Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L - продуцент моноклональных антител к дифференцировочному антигену лимфоцитов человека Советский патент 1991 года по МПК C12N5/18 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для выявления дифференцировочного антигена Т- и В-лимфоцитов человека.

Целью изобретения является получение штамма гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела (мои AT) к дифференцировочному антигену лимфоцитов человека.

Штамм получают следующим образом

Штамм клеток ИПО-Е8 получают при соматической гибридизации клеток селезенки мыши BALB/c, иммунизированной клетками линии RPMI-1788 (В-лимфоциты

периферической крови человека трансформированные вирусом Эпштейна-Барр) и ми- еломной линией Р3-Х63-Ад8 653 Слияние ь 16ТОК миеломы с клетками селезенки мыши ri бридных клеток проведено с помощью ГАТ-среды (конечная концентрация гипо ксантина10 ,аминоптерина4х10 М тими дина 1,6x10 М) Скрининг специфической антительной активности проводят мотодом иммунофлуоресценции в непрямом пяриан те на монослое живых клеток на линии клеток RPMI-1788 После клонирования реклонирования и пассирования in vitro от бирают 1 клон гибридомы ИПО Ь8 клетки

о

IOO

Ј.

со :GJ

00

которого активно продуцируют антитела к поверхностным антигенам линии клеток RPMI-1788 Штамм обозначен ИПО-Е8, он хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии ЛИ СССР под номером 281Д и .арякгеризуегся следующими признаками

Морфологические признаки,

Кпетки гибридомы являются лимфобла- стами со средним ядерно-цитоплазматиче- ским отношением, слабобазофильной цитоплазмой, сетчатой структурой хроматина

При циюхимнческом исследовании в цитоплазме кпеток ке обнаружена активность ферментов пероксидазы и щелочной Фосфагазы. Активности кислей фосфатазы, неспецифической зкстеразы очень слабая диффузная

Культуральные признаки.

Для вырэщиолния клеток ИПО Е8 использую1 пластиковую и стеклянную посуду. Посевная доза 100 тыс. клеток на миллилитр. Клетки пассируют один раз в 3-4 дня, кратность рассева 1:7 Культура суспензионная. Среда культивирования - срода RPMH640 или ДМЕМ с 10% донор ской телячьей сыворотки, 4 мМ глутамина. 100 мкг/мл гентамицина при 37 С в атмосфере 5% СО.

При пассировании штамма на мышах линии BALB/c доза клеток при прививке составляет 10 в 5 мл среды Игла Мышам за 7 10 дней ао инъекции клеток ввооят внут- рчбрюшинно ппистан Асцит формируется через 12-14 дней. Секрецич моноклонапь- чь:х антител на 3 4 день к/льтивирова- н и я составляет 10 15 м к г в 1 мл куль турапьной среды и 3 С мг в 1 мл эс- цитной жидкоегн

Режим крмоконсервиросэния

Для длчте л .-ю п хранения клеток штамм замораживают р. эмбриональной телячьей с ыворотке с добавлением 10% диме- тилсульфоксида. Режим замораживания 4° в минуту до 4° С, затем 1° в минуту до -70° С. дапее клетки переносят в жидкий азот.

Гибридому размораживают при переносе ампулы с клетками из жидкого азота в водяную баню при 37°С Жизнеспособность клеток после размораживания 70 80% по окрашиванию трипановым синим

Контаминация бактериями, грибами и микоплазмой не обнаружена

Характеристика МонАТ

МонАТ (ИПО 4) относится к IgM классу. Специфичное.1. МонАТ ИПО-4 изучают на 18 линиях клеток человека различного происхождения Среди них RPMI-1788, PH S,

GRO (В-лимфоциты человека, трансформи ровэнные In vitro вирусом Эполейна-Бзрр) Daudl, Namolva, Rajl, Ramos. EB-3 (лимфома Беркитта), RPMI-8226 (множественная миелома), Т-клетсчные линии МОП-4, f.CRF- Hs,B2, Jurkat. СЕМ, МТ-4, Н9. эритробластоидная линия К 652. (ме ланома), А-431 (аденокарцинома шейки матки) Все линии клеток культивируют на

