Штамм гриба @ продуцент @ -галактозидазы Советский патент 1989 года по МПК C12N1/14 C12N9/38 

Изобретение относится к ферментной промышленности, в частности к получению нового штамма, продуцента фермента р-галактозидазы, используемой для гидролиза молочного сахара - .лактозы, и находит широкое применение в различных отраслях пищевой промьшшенности.

Цель изобретения - выявление штамма-продуцента -галактозидазы, обес- печивакядего ускорение процесса получения фермента и увеличение биосинтеза 3-галактозидазы.

Предлагаемый штамм Penicilliuta canescens ВКПК F-376 (ТК-85) получают путем облучения ультрафиолетовыми лучами в дозе 200 Дк/м конидии исходного штамма Penicillium

canescens Sopp 20171 и обладает указанными свойствами.

Морфологические признаки. Штамм атоксичен,. быстрорастущий, характеризуется умеренным спороношением на агаризованных;средах (намного меньшее, чем в исходной культуре, ха- рактеризукщейся, как правило, обиль ным спороношением).

Образование конидий начинается на два дня позже, чем в исходной культуре. №целий хорошо развит, септи- рованный. .S .

Конидиеносцы 450-460 мкм длиной и 3,0-3,5 мкм в диаметре отходят от войлочного мицелия, оболочка слабо шероховатая. Кисточки двухъярусные, растопыренные, состоят из веточек (метуль), несущих мутовки фиалид, ме

3150

тули 13-15 X 2,0-2,8 мкм, стеригмы (фиалиды) 7-8 х 2,5 мкм. Конидии 2,0-2,5 мкм в диаметре, шаровидные, образуются в цепочках,

Культуральные признаки, Штамм хорошо растет на искусственных средах ( сусло -агаре, картофельно-глю- козном агаре, картофельном агаре) и синтетических, агаризованных средах (среда Чапека, Сабуро, Ролена-Тома, агаризованной среде с лактозой),

На среде Чапека колонии бледнр- голубозвато-серого цвета с умеренным спороношением, с обратной стороны желтовато-соломенного цвета, на 12- 15 день приобретают от светло-, до темно-коричневого тона.

Линейный рост колоний на агаризованных средах по дням: среда Чапека: 5-й день 48 мм, 10-й день 70 мм, среда Ролена Тома: 5-й день 35 мм, 10-й день 60 мм, картофельно-глю- козная среда: 5-й день 40 мм, 10-й день 55 мм, среда Сабуро: 5 -й день 30 мм, 10-й день 50мм, агаризован- ная среда с лактозой: 5-й день 38 мм 10-й день 60 мм.

На отрубях растет хорошо. Отношение к углеродному питанию: усваивает лактозу, сахарозу, глюкозу, галакто- ру, мальтозу, фруктозу, арабинозу, крахмал, инулин, сорбит, маннитидр.

Отношение к азотному питанию. Хорошо усваивает нитратный азот, лучше аммонийный, из органических источников азота ассимилирует пептон, мочевину, кукурузный экстракт и др.

Отношение к кислороду, Облигатный аэроб.

Отношение к температуре, Мезофил, оптимальная температура роста 28 - ,

Отношение к кислотности среды.

Глубинное культивирование гриба проводят на жидкой питательной среде, следующего состава, мас,%: соевая

Растет в широких пределах рН 2,0-9,0, 45 - „ука 3,0} Na,HPO. П2Н,,0 . 1,5,

При выращивании PenicilUum сатт (NH4).SO.. оД; КС1 O.,05i I-IgSQ 0,015, nescens ТК-85 на комплексньк средах, вода остальное, исходное рН 4;2, содержащих соевую муку, активность 5-галактозидазы в культуральной жидкости достигает 55-60 ед/мл,.

Для размножения штамма применяют модифицированную среду Чапека с лактозой следующего состава, мас,%: лактоза - 3,0; 0,2 . 0,1; 1-IgSO -0,05; КС1 0,05,куку- рузньп экстракт 0,5; вода остальное, исходное рН 5,8-6,0,

Культивирование проводят в колбах емкостью 750 мл на термостатирован- 50 ной качалке, делающей 220 об/мин (уровень аэрации 1,4 г ) при в течение 72 ч.

