I
Изобретение относится К области молекулярной биологии, а именно к от,бору клеток микроорганизмов с измененными генетическими признаками в работах поденной инженерии. Микроорга- низмы, содержащие рекомбинантные мо- . лекулы ДНК с чужеродными генами, сконструированные in vitro - проду- . центы различных биологически активных веществ, могут быть использованы в микробиологической промышленности.
Известен способ отбора бактериалы ных клеток, содержащих рекомбинантные молекулы ДНК, по их способности расти на питательных средах, содержащих антибиотики Cl
Согласно известному способу трансформированные рекомбинантными молекулами ДНК клетки микроорганизмов при помощи шаблона высевают на две чашки Петри с твердой питательной средой, каждая из которых содержит один из антибиотиков. После высева бактери.альные клетки выращивают в течение
12-24 ч. Сравнивают результаты роста на обеих чашках и отбирают те : клоны микроорганизмов, которые способны расти только на среде с одним из антибиотиков. Если в качестве вектора применяют плазмиду pBji 322, то каждый из отбираемых клонов трансформантов высевают на твердую питательную среду с ампициллином и тетрациклином (обычно используемые концентрации антибиотиков колеблются от 10 до 50 и более мкг/мл). Так,векторная плазмида pBR 322 придает клеткам резистентность к ампициллину и тетрациклину. Поэтому бактериальные клетки, содержащие исходный вектор, вырастают на обеих чашках, содержащих как ампициллин, так и тетрациклин. Клетки утрачивают устойчивость к ампициллину при введении чужеродной ДНК в состав вектора по сайтам оестрикции эндонуклеаз Pst I или Pvu I.. При этом клоны клеток, содержащие такие рекомбинантные молекулы ДНК, в отличие от .33 клеток, содержащих исходный вектор, растут на среде с тетрациклином и не растут на среде с ампициллином. Это является фенотипическим признаком для отбора клеток с рекомбинанТными молекулами ДНК-, Маркер устойчивости к тетрациклину инактивируется при интеграции чужеродной ДНК в сайты рестрикции эндо нуклеаз I, Зат JHI,. SaJ I .Транс формированные такими рекомбинантиыми молекулами ДНК клетки растут на среде с ампициллином и не рйстут на среде . с тетрациклином, что и помогает отличить их от клеток,трансформированных исходным вектором.Таки векторные молекулы ДНК называют вект рами инсёрционной инактивации. Однако существующие методы отбора бактериальных клеток, содержащих рекомбинантные молекулы ДНК, осуществляются химическими агентами , как антибиотики, что повышает их воз можную биологическую опасность для окружающей среды. Использование нескольких антибиотиков при селекции рекомбинантов увеличивает продолжительность операций при подготовке се лективных сред. При использовании этого метода в промышленных масштабах возникают существенные трудности /точное дозирование антибиотика, вне сение в питательную среду после стерилизации, инактивация антибиотика в.процессе хранения в составе среды, высокая себестоимость некоторых антибиотиков, разрушение антибиотиков в процессе культивирования за счет выделения в среду ферментов, деградирующих антибиотики, таких как -лактамаза. Целью изобретения является упрощение, способа отбора клеток микроорганизмов, содержащих рекомбинантные ДНК, и уменьшение его биологической опасности. Поставленная цель достигается тем что согласно способу отборки микроорганизмов, содержащих рекомбинаитные молекулы ДНК, включающему пересев микроорганизмов по шаблону на по верхность твердой п татёльной среды, инкубацию и отбор клонов микрооргаНИ.