Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L - продуцент моноклональных антител к рецептору эпидермального фактора роста человека Советский патент 1992 года по МПК C12N5/20 C12P21/08 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в медицине для изучения экспрессии рецептора ЭФР при патологических изменениях клеток, а также с целью выделения рецептора ЭФР человека для дальнейшего анализа.

Известны штаммы-продуценты моно- клональных антител /МКА/ к рецептору ЭФР /1-4/, полученные при слиянии клеток различных линий миелом с клетками селезенки мышей, иммунизированных клетками эпидермальной карциномы человека А 431. Однако во всех указанных работах рассматриваются лишь свойства самих МКА, но не дается каких-либо признаков гибридом, являющихся продуцентами МКА к рецептору эпидермального фактора роста человека. Преимущественно продуцируемые этими гибридомами МКА относится к типу IgG, тогда как поливалентность моноклональных антител класса IgM обеспечивает ряд преимуществ при изучении подвижности рецепторов ЭФР плазматической мембраны клеток (1).

Наиболее близкой к заявляемому штамму является гибридома, продуцирующая МКА к рецептору ЭФР человека класса IgM, известная как 2G2 - 1дМ(2).

Однако указанные МКА 2G2 - IgM оказывают активное ЭФР - подобное воздействие в процессе их использования, что затрудняет работу с нефиксированным материалом.

Целью предлагаемого изобретения является получение нового штамма-продуцента МКА к рецептору ЭФР человека, не вызывающих в процессе их применения индукции ЭФР-подобного воздействия на исследуемый материал.

Заявляемый штамм получают при слиянии с помощью полиэтиленгликоля клеток мышиной миеломы РА 1 с клетками селезенх| О 00

О

со ел

ки мыши линии , иммунизированной фракцией нагруженных ЭФР эндосом, полученной из клеток зпидермальной карциномы человека А 431. В результате селекции полученных гибридных клеток на среде ГАТ, скрининга гибридом по признаку продукции антител к внутриклеточным отсекам клеток А 431 и последующего клонирования был отобран штамм с авторским названием R10, стабильно продуцирующий МКА к рецептору ЭФР человека.

Штамм хранится в специализированной коллекции клеточных культур Института цитологии АН СССР - ВСКК/П/. Регистрационный номер 359 Д. К моменту депонирования штамм прошел 16 пассажей.

Физиологические, морфологические и культуральные признаки,

Штамм культивируют на ростоеой среде RPM1 1640 с добавлением следующих аминокислот /в мг на литр среды/; L - аланина - 8,9; L - аспарагинз - 15,0, L - аспарагино- вой кислоты - 13,0, глицина - 7,5, L- глюта- миновой кислоты - 14,7, L - пролина - 11,5, L - серина - 10,5, а также 50 мкМ R - мер- каптозтанола и 10% сыворотки плода коровы,

Клетки культивируют в пластиковой или стеклянной посуде в закрытой системе или в атмосфере 5% СОа при 37°С. При росте на указанной среде штамм образует округлые клетки. Время удвоения популяции 24-30 час. Клетки пассируют 1 раз в 2-3 дня. Кратность рассева 1:3.

Криоконсервацию проводят в смеси равных объемов кондиционированной ростовой среды и 20% деметилсульфоксида на ростовой среде при концентрации 10 клеток в 1 мл. Режим замораживания: 1°С в мин. от +20 до -60°С, 10°С в мин. - от -60° до -100°С, 50°С в мин. от -100° до -150°С. Клетки хранят в жидком азоте. Отогревают при 40°С в течение 1-2 мин, далее разбавляют 10 - кратным объемом среды, центрифугируют 3 мин при 1000 об/мин и высевают в ростовую среду.

Прививка культивируемых гибридных клеток штамма R10 сингенным мышам /линия BAI в/с/ вызывает у них образование асцитной опухоли. В асцитной жидкости содержатся МонАТ к рецептору эпидермэль- ного фактора роста. Способность к продуцированию МонАТ стабильно сохраняется, по крайней мере, 16 пассажей в культуре и 3 пассажа при перевивках на мышах /срок наблюдения/

Кариологическая характеристика.

В клетках с модальным числом хромосом /95-94 хромосом у 42% всех клеток/ при рутинном окрашивании, как правило.

присутствуют 4 хромосомы,меньшие по размеру, чем 19 хромосома,мышии не менее 2 маркерных хромосом больших, чем 1-я хромосома стандартного набора. Обнаружены

также 2 метацентрических маркера, отличающихся по размеру.

