одном и том же или отдельных контейнерах.

10. Набор по п.9, где указанные таргетирующие РНК в (b) находятся в одном и том же или отдельных контейнерах.

11. Способ скрининга событий редактирования независимо от экзогенного трансгенного маркера, включающий следующие стадии:

1) два или несколько разрывов ДНК последовательно создают в специфичном сайте первого гена-мишени клетки-реципиента и спонтанно репарируют, соответственно, где более поздний разрыв ДНК создают на основе новой последовательности, полученной в результате репарации предыдущего разрыва ДНК;

где «разрыв ДНК» достигается путем доставки нуклеазы с таргетирующим свойством в клетку-реципиент для контакта со специфичным сайтом гена-мишени, и

где «нуклеазой с таргетным свойством» является система CRISPR/Cas,

где признак «два или несколько разрывов ДНК последовательно создаются в специфичном сайте» относится к тому, что основано на новой последовательности, образованной предыдущим событием репарации разрыва ДНК, созданным системой CRISPR/Cas, создают новую таргетирующую РНК для направления нуклеазы для повторного разрезания указанного сайта, где таргетирующая РНК представляет собой sgРНК или CRISPR-РНК (crРНК);

2) события редактирования создают после того, как конкретный сайт первого гена-мишени последовательно отрезают и репарируют на стадии 1), что может придать мутантной клетке резистентность к давлению отбора для продуцирования фенотипического селектируемого признака, соответствующее давление отбора применяют для селекции признака, и выделяют клетку, ткань, орган или целый организм, который содержит такие события редактирования;

где «давлением отбора» может быть давление окружающей среды или давление, возникающее в результате добавления соединения; и

3) необязательно, в дополнение к первому гену-мишени, таргетную нуклеазу для, по меньшей мере, одного второго гена-мишени используют для одновременного редактирования другого сайта-мишени, и событие редактирования второго гена-мишени синхронно обогащают и подвергают скринингу посредством скрининга селектируемого признака, созданного мутациями первого гена-мишени, и выделяют клетку, ткань, орган или целый организм, которые одновременно содержат события редактирования первого гена-мишени и, по меньшей мере, одного второго гена-мишени.

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что «первым геном-мишенью» является локус гена, кодирующий, по меньшей мере, один фенотипический селектируемый признак, где, по меньшей мере, одним фенотипическим селектируемым признаком является признак резистенции/толерантности или признак преимущества роста.

13. Способ по п.11 или 12, отличающийся тем, что «специфичный сайт первого гена-мишени» относится к сайту, в котором возникает мутация после последовательных разрезов и репараций, который способен придать клетке-реципиенту резистентность к давлению отбора для получения, по меньшей мере, одного фенотипически селектируемого признака резистентности/толерантности или признака преимущества роста;

отличающийся тем, что мутация включает замену одного основания, замену множества оснований или вставку или делецию неопределенного числа оснований.

14. Способ по любому из пп.11-13, отличающийся тем, что «разрыв ДНК» достигается путем доставки нуклеазы с таргетным свойством в клетку организма для контакта со специфичным сайтом геномной ДНК.

15. Способ по любому из пп.11-14, отличающийся тем, что «два или несколько разрывов ДНК» образуются, когда комплексы RNP, образованные одной и той же CRISPR/Cas нуклеазой, соответственно, с различными crРНК или sgРНК, последовательно разрезают соответствующие последовательности-мишени; или

«два или несколько разрывов ДНК» образуются, когда комплексы RNP, образованные двумя или несколькими CRISPR/Cas нуклеазами, которые распознают разные последовательности РАМ с соответствующими crРНК или sgРНК, последовательно разрезают соответствующие последовательности-мишени.

16. Способ по любому из пп.11-15, отличающийся тем, что «таргетная нуклеаза для, по меньшей мере, одного второго гена-мишени» и CRISPR/Cas нуклеаза, используемая для создания разрыва ДНК в специфичном сайте первого гена-мишени, являются одинаковыми или разными.

17. Способ по любому из пп.11-16, отличающийся тем, что таргетная нуклеаза имеет форму ДНК;

или форму mРНК или белка вместо ДНК.

18. Способ нетрансгенного временного редактирования генома организма, включающий следующие стадии:

1) создания и синтеза комбинации, по меньшей мере, двух фрагментов crРНК или комбинации, по меньшей мере, двух фрагментов sgРНК для специфичного сайта первого гена-мишени клетки-реципиента, где комбинация crРНК в комбинации с tracrРНК или только комбинация sgРНК способны управлять соответствующим Cas белком для последовательного создания двух или нескольких разрывов ДНК в конкретном сайте в первом гене-мишени клетки-реципиента и их спонтанной репарации, соответственно, где более поздний разрыв ДНК создается на основе новой последовательности, создаваемой из предыдущей репарации разрыва ДНК;

