Штамм гриба РеNIсILLIUм caNeSceNS - продуцент @ -галактозидазы Советский патент 1992 года по МПК C12N9/40 C12N1/14 

Изобретение относится к ферментной промышленности, в частности к получению нового штамма, продуцента фермента о;-галактозидазы.

а -Гэлактозидаза используется широко, в пищевой и микробиологической отраслях промышленности, аналитической биохимии, при выяснении строения различных ут- леводосодержэщих биополимеров и низкомолекулярных соединений, содержащих концевые я-D-галактозидные группировки, а также в медицине при лечении - наследственных энзимопатий - болезни Фабри, связанной с недостатком в организме человека лизосомальной а -галактозидазы и гематологии при изучении группоспецифических веществ крови.

Предлагаемый штамм Pehicilllum canescens ВКПМ F-417-продуцент а -галактозидазы получают путем облучения ультрафиолетовыми лучами в дозе 400 Дж/м конидии исходного штамма Penicillium canescens Sopp. 20171 и обладает указанными свойствами.

Морфологические признаки.

Штамм атоксичен, быстрорастущий, характеризуется умеренным спороношением. Образование конидии начинается на два дня позже, чем в исходной культуре.

Конидиеноецы длиной 400-500 мкм и с диаметром 2,8-3 мкм отходят от войлочного мицелия, оболочка четко-шероховатая. Кисточки двухъярусные, растопыренные, состоят из веточе к (метуль), несущих мутовки -

Os

ы

го

лид, метули около (10-15)х(.5) мкм, сте- рйгмы (7-8)х2,8 мкм.

Культуральные признаки.

Штамм хорошо растет на искусственных средах (сусло-агаре, кэртофельно-глю- козном агаре, картофельном агаре) и синтетических агаризованных средах (средах Чапека, Сабу-ро, Ролена-Тома, агаризо- вэнной среде с лактозой).

На агаризоеанной среде Чапека, сусло- агаре, агаризованной среде с лактозой колонии пушистые, состоящие из плотного базального войлочного и рыхлого сплетения воздушного мицелия со слабо выраженной радиальнобороздчатостью, умереннымспо- роношением; с растущим краем до 2-3 мм ширины; колонии бледно-голубовато-серого цвета, затем сероватого цвета и потом при старении колонии приобретают дымчато-сероватый оттенок.

Линейный рост колонии на агаризованных средах по дням: на сусло-агаровой среде - 5-й день - 45-50 мм, 10-й день - 60-70 мм; на среде Чапека - 5-й день - 25 мм, 10-й день - 35-40 мм; на агаризованной с лактозой - 5-й день - 30 мм, 10-й день - 50-60 мм.

На отрубях штамм растет хорошо.

Отношение к углеродному питанию: мутант хорошо усваивает моносахариды - глюкозу, галактозу, арабинозу; сахароспирч ты - сорбит, маннит; из дисахаридов - лактозу, сахарозу, мальтозу, а также крахмал и инулин..

Отношение к азотному питанию: усваи- вает нитратный азот, лучше аммонийный. Из органических источников азота ассимилирует пептон, мочевину, кукурузный экстракт, дрожжевой автолизат.

Отношение к кислороду: облигатный аэроб.

Отношение к температуре: мезофил, оптимальная температура для роста и биосинтетической активности 27-28°С.

Отношение к кислотности питательной среды: растет в широких пределах рН 2,0- 9,5.

Для размножения штамма применяют модифицированную среду Чапека с раффинозой следующего состава, %: раффиноза 3,0; МЩМОз 0,2; КНаРОл 0,1; MgS04 0.05; KCI 0,05; кукурузный экстракт 0,05; агар 2; исходное рН 5,8-6,0.

Питательной средой для ферментации служит среда следующего состава, %: сое- вая мука 3,0; Мз2НРО4 12Н2О t,5; (NH2S04 0,2; KCI 0,05; MgSQ 0.015: исходное рН 4,1-4,2.

Проверкой, проведенной в течение четырех лет, установлено, что при хранении и

пересевах уровень ферментативной активности Penicillium canescens AMT-85 не снижается,

Использование предлагаемого штамма дает возможность при организации производства а -галактозидазы в СССР получить культуру гриба с повышенной в 5-6 раз активностью. ТермостэбильнЪсть штамма 50- 55°С, кислотоустойчивость - рН 2,0-8,0.

Кроме высокоактивной а-галактозидазы предлагаемый продуцент образует богатую белком биомассу (до 35% от веса сухой биомассы).

П р и м е р 1. Штамм PenicMlium canescens AMT-85 поддерживали на агаризованной среде с раффинозой, %: раффиноза 3,0; NH-iNOs 0,2; КН2Р04 0.1; КС 0,1; МдЗОз 0,05; кукурузный экстракт 0,05; агар 2; исходное рН среды 6,0.

Глубинное культивирование гриба проводили на жидкой питательной среде следующего состава, %: соевая мука 3,0; N32HP04 12Н20 1,5; ( 0,2; KCI 0,05; MgS04 0,015; исходное рН 4,2.

Культивирование проводили в колбах емкостью 750 мл на термостатированной качалке, делающей 220 об/мин (уровень аэрации 1,4 т Оз/лфч) при 30°С в течение 72ч.

Объем питательной среды в колбах составлял 100 мл. Засев питательной среды производили 2%-ной суспензией конидий поверхностной культуры гриба, выращенной в пробирках на скошенном лактозном агаре в течение 12 дней при 28°С.

Биомассу отделяли фильтрованием и в фильтрате определяли активность а-галактозидазы, используя в качестве субстрата паранитрофенил- а -D-галактопирано- зид. Реакционную смесь, состоящую из 0,1 мл 5 мМ субстрата, 0,2 мл фосфатно-цитратно- го буфера (рН 4,2) и 0,1 мл раствора фермента (культуральной жидкости), инкубировали при 37°С в течение 10 мин, а затем добавляли 2 мл 1 М N32CO3 для прекращения реакции. Освободившийся п-нитрофенол определяли при 410 нм.

Стабильность уровня активности фермента, продуцируемого Penicillium canescens AMT-85, дана в табл. 1.

Зависимость активности а-галактозидазы от применяемой среды дана в табл. 2.

Активность биосинтезирующего штамма а-галактозидэзы равна 5-6,5 ед./мл.

Активность а -галактозидазы определяли и по гидролизу мелибиозы.

Активность а -галактозидазы в экстракте, определяемом по.гидролизу мели- биозы. составляет 90-100 ед. на 1 г сухой культуры.

Предлагаемый штамм дает возможность получить ксиланазу с активностью 3- 3.5ед./мл.

Предлагаемый фермент может быть применен в пищевой промышленности и медицине.

Штамм Penicilllum canescens AMT-85 - продуцент а-галактозидазы депонирован в Центральном музее промышленных микроорганизмов Института ВНИИгенетика под коллекционным номером ВКПМ-Р-417.

Формула изобретения

Штамм гриба Penicilllum canescens ВКПМ F-477-продуцент а-галактозидазы.

Таблица 1

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению нового продуцента фермента а -галактозидазы. Цель изобретения - выявление штамма продуцента а -галактозидазы, обладающего более высокой активностью. Изобретение позволяет получить а-галактозидазу в количестве 4-7 ед./мл культуральной жидкости. Из глубинной культуры предлагаемого продуцента выделенный ферментный препарат может быть применен в сахарной промышленности и медицине. 2 табл.

Таблица 2