Способ получения антигенной детерминанты вируса СПИД Советский патент 1991 года по МПК C12N15/48 

Изобретение относится к биотехнологии и медицине и может быть использовано для обнаружения антител СПИДа и его вирусов в сыворотке крови чело- „века или других биологических жидкостях, а также в иммунопрофилактической защите человека от СПИДа на основе применения белка„

П р и м е ро Последовательность ДНК, кодирующую остатки 15-512 (все, кроме первых 14 аминоконцевых остатков) гена gag, вырезают из рекомбинантного фагового клона fl HXB-3 и связьгоают с экспрессионной плачмидой EoColi pEV-vrf2 для получения плазми- ды pEV2/gag 15-512.5

Последовательности ДНК, соответствующие аминокислотным остаткам 319- 331 env, удаляют из экспрессионной плазмиды pEV3/env 44-640 путем направленного затравкой мутагенеза для Q получения плазмиды pEV3/env 44-640 U 319-331.

Направляемый затравкой мутагенез проводят на плазмиде pEV3/env 44-640 А 319-331 для удаления нуклеотидов, 15 кодирующих аминокислотные остатки 514- 524, и получают плазмиду pEV3/env 44- 640 & 319-331 A 5U-524.

Фрагмент рестрикционной эндонуклеа- зы гена env из плазмиды pEV3/env 44- 20 640 U 319-331 А 514-524, кодирующий остатки env 467-640 & 514-524, связывают с фрагментом pEV2/gag 15-512 и получают в результате гибридный ген, кодирующий остатки gag 15-436 и остат-25 ки env 467-640 Д 514-524 в плазмиде pEV2/gag 15-436/env 467-640 Д 514-524.

На каждой стадии конструирования плазмиды репродуцируют путем трансформации в штамм E.coli MC1061 (pRK248c ts).

Общая методика получения рекомби- нантного вектора.

Масломасштабное выделение плазми- дной ДНК из 1 мл насыщаемой в течение суток культуры проводят согласно мето дике Бернбойма, позволяющей выделять для аналитических целей из бактериаль ной колонии небольшие количества ДНК. Большие количества плазмидной ДНК получают из 1 л культуры согласно стандартной методике с применением центрифугирования в хлористом цезии о

Для рестрикционных эндонуклеаз единицу активности определяют как количество фермента, необходимое для расщепления 1 мкг ДНК за 60 мин в общем реакционном объеме 0,05 мл при т„уев Рестрикционные растворы кроме подвергаемой расщеплению ДНК содержат 100 мкг/мл альбумина бычьей сыворотки и следующие буферные компоненты:

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, и может быть использовано для обнаружения антител СПИДа и его вирусов в сыворотке крови человека или других биологических жидкостях, а также к иммунопрофилак- тической защите человека от СПИДа на основе применения белка. Сущность способа состоит в том, что последовательность ДНК, кодирующего остатки 15-512 (все, кроме первых 14 аминокислотных остатков) гена gag, вырезают из рекомбинантного фагового клона ДНХВ 3 и связывают с экспрес- сионной плазмидой E.coli pEV-vrf2 для получения плаэмиды pEV2/gag 15- 512Э Последовательности . ДНК, соответствующие аминокислотным остаткам 319-331 env, удаляют из экспрессион- ной плазмиды pEV3/env 44-460 путем направленного затравкой мутагенеза для получения плазмиды pEV3/env 44- 64 А 319-331, Направляемый затравкой мутагенез проводят на плазмиде pEV/ /env 44-640 Л 329-331 и получают , плазмиду pEV3/env 44-640 A319-331 А514-524, Фрагмент рестрикционной эндонуклеазы гена env из плазмиды pEV/env 44-640 А319-331 А514-524, кодирующий остатки env 467-640 Д514- 524 и env 467-640 А514-624, связывают с фрагментом pEV2/gag 15-512 и получают в результате гибридный ген, кодирующий остатки gag 15-436 и остатки env 467-640 А 514-524 в плазмк- де PEV2/gag 15-436/env 467-640Д514- 524. На каждой стадии конструирования плазмиды репродуцируют путем трансформации в штамме MC 1061 (.pRK 248clts). с И

