Штамм бактерий SтRертососсUS тнеRморнILUS - продуцент @ -галактозидазы Советский патент 1992 года по МПК C12N9/38 C12N1/20 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к штаммам продуцентам внеклеточной Д-га- лактозидазы. Фермент /5-галактозидазы используется в ряде отраслей пищевой промышленности, особенно перспективным является использование этого фермента в молочной промышленности для гидролиза лактозы молока и молочных продуктов. Известен штамм Penlcilllum canescens ВКПМ F-436. Активность фермента на среде, содержащей 3% свекловичного жома, 5% БВК и 2.Б % однозамещенного фосфорнокислого натрия через 120 часов культвирования - 106,4 ед/мл. через 144 ч - 133,7ед/мл.

В настоящее время не существует продуцентов уЗ-галактозидазы полученных на основе молочнокислых бактерий, которые могли бы использоваться как компоненты

заквасок при производстве творога и других молочных продуктов. Использование таких штаммов молочнокислых стрептококков позволит получать сыворотку в которой вместо лактозы будут присутствовать глюкоза и галактоза.

Цель изобретения-создание продуцента уЗ-галактозидазы для молочной промышленности, обладающего высокой продуктивностью и способного выделять фермент в культуральмую жидкость на ос- нове Str. thermophilus. Цель достигается путем получения нового высокоактивного штамма-продуцента Str. thermophllus СМ1351. Этот штамм создан на основе штамма Str. thermophllus 6 кб, полученного нами из колекции ВИИКМИ (штамм Str. thermophllus 6 кб депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов института ВНИИгенетика под

XI

о оо

о

W 00

номером В-2242). В настоящее время этот штамм писпользуется в качестве компонента закваски для производства творога. Штамм Str. thermophllus CM 1351 получен в результате многоступенчатой селекции с применением нитрозгуанидина. Селективный отбор проводили по способности клеток растущей культуры выделять фермент /3-галактозидазу в культуральную жидкость. Исходный штамм Streptococcus thermophllus 6 кб не обладал способностью выделять фермента /J-галэктозидазу в культуральную жидкость, ft- галактозидазная активность Streptococcus thermophllus 6 кб составляет 20000 ед/мл, если за единицу активности принято такое количество фермента, которое гидролизует 1,М субстрата зз 1 минуту при 37°С, при пересчете на 1мкМ субстрата активность составляет 20 ед/мл, что соответствует удельной активности 19,6 ед/мг белка. Активность предлагаемого штамма Str. thermophllus СМ1351 составляет 34000 ед/мл, если за единицу активности принято такое количество фермента, которое гидролизует 1 М субстрата за 1 мин при 37°С, при пересчете на 1 мкМ субстрата активность составляет 34 ед/мл, что соответствует удельной активности 33 ед/мл беячз. Время ферментации 12ч. Фермент выделяется в кульгуральнуюжидкость. Преимуществом данного штамма по сравнению с известным штаммом является короткое время ферментации, а таже способность данного штамма продуцировать внеклеточную /2-гэлактоэидазу. Следует отметить, что новый продуцент /3-галактозидазы получен на основе уже применяемого в молочмой промышленности штамма Streptococcus thermophilus 6 кб. таким образом использование соззданного нами штамма позволит без именения существующей технологии получать сыворотку с гидролизованной лактозой

Штамм Streptococcus thermophilus CM 1351 депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов института В НИ И генетика под номером В - 5392.

Штамм Streptococcus thermophllus CM 1351 имеет следующие культурально- морфологические признаки:

Морфология клеток. Малоподвижные грамположительные кокки в парах и цепочках, не образуют спор.

На агаризованной среде М21 10 с 1% лактозы при температуре 37°С через 24 ч образует круглые, беловатые, слабо выпуклые колонии диаметром 0,7-1,5 мм.

На молоке с гидролизовэнным белком (1.5% агар) при температуре 37°С через 24 ч образует круглые, беловатые, слабо выпуклые колонии диаметром 0,5-1 мм.

