Способ получения стерильной поверхности изделий из полистирола, пригодной для монослойного культивирования клеток млекопитающих Советский патент 1992 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при промышленном производстве изделий из полистирола, предназначенных для моно- слойного культивирования клеток млекопитающих.

Известен способ получения стерильной поверхности полистирола, пригодной для монослойного культивирования клеток млекопитающих, путем обработки серной кислотой с последующей стерилизацией изделий (1).

Недостатком данного способа является использование агрессивной жидкости, необходимость соблюдения специальных условий, а также многостадийность процесса обработки.

Известен также способ получения стерильной поверхности изделий из полистирола путем обработки поверхности УФ-излучением (2).

Однако степень модификации поверхности недостаточна и вследствие этого эффективность монослойного культивирования клеток низка.

Целью изобретения является повышение эффективности культивирования клеток.

Цель достигается тем, что поверхность изделия из полистирола облучают импульсным УФ-облучением с длиной волны в диапазоне эффективного поглощения полистирола (коэффициент поглощения более 100 ) и дозой 2-20 Дж/см2.

При определении пригодности поверхности для монослойного культивирования клеток млекопитающих использовали метод клонирования на перевиваемых клетках линии СНО (клетки китайского хомячка) и на перевиваемых клетках L.929 (опухолевые клетки соединительной ткани мыши (фиб- робластоподобные), а также на первичнот- рипсинизированных эпителиальных клетках (кератиноцитах) кожи новорожденных крысят. В качестве изделия, предназначенного для модификации поверхности с

СО

С

XI

О СО

N

00

о

целью монослойного культивирования, были выбраны чашки Петри из полистирола, серийно изготовляемые заводом Ленполи- мер. Питательный средой при культивировании клеток СНО была смесь среды Игла и среды 199 (1:1) + 10% сыворотки крупного рогатого скота, при культивирования клеток L.929 - среда Игла в модификации Дальбекко + 10% эмбриональной сыворотки. При культивировании клеток СНО и 1.929 в чашки Петри диаметром 35 и 40 мм, содержащих 2 мл питательной среды, высеивали по 100 клеток в каждую чашку. Клетки культивировали в течение 8-10 суток, после чего питательную среду удаляли, а чашки с образовавши- мися клонами промывали солевым раствором или раствором Хэнкса для удаления остатков среды. Для повышения контрастности клоны окрашивались кристаллвиолетом. Подсчет клоном проводили с помощью оптического микроскопа.

Количественным показателем ответа клеток на свойства поверхности чашек Петри служит эффективность клонирования, определяемая как отношение числа сформировавшихся на чашках Петри клонов к дозе посева (абсолютная эффективность). Для сравнительной характеристики вычисляют относительную эффективность, клонирования каждого варианта, т.е. отношение его абсолютной эффективности к абсолютной эффективности на чашках Петри зарубежных фирм в процентах.

Качественной характеристикой являлась морфология клонов (степень компактности и однородности), их размеры, а также морфология клеток в соответствии с их нор- мальным фибробластоподобным фенотипом (т.е. соответствует ли форма клетки их нормальному фибробластоподобному состоянию). В качестве контроля использова- ли чашки Петри, обработанные по известному способу УФ-излучением, а также чашки Петри зарубежных фирм Миле и Flow Laboratories, специально предназначенные для монослойного культивирования клеток.

Примеры конкретного выполнения изобретения.

Примеры 1-5, 8 и 9.

0

5

Поверхность чашки Петри облучают импульсным УФ-излучением эксимерного лазера.

Примеры 6, 7 и 10.

Поверхность чашки Петри облучают излучением импульсной лампы ИФП-800. Изменение спектральной полосы излучения осуществляют за счет использования различных светофильтров (пример 6, светофильтр УФС 5; пример 7, светофильтр УФ С 8).

Пример 11 (по прототипу).

Поверхность чашки Петри облучают непрерывным излучением УФ лампы ДРТ-220.

0

5

0

5

0

5

Характеристики обработки полимерных изделий УФ излучением и эффективность клонирования перевиваемых клеток по примерам 1-11 приведены соответственно в табл.1 и 2.

Эксперименты по культивированию первично-трипсинизированных эпителиальных клеток (кератиноцитов) кожи новорожденных крысят проводились при дозе посева (70-100) 104 клеток на чашку Петри диаметром 35 и 40 мм. Было обнаружено, что на необработанной поверхности чашек Петри производства завода Ленполимер клетки не прикрепляются. Эти же клетки, посеянные на чашки Петри производства фирм Flow Lab. и Corning оседают, прикрепляются и за 7-10 дней формируют колонии или участки монослоя максимальной величины. Данные первичные клетки на поверхности чашек Петри, обработанных импульсным излучением, за тот же срок образуют колонии несколько меньшей площади, чем для указанных фирм.

Формула изобретения

Способ получения стерильной поверхности изделий из полистирола, пригодной для монослойного культивирования клеток млекопитающих путем УФ-облучения, отличающийся тем, что, с целью повышения эффективности культивирования клеток, поверхности облучают импуль- ным УФ-излучением с длиной волны в диапазоне эффективного поглощения полистирола с интенсивностью 2- 102--3 106 0 Вт/см2 и дозой 2-20 Дж/см2.

Характеристики обработки полимерных изделий УФ излучением

Таблица 1

Использование: биотехнология, медицина, ветеринария. Сущность изобретения: на поверхность изделий из полистирола воздействуют импульсным УФ-облучением с длиной волны в диапазоне эффективного поглощения полистирола. Интенсивность облучения 2-10-3-106 Вт/см2, доза 2-20 Дж/см2. Модификация поверхности полистирола УФ-облучением способствует повы- шению эффективности клонирования клеток млекопитающих. 2 табл.

Эффективность клонирования перевиваемых клеток линий СНО и LM, и описание клонов на поверхности изделий из полистирола

Таблица