Bgl II: 100 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl (рН 7,4), 10 мМ MgCl2 и 10 мМ 2-меркаптоэтакола (2-Ю) ;

С1а I: 50 мМ NaCl, 6 мМ трис-HCl (рН 7,9) и 6 мМ MgCl2; Hinc II:idOO мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl (рН 7,4), 7 мМ MgCl2 и 1 мМ дитиотреитола (ДТТ);

Hind III: 50 мМ NaCl, 50 мМ трис-HCl (рН 8) и 10 мМ Нра I: 6 мМ КС1, 10 мМ трис-HCl (рН 7,4), 10 мМ MgCl,H 1 мМ ДТТ; Pst I: 100 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl (рН 7,5) и 10 мМ Puv II: 60 мМ NaCl, 6 мМ трис-HCl (рН 7,5), 6 мМ MgCle и 6 мМ 2-Ю; Stu J: 100 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl (рН 8), 10 мМ MgCl2 и 6 мМ 2-МЭ„

Связывание Т4 ДНК лигаэой проводят при 16°С в смеси, содержащей ДНК и 50 мМ трис-HCl (рН 7,8), 10 мМ MgClfc, 20 мМ ДТТ, 1 мМ АТФ и 50 мкг/мл альбумина бычьей сыворотки Единицу активности Т4 ДНК лигазы on- ределяют как количество, необходимое для 50%-ного связывания фрагментов Hind III лямбда-ДНК за 30 мин при 16°С в 20 мкл инкубационной смеси и концентрации 5 -концов ДНК 0,12 мкМ (300 мкг/мл)о

Очистка фрагментов ДНК в агарозе После расщепления с помощью рестрикционной эндонуклеазы предназначенные для клонирования фрагменты ДНК выделяют электрофорезом в 1%-ной ага- розе. После проявления с помощью 1 мкг/мл этидийбромида тонкие слои геля, содержащего целевые фрагменты

ДНК, экстрагируют через иглу 21 раз-ч мера в 4 мл раствора, содержащего 10 мМ трис-HCl (рН 7,4), 1 мМ ЭДТА и 300 мМ NaCl. Полученную смесь вымораживают 3 ч при -80°С, оттаивают 30 мин при 37°С и центрифугируют при 10000 g в течение 30 мин. Полученную жидкость фильтруют через фильтр Mil- lex 0,45 мк, концентрируют до объема 0,25 мл и трижды осаждают втор-бута- нолом и этанолом с 10 мкг E,coli тРНК (транспортная РНК) в качестве носителя.

Культуральная среда

Среда М9СА содержит 10 г Na2HP04, 3 г КНеР04, 0,5 г NaCl и 1 г NH4C1 на 1 л с 1 кМ MgS04, 0,5% глюкозы и 0,5% казаминокислот при рН 7,4,

Бульон Луриа (БЛ) содержит 5 г бакто-дрожжевого экстракта, 10 г бакто-триптона и 10 г NaCl на 1 л при рН 7,5.

Там, где указано, добавляют антибиотики тетрациклин и ампицилин до их окончательной концентрации соответственно 15 и 50 мкг/мл.

Трансформация и выделение рекомби- нантов,

Трансформацию штамма E3coli MC1061 (pRK248dts) проводят следующим образом.

200 мл бактериальных клеток выращи вают при 30°С в БЛ до значения О.П, (оптическая плотность) 0,5 - 1, посл чего клетки собирают центрифугированием при 6000 g и 4°С 5 мин, вновь суспендируют в 50 мл раствора, со/;ер- жащего 10 мМ морфолинопропансульфо- новой кислоты (МОПС, рН 7) и 10 мМ RbClo Клетки собирают центрифугированием и вновь суспендируют в 30 мл раствора, содержащего 10 мМ МОПС (рН 6,5), 50 мМ CaClfc и 10 мМ RbCl. После инкубирования в течение 30 мин при 0°С клетки собирают, вновь суспендируют в 6 мл 10 мМ МОПС (рН 6,5) с 50 мМ СаС1г, 10 мМ RbCl и 15% глицерина и в 40 пробирок Эппендорфа (300 мкл на пробирку) отбирают аликво ты, которые замораживают до -80°С.