Продуктивность штамма. При стандартных условиях культивирования гибридома продуцирует МонАТ в та0 ких количествах, что для реакции иммунафлуоресценции на клетках А 431 культуральную среду можно применять в разведении 1:10.

Специфичность антитела подтвержда5 ют методом иммуноблотинга.

Каждая мышь линии предварительно получает внутрибрюшинно по 0,3 мл пристана. Через 4-17 дней животным внут рибрюшинно вводят гибридные клетки /10е

0 клеток на мышь в 0,5 мл среды/. Спустя 12 дней мышь забивают и из брюшной полости извлекают асцитическую жидкость /5 мл/. Клетки из асцитической жидкости отделяют центрифугированием и используют для

5 дальнейших перевивок гибридомы. Асцитическую жидкость используют в качестве препарата монАТ.

Клетки эпидермальной карциномы человека А 431 /примерно 107 клеток/ промы-

0 вают фосфатным буфером, солюбилизируют буфером, содержащим Хепес 20 мМ, глицерин 10%, тритии Х.100-1%, ЭДТА - 0.5 М и фенилметилсульфанилфлуорид - 1 мМ, 20 мин при комнатной температуре. Белки вы5 саживают охлажденным ацетоном 12 час и подвергают электрофоретическому разделению в 8% полиакриламидном геле. Перед нанесением на форез осадок суспендируют в децилсульфате натрия 1% и глицерина

0 10% с последующим прогревом 5 мин при 60°С. После окончания электрофореза перенос белков на нитроцеллюлозу проводят по стандартной методике. Места неспецифического связывания на нитроцеллюлозе забивают 1-часовой инкубацией в Трис-НС

5 буфере при рН 7.35, 50 мМ с добавлением NaC1150 мМ, Твин 20-0,1 % и человеческого сывороточного альбумина 30 мг/мл, обозначенного как раствор А. Асцитическую жид- - кость гибридомы R 10 разводят 10.000 раз в

0 этом же буфере и выдерживают с пере- несенными на нитроцеллюлозу белками 12 час при 4°С. Выполняют 3 промывки раствором А и инкубируют с кроличьей антисывороткой против мышинных антител.

5 Затем - 3 промывки раствором А и инкубация с иодированным препаратом белка А. После 3-х кратной промывки раствором А нитроцеллюлоза с перенесенными клеточными белками высушивается и экспонируется с рентгеновской пленкой Рт-В при -70°С.

Установлено, что полученная асцитиче- ская жидкость содержит монАТ к белку с мол. весом 1701000. В сочетании с данными по иммунопреципитации монАТ R 10 белка с мол. массой 170.000. способного автофос- форилироваться после добавления ЭФР, и данными по параллельному применению в процедурах иммунопреципитации и имму- ноблоттинга поликлональных антител к рецептору ЭФР /предоставлены А. Содерквист, Вандербильдский университет, США/ это доказывает, что МонАТ R 0 узнает именно рецептор ЭФР.

Характеристика МКА, продуцируемых штаммом R 10

МонАТ, сокретируемые в асцитичеекую жидкость клетками гибридомы штамма R10, связываются с рецептором эпидермального фактора роста человеческой эпидермаль- ной карциномы. Связывание монАТ с ре0

5

0

цептором ЭФР установлено реакциями иммунопреципитации и иммуноблоттинга, а также непрямой реакцией поверхностной иммунофлуоресценции на клетках эпидер- мальной карциномы человека А 431. По данным электрофореза в полиакриламидном геле монАТ, продуцируемые клетками гибридомы штамма R 10, относятся к классу дМ.

Характерной особенностью МонАТ, продуцируемых гибридомой R 1D, является то, что это монАТ узнает эпитоп экстраклеточного домена рецептора ЭФР и неоказы- вают ЭФР-подобного действия на исследуемый материал.

Формула изобретения Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculuss L, ВСКК(П) № 359Д - продуцент моноклональных антител к рецептору эпидермального фактора роста человека.

Использование: биотехнология, медицина. Сущность изобретения: штамм получен слиянием клеток мышиной миеломы PAI с клетками селезенки мыши линии BAIB/C, иммунизированной фракцией нагруженных ЭФР эндосом, полученной из клеток эпидермоидной карциномы человека А 431. Гибридные клетки продуцируют иммуноглобулины класса IgM.