ЗМОВ на основании сравнения с контролем перед инкубацией микробны клетки подвергают ультрафиолетовому облучению, а клетки клонов микроорганизмов отбирают с того места контроля, где клетки опыта погибли. Пример 1, Клоны клеток получают после трансформации компетентных клеток E.coti НВ 101 чесА смесью сшитых с помощью полинуклеотидлигазы фага Т4, Fcopi-фрагментов ДНК фага Т4 с расщеплённой эндонуклеазой ЕсоД ДНК векторной молекулы рХ 13.. Полученные клоны клеток пересевают на поверхность твердой питательной среды, содержащей 10 г бакто-триптойа, 5 г дрожжевого экстракта, 10 г NaC, 15 г бакто-агара на 1000 мл воды, с Помощью шаблона. Пересев делают одновременно на две чашки ПеТри, после чего поверхность питательной.. ; среды одной чашки облучаютУф-светом ; (опыт). Клетки, высеянные на вторую , чашку, воздействию УФ-света не пйдвергают (контроль). В качестве источника УФ-сбета (л -25 нм) иcпoльзyютV ба ктерицидную лампу БУФ-15 прогретую перед опытом в течение мин,высот ; между поверхностью,на которой находят ся клетки, и УФ-источником lO см, время воздействия УФ-света бО с. После Уф-облучёния выращивают клетки без воздействия видимого света (полная темнота). Для этого после облучения чашки Петри (опыт) сразу . помещаютв светонепроницаемый контейнер (кон.верт из черной бумаги, ящиК: и т.п.) и выращивают в полной темноте ч. После . появления видимых колоний клеток сравнивают соответствие роста каждого клона клеток в контроле и опыте. На поверхности питательной среды обеих чашек Петри (контроль и опыт) вырастают клетки, содержащие исходные вектррные молекулы ДНК, с ненарушенном геном УФ-устойчивости. Вырастают на контрольной чашке Петри- и отсутствуют в опыте (не вырастают) клоны клетЬк, содержащие рекомбинантные молекулы ДНК,в ген ус- f/ тойчивости к УФ-облучениЮ которых произошла вставка чужеродного фрагмента ДНК. Сущность явления заключается в том, что в качестве генетического маркера, по инактивации которого происходит отбор рекомбинантов, используЮТ чесА ген Е. . Сайт расщепления эндонуклеазы Есо Р1 находится в Структурной частиЭТОГО гена. Таким образом, интеграция чужеродного фрагмента ДНК в Есо R1-сайт векторной молекулы ДНК ведет к инактивации (нарушению гена, что фенотипически проявл 1ется в исходной УФ-чувствительности трансформированных клеток. Если встройка чужеродной ДНК в EcoRI-сайт векторной молекулы ДНК отсутствует, ген УФ-резистентности функционирует и обеспечивает выживаемость клеток после облучения.
Пример 2. Аналогичным спо-: собом отбирались клетки, содержащие рекомбинантные молекулы ДНК, созданные на основе векторной молекулы ДНК рХ15 где при встраивании чужеродного фрагмента ДНК инактивируется ген УФ-устойчивосГи из Proteus mirabiFis. Ген устойчивости к ультрафиолету Proteus mirabitis имеет другую (отличную от чес А гена Е ) первичную структуру ДНК,кото рую определяют наличием сайтов расщепления для других эндонуклеаз рестрикции, в которые возможна интеграция чужеродного фрагмента ДНК,приводящая к нарушению гена УФ-устойчивости. Рассмотренный в примерах способ отбора на основе инсерционной инактивации генов позволяет конструировать новые векторы, так как эти . гены имеют отличную,первичную структуру ДНК и, тем самым, увеличивают число рестрикционных эндонуклеаз, применяемых при конструировании in iVitrp рекомбинантных молекул ДНК.
Преимуществами предложенного способа отбора микроорганизмов,содержащих рекомбинантные молекулыv ДНК, без использования антибиотикбв являются упрощение способа за счёт использования физических факторрв (Уф-свет) взамен химических факторов-, биологическая безопасность для окружающей среды микроорганизмов с рекомбинантными ДНК, упрощение состава питательной среды за счет отсутствия антибиотиков.
Формула изобретения
Способ отбора микроорганизмов, содержащих рекомбинантные молекулы ДНК включающий пересев микроорганизмов, по шаблону на поверхность твердой питательной среды, инкубацию и отбор клонов микроорганизмов на основании сравнения с контролем, от л и ч а ющ и и с я тем, что, с целью упрощения способа и уменьшения его биологической опасности, перед инкубацией клетки микроорганизмов подвергают ультрафиолетовому облучению, а клетки клонов микроорганизмов отбирают с того места контроля, где клетки опыта погибли,.
Источники информации, принятые во внимание при экспертизе
1. F. Bolivar etaE, Gene, 2, 1977, p. 95-113.