На лактозном агаре 11 при температуре 37°С через 24 ч образует круглые, беловатые, слабо выпуклые колонии диаметром 0,3-0,6 мм.

В жидкой среде М21 с 1% лактозы и в

жидком гидролизованном молоке через 12 часов образует сильное равномерное помутнение, при дальнейшем культивировании наблюдается осаждение клеток.

Физиологические признаки. Штамм хорошо растет на синтетических средах (М21), молоке и молочной сыворотке.

Отношение к углеводному питанию. Усваивает глюкозу, галактозу, лактозу, сахарозу и фруктозу.

Отношение к кислороду. Факультативный аэроб.

Отношение к источникам азота. Хорошо усваивает пептон дрожжевой экстракт. Отношение к температуре. Термофил,

растет при температуре от ТО до 55°С, оптимальная температура 43°С.,

Отношение к кислотоности среды. Растет при рН 4,0-9,0, оптимальное значение рН 7,0.

Генопит. Полиауксотроф, не содержит плазмид, устойчив к канамицину (10 мкг/мл), не патогенен.

Продукт, синтезируемый штаммом. Молочная кислота.

Хранение штамма. Культура хранится в лиофилизированном состоянии либо в глицерине при -20°С в течение 1 года.

Пример использования штамма для получения фермента /3-галактозидазы.

Для получения исходного посевного материала культуру штамма Streptococcus thermophllus CM1351 выращивают в течение 20 часов при 37°С на среде М21, содержащей следующие компоненты, г/л: пептон - 10, дрожжевой экстракт - 5, лактоза - 10,

Na2HPOo-8,5, KH2P04-2, MgS04-1.

Полученную клеточную суспензию используют для засева ферментационной среды М21. Процесс ферментации проводят в ферментере Marublschi (объем 1 литр),

среда М21 с 5% лактозы при постоянном значении рН 8,0, и температуре 37°С. Постоянное значение рН поддерживают за счет автоматической подтиртовки щелочью (NsOH). Процесс ферментации идет без искусственной аэрации при слабом перемешивании. Через 12 часов полученную культуральную жидкость центрифугируют для отделения клеток. Активность -/2-галактозидазы определяют по реакции с 0-нит- рофенил-/3-галактопиранозидом по методике Парди, Жакоба и Моно. За единицу активности фермента принимали такое количество фермента, которое гидролизует 1 мкМ субстрата за 1 мин при 37°С. В этих условиях активность фермента в культу- ральной жидкости через 12ч ферментации составила 34 ед/мл (34000 ед/мл,- если за единицу активности принято такое количество фермента, которое гидролиэует 1 М субстрата за 1 мин при 37°С), что соответствует удельной активности 33 ед/мг белка.

Таким образом, преимуществами предлагаемого штамма по сравнению с известным штаммом являются: короткое время ферментации, высокая активность фермента и способность выделять Д-галактозидазу в культуральную жидкость. Кроме того предлагаемый штамм легко встраивается в технологический процесс производства пищевых продуктов, так как создан на основе уже используемого в промышленности штамма.

Формул а изобретен и я

Штамм бактерий Streptococcus thermophllus ВКПМ В-5392-продуцент лэктозйдэзы.

Использование: биотехнология, пищевая промышленность, молочная промышленность для гидролиза лактозы в молоке и молочных продуктах. Сущность изобретения: штамм-продуцента фермента /2 гзлак- тозидазы создан на основе штамма Streptococcus thermophllus (ВКПМ В-2242), который в настоящее время используется в качестве компонента заквасок при производстве творога. Штамм Streptococcus trermophilus (ВКПМ В-5392) (СМ1351) получен в результате многоступенчатой селекции с применением нитрозгуанидина. У предлагаемого штамма при выращивании на среде М21 с 5% лактозы при постоянном значении рН 8,0 и температуре 37°С в течение 12 ч активность фермента/3-галактози- дазы составляет34 ед/мл, что соответствует удельной активности 33 ед/мг белка.