Трансформацию проводят оттаиванием аликвоты на 100 мкл клеток и инкубируют 30,2 и 2 мин соответственно при 0, 37 и 0°С в присутствии образца лигазной смеси в 10 мкл, содержащего примерно 100 нг ДНК, и добавлением в пробирку 0,1-0,5 мл БЛ, Пробирку затем инкубируют 60 мин при 22°С, по

еле чего разливают по 200 мкл клеточ- д gag, затем замещают последовательное- ной суспензии в БЛ, содержащем ампицилин, и инкубируют 20 ч при 30 С.

тями env с получением конечного гибридного продукта о

;

- Выращивание клеток и индуцированиеДля приготовления плазмиды pEV2/

экспрессии гена.45 1/8а8 15-512 ДНК-последовательность,

Культуры EoColi МС1061, содержащие плазмиду pRK248cIts, и экспрессионную плазмиду выращивают в среде М9СА при

30 С до средне-log фазы и затем темпе;кодирующую остатки 15-512 белка gag, получают из 50 мкг рекомбинантного фагового лямбда клона fl HXB-3, содержащего провирусный геном HTLV-III,

ратуру повьшают до 42°С с целью инак- 50 НК подвергают расщеплению в присут- тивации ftP,, репрессора. После 2 ч ин- ствии Cla I (50 единиц) и Hinc II кубирования при 42°С клетки из 1 мл индуцированной культуры отделяют центрифугированием и вновь суспендируют

55

(50 единиц) в течение 120 мин при 37 °С для получения фрагмента в

в ТГ-буфере, содержащем 10 мМ трис- НС1 (рН 7,4) и 10% глицерина, дЛя получения аналитического препарата.

Электрофорез на SDS-полиакриламид- ном геле и анализ Вестерн-пятен.

1700 п.о о (пар оснований). Фрагмент ДНК выделяют препаративным электрофорезом в агарозном геле и вновь суспендируют в 0,1 ТЕ-буфере (1 мМ трис- НС1 (рН 7,4) с 0,1 ЭДТА) до окон- чательной концентрации 0,03 пмоль/мкло

0

5

5

Индуцированные клетки, суспендированные в трис-глициновом (ТГ) буфере, смешивают с равным объемом электрофо- ретического буфера, инкубируют 5 мин при 95°С и по методике Лаэммли подвергают электрофорезу в 12,5%-ном поли- акриламидном геле. После электрофореза белки из геля элюируют в течение 6 ч при 95 В в 12,5 мМ трис- и 96 мМ глицина с 20% метанола и 0,01% SDS, рН 7,5 на нитроцеллюлозную мембрану (О,1 мк). Затем проводят анализ Вестерн-пятен,

Направляемый затравкой сайтспеци- фичный мутагенез проводят согласно методике Моринага. Используемые в мутагенезе искусственные олигонуклеоти- ды синтезированы фосфитным методом с применением автоматического синтезатора и очищены электрофорезом на по--. лиакриламидном геле„

При гибридизации колоний в качест- ве индикатора для гибридизации используют тот же олигонуклеотид, что и в направляемом затравкой сайтспеци.- фичном мутагенезе, после мечения 5- конца с помощью г Р (АТФ с применением полинуклеотидкиназы)„

Конструирование плазмиды pEV2/gag 15-512.

