ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ШТАММА ДРОЖЖЕЙ CANDIDA MALTOSA Советский патент 1994 года по МПК C12Q1/04 C12N1/16 

Изобретение относится к биотехнологии и касается микробиологического контроля производства биопротеина, а именно доказательства принадлежности присутствующих в промышленных ферменторах дрожжевых культур и конкретным штаммам.

Известна питательная среда для идентификации видовой принадлежности исследуемых дрожжей, содержащая сусло-агар. Идентификацию осуществляют на основании изучения морфологии 5-7-суточных колоний. Однако морфологический признак ненадежен и является лишь ориентировочным.

Известна питательная среда для идентификации принадлежности к виду дрожжей Candida maltosa, содержащая в 1 л сусло-агара 110-130 мг родамина 6Ж и 10-20 мг акрифлавина. 2-3 - суточные колонии, выросшие при рассеве исследуемой дрожжевой суспензии на сусло-агаре, суспендируют в лунках матрицы и штаммом-репликатором засевают на пластинки селективной среды. Результат учитывают через двое суток.

Недостатком известной питательной среды является то, что вследствие ингибирования роста других видов дрожжей рода Candida ее нельзя использовать для прямого высева с целью определения процента доминирования продуцента. Кроме того, она не позволяет выявить штаммовые отличия дрожжей, относящихся к виду С.maltosa, и тем самым проконтролировать доминирование конкретного штамма, что отражается на производительности и качестве готового продукта.

Целью предлагаемой питательной среды является повышение идентификационных свойств в отношении штамма дрожжей С.maltosa ВКПМ 4-808 (ВСБ-744).

Предложенное техническое решение заключается в следующем.

Среда для микробиологического контроля за промышленным штаммом С.maltosa ВКПМ 4-808 включает агар-агар и содержит маннит, дрожжевой экстракт и бром-крезол зеленый (БКЗ) при следующем содержании компонентов среды, г/л: Маннит 8,0-12,0
Дрожжевой экст- ракт 3,0-6,0
Бром-крезол зеле- ный 0,12-0,2 Агар-агар 14,5-15,5
Дистиллирован- ная вода Остальное рН среды 6,1±0,2.

Для приготовления среды все ее компоненты, кроме индикатора, растворяют в дистиллированной воде, автоклавируют при 0,5 атм в течение 20 мин. Раствор бромкрезолового зеленого добавляют к расплавленной среде перед употреблением.

Исследуемые культуры и дрожжевые суспензии засевают непосредственно на индикаторную среду или с помощью репликатора. На предлагаемой среде штамм С. maltosa ВКПМ 4-808 окрашивается в темно-бурый цвет, тогда как колонии остальных штаммов С. maltosa, а также других видов дрожжей рода Candida, встречающихся в промышленных ферментерах по производству биопротеина, имеют светлую голубовато-зеленоватую окраску.

Для иллюстрации предлагаемого изобретения на индикаторной среде с БКЗ изучили рост промышленных и коллекционных штаммов дрожжей рода Candida (таблица). Для этого однодвухсуточные культуры исследуемых штаммов, выросшие на сусло-агаре, суспендируют в матрице штам- ма-репликатора и засевают на пластинки индикаторных сред. Кроме того, разведения суспензий двух штаммов С.maltosa: ВСБ-744 и ВСБ-899, - непосредственно высевают на чашки с индикаторными средами. Результаты учитывают через двое-трое суток.

Длительность выращивания ограничена этим сроком, поскольку через сутки оценить окраску колоний затруднительно из-за их малого размера, а после четырех суток интенсивность окрашивания колоний С.maltosa ВСБ-744 уменьшается и различие между штаммами становится недемонстративным.

П р и м е р 1. Исследуемые штаммы засевают на среду, содержащую, г/л: маннит 10,0; дрожжевой экстракт 4,5; БКЗ 0,16; агар-агар 15,0; рН 6,1. Выращивание осуществляют при 33^оС в термостате. При учете результатов наблюдают полноценный рост всех исследованных культур. Окраска колоний штамма С. maltosa ВСБ-744 - темно-бурая. Колонии всех остальных культур (в том числе штаммов С.maltosa) имеют светлую окраску: серовато-голубоватую, серовато-зеленоватую, серовато-желтоватую.

