Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для детекции соматотропина человека иммуно- химическими методами в биологических жидкостях и тканях, а также во фракциях
при выделении гормона. На основе этих мо- ноклональных антител могут быть созданы иммуносорбенты для выделения гормона.
Известны моноклональные антитела к соматотропину человека.
Некоторые из известных моноклональ- ных антител имеют перекрестную реакцию с родственными антигенами, другие специфичны для соматотропина человека.
Цель изобретения состоит в получении штамма гибридных культивируемых клеток мыши, продуцирующего моноклональные антитела к соматотропину человека, не дающие перекрестных реакций с другими ги- пофизарными гормонами человека и живртных и с плацентарным лактогеном человека.
Штамм получают следующим образом.
В качестве антигена используют высокоочищенный соматотропин (СТ) человека, полученный в ВЭНЦ АМН СССР. Мышей линии BaLB/c иммунизируют высокоочищенными препаратами СТГ человека по следующей схеме: в 1-й день 100 мкг гормона в полном адъюванте Фрейнда (ПАФ), на 28-й и 46-й дни по 50 мкг гормона в ПАФ. Реиммунизация на 56-й день - 100 мкг гормона в фосфатном буфере (ФБ). Через три дня после реиммунизацииу мышей стерильно берут селезенку и готовят суспензию спленоцитов. Гибридомы получают путем слияния спленоцитов с клетками мышиной миеломы Х.63.Ад.653 с помощью 50% поли- этиленгликоля с М.м. 1500. Соотношение клеток селезенки и клеток миеломы 5:1. Се- лекцию проводят на среде HAT, выполняют два клонирования методом лимитирующих разведений (1 клетка на 3 лунки), получают 100% позитивных клонов. Стандартные условия выращивания: среда RPMI-1640 с 10%-ной фетальной сывороткой крупного рогатого скота, температура при культивировании 37°, газовая фаза - воздух с 5%
С02.
Способ культивирования - в пластико- вых флаконах на 50-250 мл, кратность посева 1:2, время субкультивирования 3-4 дня. Рабочее разведение моноклинальных антител против соматотропина человека в куль- туральной среде 1:500-5000 в ИФА (иммуноферментный анализ). В организме животного - мышь BaLB/c, обработанная пристанем (1 мл в/бр за 5 дней до инокуляции), доза инокуляции 3-8 10 , время образования асцита 10-20 дней.
Полученный штамм гибридных клеток обозначен Ф 17. Штамм хранится в Специализированно коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Всесоюзной коллекции клеточных культур под но- мером ВСКК(П) 399D и характеризуется следующими признаками. Данные выдовой принадлежности: мышиные клетки BaLB/c, Гибридома секретирует моноклональные антитела, определяемые иммуноферментным методом. Контаминации бактериями и грибами нет, микоплазмы не выявлены.
Штамм гибридных клеток продуцирует моноклональные антитела GI класса, направленные к соматотропину человека, специфичность оценивается иммунофермент- ным методом. Моноклональные антитела не реагируют с плацентарным лактогеном человека, пролактином человека и с со- матотропином и пролактином быка. Концентрация моноклинальных антител в культуральной среде около 10 мкг/мл, в ас- цитной жидкости около 7 мг/мл, титр антител васцитическойжидкости 2 10 -10 при концентрации антигена при нанесении на плейты 1 мкг/мл. Продукция моноклональ- ных антител стабильна по крайней мере в течение 30 пассажей ин витрои 15 пассажей на животных, если гибридома перевивается на мышах.
Способ крио консервации: 4 х 106 клеток в RPMI-1640 с 10% PCS + 10%DMSO, замораживание в пенопластовой коробке при - 70°С. Жизнеспособность клеток после размораживания 70-90% (оценка жизнеспособности клеток по исключению трипа- нового синего после 24 ч культивирования).
Определение специфичности монокло- нальных антител Ф 17.
Моноклональные антитела против со- матотропина человека получены путем выделения их из асцитической жидкости мыши. Из 1 мл асцита с помощью ионообменной хроматографии на колонке с ДЭАЕ целлюлозой выделено 6,8мг антител к соматотропину человека. Для проверки специфичности моноклональных антител Ф 17 была исследована их способность связывать гомологичный антиген человека, полученный генноинженерным способом, а также соматотропин быка, плацентарный лактоген и пролактин человека, пролактин быка и пролактин свиньи. Моноклональные антитела реагировали только с соматотро- пином человека и не реагировали с плацен- тарным лактогеном и пролактином человека, с соматотропином быка, пролактином быка и свиньи.