Засев питательной среды проводят . 2%-ной суспензией конидий поверхностсг ной культуры гриба, выращенной в пробирках на скошенном лактозном агаре в течение 12 дней при ,

Питательной средой для ферментации служит среда следукяцего сос

тава, мас.%: соевая мука 3,0, , X 1,5; (№4)2,30 0,2; КС1 0,05, llgSO 0,015, вода остальное,

исходное рН 4,1-4,2,

Активность биосинтезируемой штаммом р-галактозидазы определяют по методу Киву и Lardy,

Кроме высокоактивной -галактози- дазы предлагаемьй продуцент образует богатую белком биомассу, не уступает . по активности известному штамму Е,со11, крбме активности/3-галакто- зидазы, равной 60 ед/мп (по лактозе),

и удельной акт)двностью 5,5 ед/мг белка, мутант Penicillium canescens ТК-85 в фильтрате культуры содержит . активности других гликозидаз: инвер- тазы 12-14 ед/мл, t(. -галактоз щазы

3-4 ед/мп, -глюкозидазы 1,5-2 ед/мл, К 1ждая из этих активностей является довольно высокой и указьшает на то, что мутант Р, canescens ТКт85 являет - ся активным продуцентом не только

р -галактозидазы, но и комплекса гликозидаз, что существенно расширяет спектр использования ферментов (оса- харивания большого количества субстратов, например, в безалкогольной

промьшшенности),

Предлагаемый мутант не является токсичным или патогенным, опыты по выращиванию и использованию проведены в полупромьшшенных масштабах.

Пример 1, Штамм Penic.il lium canescens ТК-85 поддерживают на агаризованной среде с лактозой, содержащей мас,%: лактоза 3,0 , О,, 0,1, КС1 0,1,-lIgS04j 0,05,Ky курузный экстракт 0,05, агар 2, вода остальное,- исходное рН среды 6,0,

Глубинное культивирование гриба проводят на жидкой питательной среде, следующего состава, мас,%: соевая

„ука 3,0} Na,HPO. П2Н,,0 . 1,5,

(NH4).SO.. оД; КС1 O.,05i I-IgSQ 0,015, вода остальное, исходное рН 4;2,

Культивирование проводят в колбах емкостью 750 мл на термостатирован- ной качалке, делающей 220 об/мин (уровень аэрации 1,4 г ) при в течение 72 ч.

Засев питательной среды проводят . 2%-ной суспензией конидий поверхностной культуры гриба, выращенной в пробирках на скошенном лактозном агаре в течение 12 дней при ,

Биомассу отделяют фильтрованием и в фильтрате определяют активность 5 -1509402

галактозидазы, исполь зуя в качестве Активность биосинтезируемой штам- субстрата ортонитрофенил- -В-галак- мом р)-галактозидазы равняется 60 ед/мл, топиранозид. Реакционную смесь, сое- что составляет 10000 ед/г препарата, тоящую из 0,8 мл фосфатно-цитратного с Таким образом, образуемый им.фер- буфера рН 4,2, содержащего 125 мМ мент обладает активностью 60 ед/мл. субстрата и 0,02 мл раствора фермен- Предлагаемьй фермент может быть при- та (культуральной жидкости), инку- . менен в пищевой промьшшенности и бируют при 30 С в течение 15 мин, медицине.

затем добавляют 1 мл 1 М для изобретения прекращения реакции. Освободившийся Штамм гриба Penicillium canescens. о-нитрофенол определяют при Л 420 нм. ВКПМ F-376 - продуцент -галактозййазы.

Изобретение относится к биотехнологии, частности к получению нового продуцента фермента β - галактозидазы. Цель изобретения - выявление штаммапродуцента β - галактозидазы, обеспечивающего ускорение процесса получения фермента и увеличение биосинтеза фермента. Изобретение позволяет получить β - галактозидазу в количестве 55-60 ед/мл культуральной жидкости. Из глубинной культуры предлагаемого продуцента выделенный ферментный препарат может быть применен в молочной и хлебопекарной промышленностях для улучшения качества готовой продукции, а также в медицине при непереносимости молочного сахара-лактозы.