Конструкцию конечной экспрессион- ной плазмиды, кодирующей гибридный белок gag/env, получают конструированием плазмиды (pHV2/gag 15-512), содержащей нуклеотиды, кодирующие все, кроме первых 14, аминокислотные концевые остатки. Некоторые нуклеотидыг кодирующие карбоксилконцевые остатки

gag, затем замещают последовательное-

тями env с получением конечного гибридного продукта о

;

НК подвергают расщеплению в прису ствии Cla I (50 единиц) и Hinc II

(50 единиц) в течение 120 мин при 37 °С для получения фрагмента в

НК подвергают расщеплению в присут- ствии Cla I (50 единиц) и Hinc II

1700 п.о о (пар оснований). Фрагмент ДНК выделяют препаративным электрофорезом в агарозном геле и вновь суспендируют в 0,1 ТЕ-буфере (1 мМ трис- НС1 (рН 7,4) с 0,1 ЭДТА) до окон- чательной концентрации 0,03 пмоль/мкло

Для получения фрагмента ДНК gag 2 мкг экспрессионной плазмиды Ее со- li pEV-vrf 2 расцепляют с помощью Cla I (5 единиц) и Pvu II (5 единиц) в течение 60 мин при 37°С и электрофорезом на 1%-но-м геле агарозы выделяют фрагмент в 1700 п.о., содержащий ftP, промотор о Фрагмент ДНК после предварительного осаждения этанолом вновь суспендируют до окончательной концентрации 0,03 пмоль/мкл.

Используемая при таком конструировании плазмида pEV-vrf 2 является производной легко доступной плазмиды

pBR322 (АТСС 31344), фаговый лямбда клон ft НХВ-3 получен использованием стандартной методики с рекомбикантной

ДНК из указанной клеточной линии Н-9

зараженной HTLV-III. Зараженная

HTLV-III линия клеток человека значена H9-HTLV-IIIB и депонирована в Американской коллекции типовых культур под регистрационным № CRL

8543 Знание последовательности генома HTLV-III позволяет легко сконструировать ДНК-индикатор.,для выделения генома из Н-9 или любых других линий, способных к распространению вируса ,,

0,03 пмоль, фрагмента gag/Cla I- Hinc II смешивают с 0,03 пмоль фрагмента pEV-vrЈ2/Cla I- Puv II и связывают с помощью Т4 ДНК-лигазы (200 единиц) в течение 18 ч при 15°С в конечном объеме 10 мкл0 Продукт связывания затем трансформируют в штамм E.coli MC1061 (pRK248dts) и трансформанты отбирают путем выращивания на агаровых пластинках БЛ с ампицилином после инкубирования 18 ч при 30°С. ДНК рекомбинантных плазмид анализируют для выявления нужного размера отщепленного фрагмента после расщепления рестриктазами Bgl II, Pst I или Hind III. Продукты выделения, прошедшие анализ по размеру, затем отбирают с помощью электрофореза в полиакриламндном геле и анализа Вестерн-пятен на наличие предшественника gag.

Культуры клеток, содержащих плаз- миду pEV2/gag 15-512, индуцируют при 40°С, а дубликатные образцы индуцированных клеток готовят для электрофоретического анализа в полиакрилами мидном геле. После электрофореза гел разделяют на две части, одну половин

0

5

,

0

0

окрашивают бриллиантовым голубым Ку- масси, в то время как вторую сторону геля подвергают электроэлкицш и анализу Вестерн-пятен с применением антител к gag.

Анализ показывает, что индуцированные клетки продуцируют белки, мигрирующие в геле в виде двух основных полос и имеющие молекулярный вес примерно 56 и . Размер полного белка gag 15-512 примерно 56 кЦ. Оба основных белка реагируют с антителами к gag. Наблюдается также ряд меньших по количеству низкомолекулярных белков, вступающих в реакцию с антителами.

Конструирование плазмиды pEV3/env 44-640 & 319-331.

Экспрессионная плазмида pEV3/env 44-640, конструирование котброй из плазмид НХВ-3 и pEV-vrf описано Кроулем, направляет синтез HTLV-III env - специфичного белка 68-кД в Е. co- Li. ДНК-последовательности, соответствующие аминокислотным остаткам env 319-331, удаляют с помощью направляемого затравкой мутагенеза с использованием 18-mer искусственного олиго- нукпеотида, имеющего последовательность 5 GCA ТТТ GTT ААС ATT AGT з . Такой олигонуклеотид предназначен дополнять env-последовательности с тем, чтобы присоединять нуклеотиды, кодирующие остаток 318 к нуклеотидам, кодирующим остаток 332. В результате соединения указанных последовательностей в плазмидную ДНК вводится новый уникальный участок Нра I с одновременным удалением фрагмента в 39 п.о. Для образования пробела (gap) для гетеродутшексной молекулы в плаз- миде pEV3/env 44-640 использованы сайты Stu I и Hind III.