П р и м е р 2. Штаммы засевают на среду, содержащую, г/л: маннит 8,0; дрожжевой экстракт 3,0; БКЗ 0,12 и агар-агар 14,5. Окраска колоний всех исследованных штаммов слабее, чем в примере 1, однако отличие штамма ВСБ-744 от остальных культур - четкое.

П р и м е р 3. Условия опыта аналогичные, за исключением состава среды, которая содержит, г/л: маннит 12,0; дрожжевой экстракт 6,0; БКЗ 0,2; агар-агар 15,5. Окраска культур несколько ярче, чем в примере 1, однако отличие штамма ВСБ-744 от остальных исследованных сохраняется.

П р и м е р 4. Условия посева и штаммы те же. Среда содержит, г/л: маннит 6,0; дрожжевой экстракт 1,5; БКЗ 0,08; агар-агар 14,0. Рост штаммов заметно ослаблен. Окраска всех штаммов по сравнению с примером 1 значительно слабее, штамм ВСБ-744 по окраске практически не отличается от остальных.

П р и м е р 5. Те же штаммы репликатором засевают на среду, содержащую, г/л: маннит 14,0; дрожжевой экстракт 7,5; БКЗ 0,24; агар-агар 16,0. Интенсивность окраски всех штаммов возросла по сравнению с примером 1. Различие между штаммом БСБ-744 и остальными культурами не существенное.

П р и м е р 6. На пластинках индикаторной среды, содержащей компоненты в количествах, указанных в примере 1, высеяны разведения суспензий штаммов С.maltosa: ВСБ-744 (ВКПМ 4-808) и ВСБ-899 (ВКПМ У-262) по 50-100 колоний на чашку. При учете через 2-3 сут колонии штамма ВСБ-744, имеющие темно-бурую окраску, четко отличаются от серовато-голубоватых колоний штамма ВСБ-899.

ЦМПМ с 1987 г. переименован в ВКПМ (Всесоюзная коллекция промышленных микроорганизмов).

Таким образом, предлагаемая среда позволяет отличить штамм С.maltosa ВСБ-744 от остальных промышленных штаммов этого и других видов дрожжей рода Candida, встречающихся в биоценозах промышленных ферменторов по производству биопротеина. Применение предлагаемой среды позволит впервые осуществить штаммовый контроль, что будет способствовать обеспечению регламентных показателей по производительности и качеству готового продукта, ускорит и упростит методику микробиологического контроля.

Использование: микробиологическая промышленность, среды для выявления в промышленных ферментерах дрожжевых культур, принадлежащих к штамму Candida maltosa ВКПМ 4 - 808 (ВСБ - 744). Сущность изобретения: готовят питательную среду, содержащую, г/л: маннит 8,0 - 12,0; дрожжевой экстракт 3,0 - 6,0; бром-крезол зеленый 0,12 - 0,2; агар-агар 14,5 - 15,5; дистиллированная вода - остальное. pH среды 6.1± 0.2. Исследуемые культуры высевают на чашки Петри. Выращивают при 33°С в термостате. Выросшие колонии анализируют через 2 - 3 сут. Окраска колоний штамма Candida maltosa, ВКПС 4 - 808 темно-бурая Колонии всех остальных культур, в том числе других штаммов Candida maltosa, имеют светлую окраску. 1 табл.

ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ШТАММА ДРОЖЖЕЙ CANDIDA MALTOSA, содержащая источники углерода, азота, агар-агар, индикатор и воду, отличающаяся тем, что, с целью повышения идентификационных свойств в отношении штамма дрожжей Candida maltosa ВКПМ У-808, в качестве источника углерода она содержит маннит, источника азота - дрожжевой экстракт, а в качестве индикатора - бром-крезол зеленый - при следующем соотношении компонентов среды, г/л:
Маннит 8,0 - 12,0
Дрожжевой экстракт 3,0 - 6,0
Бром-крезол зеленый 0,12 - 0,20
Агар-агар 14,5 - 15,5
Дистиллированная вода Остальное