0 среде RPMH640 с 10% инакгивировянной эмбриональной телячьей сыворотки. Кроме тою, используют лимфоциты крови, стиму- лиэованные митогенами, клетки крови и кроветворных органов 10 практически здо

5 ро зых людей, 66 больных с различными ва- ри нтами л/,мфоидных форм лейкозов, 3 больных острым миелобластным лейкозом (ОМЛ), 33 больных лимфогран/лематоэом (Л Г М) и неходжкинскими злокачественными

0 лимфомами (I )ЗЛ). клетки миндалин 7 детей с хроническим тонзиллитом в фазе компен сации.

МонАТ ИПО-4 не взаимодействуют с антигенами гранулоцитов крови практически

5 здоровых людей и клетками периферической крови больных ОЛЛ. Только в единичны случаях клетки периферической крови больных хроническим лимфолейкозом (ХЛЛ), миеломной болезнью (МБ) имеют по0 аерхностный антиген, выявляемый МКАТ ИПО-4. Вместе с гем у 3 из 25 больных острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ) ко- ли .8С.т-;о клеток, с которыми связывают ан- rmenj достигает 4,5 18.4%. Во всех

5 случаях волосатоклеточного лейкоза (ВК/1) обнаружен антиген, определяемый МонАТ ИПО-4 С МонАТ ИПО-4 реагируют 13,0% клеток миндалин детей с хроническим тонзиллитом и 6,0-10% мононуклеаров пери0 ферической крови доноров. Клетки лимфатических узлов больных ЛГМ и НЗЛ также в основном содержат антиген, определяемый МонАТ ИПО-4.

Пример 1. Лимфоциты из гепарини5 зированной периферической крови донора выделяют с помощью дифференциального центрифугирования в градиенте плотности фиюлл-верогрэфина (d-1,077 в течение 30 мин при 400д). Клетки, отобранные с интер0 фазы, отмывают путем трехкратного центрифугирования (5 мин при 2х103 об/мин) в растволре Хенкса, рН которого 7,2-7 4. ЛимЛоидные клетки в концентрации 4x10 /мл в ГЛАРХ наносят в лунки на пред5 метные стекла. Инкубируют препарат 45 мин при 37° С во влажной камере Отмыва ют в 3 стаканчиках с ГЛАРХ. Наносят по 0,05 мл супернатантэ гибридомы ИПО-Е8 на лунку Супернатант инкубируют 20 мин при 37° С во влажной камере, отмывают в 3 стаканчикахс ГЛАРХ Наносят мрчсную Fill, кроличью сыворотку против Ig мыши в разведении 1 16 по 0 05 мл на лунку Пропарят v к/ и руют 20 мин при 37° С RO влажной камере а затем отмывают в трех стаканчика L ГЛЛРХ и высушивают на воздухе Удаляют парафильм наносят 50% глицерина на PBS покрывают препарат покровным стеклом и запаивают парафином Иггледуют препа рат в цпнтпом микроскопе Золе ное те наблюдают на поверхности 5% клеток те в перис} ери скси крови донора 5% клеток несут поверхностный анги ген выявляемый МонАТ НПО 4

П р и м е р 2 Лимфоциты имеют повер хностные рецепторы для некоторьк белков растительного и бактериального происхож дения обладающих митогенннм деигтви ем К числу наиболее распространенных митогенов относятся фитогемагглюынин (ФГА), конканапалим Л (Кон AJ бактерчаи ныи липополисахэрид (ЛПС I митпген лчкл носа (PWM) и др

Блэгттрансформиропанная культура лимфоцитов явпяегся удобной моделью для изучения маркеров диффрренцировки ним фоцитов Проводят изучение экспрессииан тигенэ, определяемого МонЛ МПО 4 на лимфоцитах периферичгснон крови доно ров подвергшихся действию ра 1личт х ми тогенов