2) смешивания соответствующего количества белка CRISPR/Cas или его соответствующей mРНК с комбинацией фрагментов crРНК и фрагмента tracrРНК или только с комбинацией фрагментов sgРНК, как указано выше, созданной и синтезированной заранее, которая способна направлять сайт-специфическое редактирование первого гена-мишени для создания эндогенных селективных маркеров, необязательно, последующего добавления, по меньшей мере, одного из искусственно синтезированных фрагментов crРНК и tracrРНК или искусственно синтезированных фрагментов sgРНК, таргетирующих второй, третий или несколько генов-мишеней, и проведения инкубации in vitro с образованием комплекса RNP;

3) доставки вышеуказанного комплекса RNP в клетку-реципиент посредством способа кратковременного введения и контакта со специфичным сайтом геномной ДНК для осуществления редактирования гена;

4) в соответствии с фенотипическим селектируемым признаком, создаваемым сайт-специфическим редактированием первого гена-мишени комплексом RNP, применения соответствующего давления отбора, чтобы провести селекцию признака и выделения клетки, ткани, органа или всего организма, который содержит событие редактирования, и, необязательно, выделения клетки, ткани, органа или полного организма, которые одновременно содержат события редактирования первого гена-мишени и, по меньшей мере, одного из второго, третьего или нескольких генов-мишеней,

где «давлением отбора» является давление окружающей среды или давление, возникающее в результате добавления соединения.

19. Способ по п.18, отличающийся тем, что «первым геном-мишенью» является локус гена, кодирующий, по меньшей мере, один фенотипически селектируемый признак, где, по меньшей мере, одним фенотипически селектируемым признаком является признак резистентности/толерантности или признак преимущества роста.

20. Способ по п.18 или 19, отличающийся тем, что «конкретный сайт первого гена-мишени» относится к сайту, в котором мутация образуется после последовательных разрезов и репараций, который способен придавать клетке-реципиенту резистентность к давлению отбора для получения, по меньшей мере, одного фенотипически селектируемого признака резистентности/толерантности или признака преимущества роста;

отличающийся тем, что мутация включает замену одного основания, замену множества оснований или вставку или делецию неопределенного числа оснований.

21. Способ по любому из пп.18-20, отличающийся тем, что признак «для последовательного создания двух или нескольких разрывов ДНК в конкретном сайте» относится к признаку, основанному на новой последовательности, созданной предыдущим событием репарации разрыва ДНК, созданным системой CRISPR/Cas, конструируют новую таргетирующую РНК для повторного разрезания указанного сайта, где указанная таргетирующая РНК представляет собой sgРНК или crРНК.

22. Способ по любому из пп.18-21, отличающийся тем, что «два или несколько разрывов ДНК», образованные, когда комплексы RNP формируются одной и той же CRISPR/Cas нуклеазой, соответственно, с различными crРНК или sgРНК, последовательно разрезают соответствующие последовательности-мишени; или

«два или несколько разрывов ДНК» создаются, когда комплексы RNP, соответственно, образованные каждой из двух или нескольких нуклеаз CRISPR/Cas, которые распознают разные последовательности PAM с соответствующими crРНК или sgРНК, последовательно разрезают соответствующие последовательности-мишени.

23. Способ по любому из пп.18-22, отличающийся тем, что «по меньшей мере, один из искусственно синтезированных фрагментов crРНК и tracrРНК или искусственно синтезированных фрагментов sgРНК, таргетирующих второй, третий или несколько генов-мишеней» имеет тот же самый Cas белок, что и crРНК или sgРНК, таргетирующие первый ген-мишень; или

«по меньшей мере, один из искусственно синтезированных фрагментов crРНК и tracrРНК или искусственно синтезированных фрагментов sgРНК, таргетирующих второй, третий или несколько генов-мишеней», и crРНК или sgРНК, таргетирующих первый ген-мишень, используют Cas белки, которые распознают разные последовательности PAM.

24. Способ по любому из пп.18-23, отличающийся тем, что если организмом является растение, клетку-реципиент заменяют на растительную реципиентную клетку или ткань; где «реципиентной растительной клеткой или тканью» является любая клетка или ткань, которые могут служить реципиентом для временной экспрессии и могут быть регенерированы в полноценное растение через культуру ткани; где клеткой предпочтительно является протопластная клетка или суспензионная клетка; и тканью предпочтительно является каллюс, незрелый зародыш, зрелый зародыш, лист, верхушка побега, молодой колос или гипокотиль.

25. Способ по п.24, отличающийся тем, что «первым геном-мишенью» является, по меньшей мере, один эндогенный ген, который кодирует, по меньшей мере, один фенотипический селектируемый признак, выбранный из резистентности/толерантности к гербицидам, где резистентность/толерантность к гербицидам выбрана из группы, состоящей из резистентности/толерантности к ингибитору EPSPS, резистентности/толерантности к ингибитору синтеза глутамина, резистентности/толерантности к ингибитору ALS или AHAS, резистентности/толерантности к ингибитору АССазы, резистентности/толерантности к ингибитору биосинтеза каротиноидов, резистентности/толерантности к ингибитору целлюлозы, резистентности/толерантности к ингибитору синтеза жиров, резистентности/толерантности к ингибитору длинноцепочечных жирных кислот, резистентности/толерантности к ингибитору сборки микротрубочек, резистентности/толерантности к электрон шунтирующим агентам фотосистемы I, резистентности/толерантности к ингибитору фотосистемы II или резистентности/толерантности к ингибитору PPO и резистентности/толерантности к синтетическому гормону роста.