ДНК из выделенных колоний, гибри- дизующиеся с- 92 Р-меченным искусственным олигонуклеотидом, трансформируют в МС1061 (pRK248dts) и анализируют на присутствие нового уникального Нра I участка.

Конструирование плазмиды pEV3/env 44-640 Л 319-331 Л 514-524.

Второе удаление в рамках кодирующих env-последовательиостей проводят с помощью направляемого затравкой мутагенеза с использованием искусственного олигонуклеотида, имеющего последовательность 5 AGA GCA GTG

содержащего ft ftP промотор. 0,3 мкг ДНК PEV3/env 44-640 &319-331 i 514- 524 подвергают рестрикгши с помощью 5 Pst I (10 ед) и ВрД II (4 ед) с получением фрагмента размером примерно 4 Кв, кодирующего остатки env 467- 640 Д. 514-524. Полученные фрагменты ДНК разделяют в 1%-ной агароэе и вы- деляют. 0,03 пмоль ДНК каждого выде- ленного фрагмента ДНК смешивают и связывают 18 ч при 15°С в присутствии Т4 ДНК-лигазы (200 ед) . Лигазной смесью трансформируют МС1061 (pRK248c ts

10

GCA GCA GGA 3. Этот олигонуклеотид располагает последовательности, кодирующие остаток 513 белка env, рядом с последовательностями, кодирующими остаток 525, тем самым способствует удалению нуклеотидов, кодирующих остатки 514-57.4. Удаление осуществляют в плазмиде расщеплением по рестрикци- онным участкам Нра. I и Hind III с созданием однонитевого пробела (gap) в пределах env-области.

После повторного трансформирования

ДНК из положительных продуктов, идеи- д ....... 1Г

тифицированных с помощью 52Р-мечен- 15 продукты трансформации отбирают на ного олигонуклеотида, анализируют напластинках с ЕЛ, агаром и ампшошипредмет удаления 33 п.о. с помощьюНом. Плазмидную ДНК получают из уннрасщепления рестриктазами Нра I икальных колоний и анализируют на праHind III и электрофореза в 1%-ной агарозе. Такое удаление также подтверждают установлением ДНК-последовательности с последующим применением метода химического расщепления.

Удаление U 514-524 приводит к значительному повышению экспрессии env. 25

Конструирование плазмиды pEV2/gag 15-436/env 467-6400,514-524.

2 pEV2/gag 15-512 подвергают рестрикции либо Cla I (5 ед) и Bgl II (4 ед) с получением фрагмента примерно в 1300 п.о., кодирующего остатки 15-436 gag, либо с помощью Pst I -(10 ед) и Cla I (5 ед) с получением фрагмента примерно 1 Кб, Met АБП Агд Не Агд Не His Агд Trp Glu Lys lie Агд Leu Агд

Pro Gly Gly LysLys Lys Tyr Lys Leu Lys His He Val Trp Ala

Ser Агд Glu LeuGlu Агд Phe Ala Val Asn Pro Gly Leu Leu Glu

TLr Ser Glu GlyСув Агд Gin lie Leu Gly Gin Leu Gin Pro Ser

Leu Gin Thr GlySer Glu Glu Leu Агд Ser Leu Tyr Aen Thr Val

Ala Thr Leu TyrCys Val His Gin Агд lie Glu lie Lys Asp Thr

Lys Glu Ala LeuAsp Lys lie Glu Glu Glu Gin Asn Lys Ser Lys

Lyr, Lys Ala GinGin Ala Ala Ala Asp Thr Gly His Ser Sec Gin

Val Ser Gin AsnTyr Pro lie Val Gin Asn He Gin Gly Gin Met

Val His Gin Alalie Ser Pro Агд Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys

Val Val Glu GluLys Ala Phe Ser Pro Glu Val He Pro Met Phe

Ser Ala Leu SerGlu Gly Ala Thr Pro Gin Asp Leu Asn Thr Met

Leu Asn Thr ValGly Gly His Gin Ala Ala Met Gin Met Leu Lys

Giu Thr He AsnGlu Glu Ala Ala Glu Trp Asp Агд Val His Pro

Val His Ala GlyPro He Ala Pro Gly Gin Met Агд Glu Pro Агд

Gly Ser Asp HeAla Gly Thr Thr Ser Thr Leu Gin Glu Gin He

вильность размеров рестрикционных 20 фрагментов после расщепления реет- риктазой Puv II.

Одиннадцать из 12 выделенных клонов дают требуемые Puv II-фрагменты ДНК размером 3505 и 2882 п.о. Два прошедших анализ клона отобраны для синтеза гибридного белка gag/env. Эти культуры клеток индуцируют, образцы клеток отбирают для электрофоретичес- кого анализа в SDS-полиакриламидном 30 геле, электроэлюции и анализа Вестерн-пятен.

Отобранные клоны синтезируют белок следующей аминокислотной последовательности:

содержащего ft ftP промотор. 0,3 мкг ДНК PEV3/env 44-640 &319-331 i 514- 524 подвергают рестрикгши с помощью Pst I (10 ед) и ВрД II (4 ед) с получением фрагмента размером примерно 4 Кв, кодирующего остатки env 467- 640 Д. 514-524. Полученные фрагменты ДНК разделяют в 1%-ной агароэе и вы- деляют. 0,03 пмоль ДНК каждого выде- ленного фрагмента ДНК смешивают и связывают 18 ч при 15°С в присутствии Т4 ДНК-лигазы (200 ед) . Лигазной смесью трансформируют МС1061 (pRK248c ts),

д ....... 1Г

продукты трансформации отбирают на пластинках с ЕЛ, агаром и ампшоши

Trp Glu Lys lie Агд Leu Агд

вильность размеров рестрикционных фрагментов после расщепления реет- риктазой Puv II.

Одиннадцать из 12 выделенных клонов дают требуемые Puv II-фрагменты ДНК размером 3505 и 2882 п.о. Два прошедших анализ клона отобраны для синтеза гибридного белка gag/env. Эти культуры клеток индуцируют, образцы клеток отбирают для электрофоретичес- кого анализа в SDS-полиакриламидном геле, электроэлюции и анализа Вестерн-пятен.

Отобранные клоны синтезируют белок следующей аминокислотной последовательности:

11164472012

Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro Pro lie Pro Val Gly Glu lie Tyr Lye Arg Trp He He Leu Gly Leu Asn Lys He Val Arg Met Tyr Sec Pro Thr Ser lie Leu Asp lie Arg Gin Gly Pro Lys Glu Pro P.he Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gin Ala Ser Gin Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr Leu Leu Val Gin Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr lie Leu Lys Ala Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gin Gly Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gin Val Thr Asn Thr Ala Thr lie Met Met Gin Arg Gly Asn Phe Arg Asn Gin Arg Lys Met Val Lys Cys Phe Asn Cys Gly Lys Glu Gly His Thr Ala Arg Asn Cys Arg Ala Pro Arg Lys Lys Gly Cys Trp Lys Cys Gly Lys Glu Gly His Gin Met Lys Asp Cys Thr Glu Arg Glp Ala Asn Phe Leu Gly Lys lie Phe Arg Pro Gly Gly Gly Asp Met Arg Asp Asn Trp Arg Ser Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys He Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lye Ala Lys Arg Arg Val Val Gin Arg Glu Lye Arg Ala Val Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly Ala Ala Ser Met Thr Leu Thr Val Gin Ala Arg Gin Leu Leu Ser Gly lie Val Gin Gin Gin Asn Asn Leu Leu Arg Ala He Glu Ala Gin Gin His Leu Leu Gin Leu Thr Val Trp Gly He Lys Gin Leu Gin Ala Arg He Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gin Gin Leu Leu Gly He Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Leu Cys Thr Thr Ala Val Pro Trp Asn Ala Ser Trp Ser Asn Lys Ser Leu Glu Gin He Trp Asn His Thr Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu He Asn Asn Tyr Thr Ser Phe Asn Ala Val Val Tyr His Ser