ЛПС В клеточный тимус независимый митоген Клетками мишенями дня ППГ яв ляется фракция В лимфоцитов имеющих большую плотность (d 1 071 1 030) Через 24 ч в культурах стимулировании/ ППС не замечено существенных изменении н коли честве клеток реагир/ющил с МонАТ НПО 4 Через 72 ч после ЛПС стимуляции в

культур и )H)T по вля-ься клетки бластоа которые при постановке pea- ,i

Н пр ЮГ иммуноф lyfie цеиции дают ПО 10 1ЬНУЮ р 1К1|1 Ю NV)M/ 111 It1

моген лакмн н (PVVM1 «ьпыпл т

ИИИС1МуЮ ДИф j Г Pt )ВК Ь ТИК- ) иЦИ ТО периферичес н kpOBl ( f h : флССИИ антИГР ОП Orl|; Л1 ПРМЫИ v1 i

чА1 МПО 4 наблюл HI T и к ,н - 0 пиропания V ненотпрых доноров ,i .1 стимуляции MOHOHVклеароп периферии скои кропи PWM отмечают логю 1нител |.,,и подтем тела ИМО 4 к лет if на 2 3 куп(тичигпвания

4ФГА И КОН А ГЛИКОПрОТРИДЫ КО рч.е

П1Ч улиру ОТ ПГ 1 lylllPCTBPHHO Т ЛИМфО|, 1 ГЫ ПИК MH4HLH4( И Г)К ИВНОСТИ Ф А ППИХО

дится Uri оО Ьи ч к t ьтипиргпания а Ко л

41 1rj Ч ПО ме Д( и а ми or ( ,{ , UMV

0 ivl )нАТ НПО 4 к четки ппреде ЯК ripi Г ГЛ с имуяции 1 день пм/ ii ц11 |и OF п рифср i k пи кр ни е i л к ° и ,i 1.1 д -нь i тип1, 1Я1,, И Кип Л

Отмечаю: ,ве1иченир Г1) 1|1() t

5 кпптокпригт1. у |п|чип Ч iD Г it,м он А мононукрелрог )Ифгри ( ои kpim i ч° л о г с к а

Чя OiHOMjHim ачапи r-r , но МонА1ИП() 1 чо . iio ir i t .To rT|iif

0 ла секрет иру vre к и; лма iMlO F8 мышиной гибрид(1мы гыяв .оют антиген f bt t Т п Г лим мигьг человека

Форму 1 з о р Р i е и i j

(иГ ридчк h v ы и ифург ых

клеток ж и в э т н LI v Ми-, uscuii-s L RCKK/П/ П 2)i/, прод.,1. IT момссло нзльнь х антигг л к , речцнр.о| о «ному arii Hie ну лимфоцитов чел о реки

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к гибридомной технологии, и может быть использовано для выявления дифференцировочного антигена Т- и В-лим- фоцитов человека. Целью изобретения является получение штамма гибридных клеток продуцирующих моноклональные антитела (МонАТ) к дифференцировочному антигену лимфоцитов человека Штамм получен при соматической гибридизации клеток мышиной миеломы РЗ-Х63 Ад8 653 им клеток се лезенки мыши линии BALB/c. иммунизированной клетками В-лимфобла- стоидной линии человека - RPMI 1788 Клетки штамма секретируют МонАТ принадлежащие к классу IgM Штамм депонирован под номером ВСКК/П/ 282Д Эти антитела выявляют дифференцировочный антиген лимфоцитов человека экспресси- рованный на поверхности активированных Т- и В-лимфоцитов Секреция моноклональ- ного антитела на 3 4 день культивирования составляет 10-15 мкг в 1 мл к/льтуральчои среды и 3-5 мг в 1 мл асцитической жидкости Условия культивирования типичны для гибридом (Л с