26. Способ по п.25, отличающийся тем, что «первым геном-мишенью» является ALS, и «специфичный сайт гена» относится к сайту A122, P197, R198, D204, A205, D376, R377, W574, S653 или G654 в аминокислотной последовательности белка Arabidopsis AtALS, и аминокислотные сайты в белке ALS другого растения, которые соответствуют вышеупомянутым аминокислотным сайтам при использовании аминокислотной последовательности AtALS в качестве эталонного стандарта; или

указанная crРНК или sgРНК таргетирует последовательность-мишень, содержащую последовательность, кодирующую сайт аминокислотной последовательности белка AtALS, выбранный из группы, состоящей из A122, P197, R198, D204, A205, D376, R377, W574, S653, G654 или любой их комбинации, и последовательность-мишень, содержащую последовательность, кодирующую аминокислотный сайт в белке ALS другого растения, который соответствует указанному выше аминокислотному сайту, и любую их комбинацию, с использованием аминокислотной последовательности AtALS в качестве эталонного стандарта; или

«первым геном-мишенью» является АССаза, и «специфичный сайт гена» относится к сайту I1781, E1874, N1878, W1999, W2027, I2041, D2078, C2088 или G2096 в аминокислотной последовательности белка AmACCase Alopecurus myosuroides, и аминокислотным сайтам в белке ACCазе другого однодольного растения, которые соответствуют вышеупомянутым аминокислотным сайтам, при использовании аминокислотной последовательности AmACCase в качестве эталонного стандарта; или

crРНК или sgРНК таргетируют последовательность-мишень, содержащую последовательность, кодирующую сайт аминокислотной последовательности AmACCase, выбранный из группы, состоящей из I1781, E1874, N1878, W1999, W2027, I2041, D2078, C2088, G2096 или любую их комбинацию, и последовательность-мишень содержащую последовательность, кодирующую аминокислотный сайт в белке АССазы другого однодольного растения, который соответствует вышеупомянутым аминокислотным сайтам и любой их комбинации, при использовании аминокислотной последовательности AmACCase в качестве эталонного стандарта; или

«первым геном-мишенью» является HPPD, и «специфичный сайт гена» относится к сайту H141, L276, P277, N338, G342, R346, D370, P386, K418 или G419 в аминокислотной последовательности белка Oryza sativa OsHPPD, и аминокислотным сайтам в белке HPPD другого растения, которые соответствуют вышеупомянутым аминокислотным сайтам, при использовании аминокислотной последовательности OsHPPD в качестве эталонного стандарта; или

указанная crРНК или sgРНК таргетирует последовательность-мишень, содержащую последовательность, кодирующую сайт аминокислотной последовательности OsHPPD, выбранный из группы, состоящей из H141, L276, P277, N338, G342, R346, D370, P386, K418, G419 или любой их комбинации, и последовательность-мишень, содержащую последовательность, кодирующую аминокислотный сайт в белке HPPD другого растения, который соответствует вышеупомянутому аминокислотному сайту и любой их комбинации, при использовании аминокислотной последовательности OsHPPD в качестве эталонного стандарта; или

«первым геном-мишенью» является РРО, и «специфичный сайт гена» относится к сайту S128, V217, S223, V364, K373, L423, Y425 или W470 в аминокислотной последовательности белка Oryza sativa OsPPO1, и аминокислотным сайтам в белке РРО другого растения, которые соответствуют вышеупомянутым аминокислотным сайтам, при использовании аминокислотной последовательности OsPPO1 в качестве эталонного стандарта; или

crРНК или sgРНК таргетируют последовательность-мишень, содержащую последовательность, кодирующую сайт аминокислотной последовательности OsPPO1, выбранный из группы, состоящей из S128, V217, S223, V364, K373, L423, Y425, W470, или любой их комбинации, и последовательность-мишень, содержащую последовательность, кодирующую аминокислотный сайт в белке РРО другого растения, который соответствует указанному выше аминокислотному сайту и любой их комбинации, при использовании аминокислотной последовательности OsPPO1 в качестве эталонного стандарта; или

«первым геном-мишенью» является TIR1, и «специфичный сайт гена» относится к сайт F93, F357, C413 или S448 в аминокислотной последовательности белка Oryza sativa OsTIR1, и аминокислотным сайтам в белке TIR1 другого растения, которые соответствуют вышеупомянутым аминокислотным сайтам при использовании аминокислотной последовательности OsTIR1 в качестве эталонного стандарта; или

crРНК или sgРНК таргетируют последовательность-мишень, содержащую последовательность, кодирующую сайт аминокислотной последовательности OsTIR1, выбранный из группы, состоящей из F93, F357, C413, S448 или любой их комбинации, и последовательность-мишень, содержащую последовательность, кодирующую аминокислотный сайт в белке TIR1 другого растения, который соответствует указанному выше аминокислотному сайту, и любую их комбинацию, при использовании аминокислотной последовательности OsTIR1 в качестве эталонного стандарта.