/ ч

Таким образом, изобретение позво- Q ной ДНК, кодирующей антигенную детерляет получить белок, который имеетминанту вируса СПИД, трансформацию

по меньшей мере одну антигенную де-гшазмидой штамма бактерий Escherichia

терминанту, соответствующую последе- coli, культивирование, вьщеление и вательностям белков gag и env вируса очистку целевого продукта, о т л и- HTLV-III.45 чающийся тем, что, с целью

повышения специфичности антигена, Формула изобретенияконструируют рекомбинантную ппазмиду

pEV2/gag 15-A36/env 467-640 Д514-524,

Способ получения антигенной детер ь кодирующую синтез слитого белка gag/ минанты вируса СПИД, включающий кон- ,. /env, со следующей аминокислотной

струирование рекомбинантной плазмид-последовательностью:

i

Met Asn Arg lie Arg He His Arg Trp Glu Lys He Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Lys Leu Lys His He Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val Asn Pro Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Gin lie Leu Gly Gin Leu Gin Pro Ser Leu Gin Thr Gly Ser Glu Glu Leu Arg Ser Leu Tyr Asn Thr Val

1J164472014

Ala Thr Leu Туг Сув Val His Gin Arg He Glu lie Lys Asp Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys He Glu Glu Glu Gin Asn Lys Set Lys Lye Lys Ala Gin Gin Ala Ala Ala Asp Thr Gly His $er Ser Gin Val Ser Gin Asn Tyr Pro He Val Gin A-sn He Gin Gly Gin Met Val His Gin Ala He Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Val Glu Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val lie Pro .Met Ptfe Ser Ala Leu Ser Glu Gly Ala Thr Pro Gin Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly Gly His Gin Ala Ala Met Gin Met Leu Lys Glu Thr He Asn Glu Glu Ala Ala Glu Trp Asp Arg Val His Pro Val His Ala Gly Pro He Ala Pro Gly Gin Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp He Ala Gly Thr Thr Ser Thr Leu Gin Glu.Gin He Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro Pro He Pro Val Gly Glu He yr Lys Arg Trp He He Leu Gly Leu Asn Lys He Val Arg Met Tyr Ser Pro Thr Ser He Leu Asp He Arg Gin Gly Pro Lys Glu1 Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gin Ala Ser Gin Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr Leu Leu Val Gin Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr He Leu Lys Ala Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gin Gly Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gin Val Thr Asn Thr Ala Thr He Met Met Gin Arg Gly Asn Phe Arg Asn Gin Arg Lys Met Val Lys Cys Phe Asn Cys Gly Lys Glu Gly His Thr Ala Arg Asn Cys Arg Ala Pro Arg Lys Lys Gly Cys Trp Lys Cys Gly Lys Glu Gly His Gin Met Lys Asp Cys Thr Glu Arg Gin Ala Asn Phe Leu Gly Lys He Phe Arg Pro Gly Gly Gly Asp Met Arg Asp Asn Trp Arg Ser Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys He Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Lys Arg Arg Val Val Gin Arg Glu Lys Arg Ala Val Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly Ala Ala Ser Met Thr Leu Thr Val Gin Ala Arg Gin Leu Leu Ser Gly He Val Gin Gin Gin Asn Asn Leu Leu Arg Ala He Glu Ala Gin Gin His Leu Leu Gin Leu Thr Val Trp Gly He Lys Gin Leu Gin Ala Arg He Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Glh Gin Leu Leu Gly He Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Leu Cys Thr Thr Ala Val Pro Trp Asn Ala Ser Trp Ser Asn Lys Ser Leu Glu Gin He Trp Asn His Thr Thx Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu He Asn Aen Tyr Thr Ser Phe Asn Ala Val Val Tyr His Ser

этой плазмидой трансформируют штаммцелевого продукта ввдеяяют и Очищают

E.coli ATCC Р 53338, а в качествеслитый белок ga.fje.nv.