П р и м е р 1. Использование монАТ Ф 17 в качестве высокоспецифического детектора при определении соматотропина человека с помощью ИФА.
На микротитровальных плейтах сорбируют аффинно очищенные поликлональные антитела к соматотропину человека (в концентрации 20 мкг/мл). Затем в лунки вносят по стандарта соматотропина человека в фосфатном буфере в известной концентрации. После инкубации 1 ч в лунки добав- яют по 60м I конъюгата монАТ Ф 17 с
пероксидазой хрена в 0,1%-ном растворе BSA. Плейты инкубируют 40 мин и добавляют субстрат для развития ферментативной реакции (о-фенилендиамин в Na-цитрат фосфатном буфере, содержащем 0,012% перекиси водорода). Инкубируют 30 мин при 37°С. Останавливают ферментативную реакцию, добавляя в лунки 10% серную кислоту. Интенсивность окраски в лунках измеряют с помощью спектрофотометра с вертикальным лучем 492 нм. По полученным значениям оптической плотности были построены калибровочные кривые. Данные моноклональные антитела могут быть использованы в качестве специфического детектора при создании иммуноферментной тест-системы для определения соматотро- пина человека.
П р и м е р 2. Радиоиммуноблотинг со- матотропина человека с использованием монАТ серии Ф 17.
Продуцируемые штаммом Ф 17 монАТ к соматотропину человека использованы для
идентификации соматотропина человека в системе иммуноботинга. С этой целью по окончании обычного электрофореза соматотропина человека в ПАР в присутствии
додецилсульфата натрия проводят перенос антигена с геля на нитроцеллюлозу в течение 8 ч при 4°С. Затем в течение б ч при 37°С следует забивка свободных от антигенаа мест на нитроцеллюлозе раствором 5%-ного овальбумина в фосфатном буфере, содер- жащем 0,05% твин-20. После этого нитроцеллюлозу в течение 24 ч при 4°С обрабатывают меченными 1 монАТ. МонАТ Ф 17, меченные 1125 обнаруживали соматотропин человека на нитроцеллюлозе при внесении его в гель в количестве мкг.
Формула изобретения
Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L ВСКК(П) 399О-продуцент моноклональных антител к соматотропину человека.
Изобретение относится к гибридомной технологии. Использование моноклональ- ных антител, продуцируемых штаммом № ВСКК(П) 399D, позволяет обеспечить разработку иммунохимических методов детекции соматотропина человека в биологических жидкостях и во фракциях при выделении гормона. Штамм получен путем гибридизации клеток миеломной линии Х.бЗ.Ад 8.653 с клетками селезенки мышей BALB/c, иммунизированных высокоочищенными препаратами соматотропина человека, полученными в ВЭНЦ АМН СССР. В качестве сливающего агента использовали ПЭГ 1500. Селекция клеток проведена на среде HAT, осуществлено два клонирования методом лимитирующих разведений (1 клетка на 3 лунки), получено 100% позитивных клонов. Условия выращивания клеток штамма № ВСКК(П) 399D: среда RPMI 1640 с 10% фе- тальной сыворотки крови крупного рогатого скота, 37°С, газовая фаза-воздух с 5% СОа. Способ культивирования в пластиковых флаконах на 50-250 мл, посевная доза 500000 кл/мл. Тестирование моноклональ- ных антител проводят непрямым иммуно- ферментным анализом с использованием в качестве антигена высокоочищенного препарата соматотропина человека. После инокуляции клеток в брюшную полость мыши через 10-20 дней получают асцитиче- скую жидкость. С помощью ионообменной хроматографии на колонке ДЁАЕ-52 целлюлозой из 1 мл асцитической жидкости выделяют до 6 мг иммуноглобулинов, содержащих около 80-90% моноклинальных антител, продуцируемых клетками штамма № ВСКК(П) 399D. Полученные моноклональ- ные антитела взаимодействуют с соматотро- пином человека в разведении 1 мкг/мл. С другими гипофизарными гормонами человека и животных, а также с плацентарным лак- тогеном человека данные моноклональные антитела не реагируют. сл С -ч ю со ю -xj
