Способ определения мочевины в крови Советский патент 1992 года по МПК G01N33/62 

ст

Ё

Использование: медицина, биология для количественного определения содержания мочевины в крови. Цель изобретения: повышение точности способа при длительном хранении проб. Сущность изобретения: к пробам крови добавляют предварительно 0,075%-ный водный раствор 9-фенантрилме- тилтрифенилфосфонийхлорида в соотношении проба: реактив 1:10, затем добавляют 5%-ный раствор трихлоруксусной кислоты, центрифугируют с последующим добавлением к надосадочной жидкости диацетилмо- нооксима 5,0 ммоль/л, тиосемикарбазида 0,9 ммоль/л, соли трехвалентного железа 25,0 мкмоль/л, серной к-ты 0.9 моль/л, затем инкубационную смесь нагревают 10 мин на кипящей водяной бане, охлаждают и колориметрируют в кювете с толщиной рабочего слоя 10 мм при 490-540 нм. 3 табл.

Изобретение относится к биологической химии и может быть использовано в биологии и медицине для отсроченного количественного определения содержания мочевины в тканях и биологических жидкостях. .

Известен способ количественного определения мочевины в биологических объектах. Недостаток способа - необходимость завершить анализ в день забора биологических проб, поэтому он может быть использован для отсроченного определения количества мочевины в биотогических пробах.

Цель изобретения - повышение точности способа при длительном хранении биологических проб за счет стабилизации в них мочевины, добавления к пробе водного раствора 9-фенантрилметилтрифенилфосфо- нийхлорида (ФТФ).

Способ осуществляют следующим образом.

В три пробирки вносят по 1 мл 0,075%- ного водного раствора ФТФ. Далее в опытную пробирку приливают 0,1 мл крови, в стандартную 0,1 мл стандартного раствора мочевины, в контрольную 0,1 мл дистиллированной воды. Пробирки закрывают пробками и хранят в холодильнике при 2-8°С. В последующие 60 дней аналогично подготовленные пробы накапливают в холодильнике. На 60-й или любой удобный для работника день, но не позже 60-го определяют количество мочевины во всех накопившихся пробах.

П р и м е р. В три пробирки вносят по 1 мл 0,075%-ного водного раствора ФТФ. Далее в опытную пробирку приливают 0.1 мл крови, в стандартную 0,1 мл стандартного раствора мочевины, в контрольную 0,1 мл. дистиллированной воды. Пробирки закрывают пробками и хранят в холодильнике при 2-8°С, В последующие 60 дней аналогично подготовленные пробы накапливают в холодильнике. На 60-й или любой удобный для работника день, но не позже 60-го определяют количество мочевины во всех накопившихся пробах, для чего к ним добавляют по 1 мл 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, центрифугируют, переносят по 1,5 мл центрифугата в химические пробирки, приливают по 2 мл 0,9 моль/л серной кислоты, по 2 мл раствора 5,0 ммоль/л диацетилмоно- оксима (содержащего соль трехвалентного железа 25,0 мкмоль/л и 0,9 ммоль/л тиосе- микарбозида), перемешивают содержимое, помещают на 10 мин в кипящую водяную баню, охлаждают до комнатной температуры и колориметрируют опытную и стандартную пробы против контроля в кюветах с толщиной рабочего слоя 10 мм при длине световой волны 490-540 нм. Расчет проводят по известной формуле.

Исследования показали, что ФТФ в концентрациях 0,02-0,3% обеспечивает сохранность мочевины в пробах сыворотки крови неизменной на протяжении 75 суток (табл. 1).

В табл. 2 представлены результаты содержания мочевины в сыворотке крови и крови, которые хранились на 1-60 суток после добавления к ним 0.075%-ного водного раствора ФТФ в сравнении с результатами содержания мочевины в аналогичных пробах, хранившихся без ФТФ. Как видно из этих данных, этот показатель значительно отклоняется от исходных величин, начиная с 10-го дня хранения.

Средняя относительная ошибка описанного способа определения мочевины,

Таблица

Зависимость получаемых показателей содержания мочевины в пробах сыворотки крови от продолжительности их хранения и концент- рации ФТФ (в таблице представлено среднее арифметическое из трех параллельных определений)

Использованная концентрация ФТФ, % 1 0,05 0,075 0,1 J 0,15 | 0,2 Ј 0,25 0,3

До прибавления раствора ФТФ

(т.е. по способу-прототипу) 4,72 - -

15 минут хранения 4,75 ,68 4.JO 4,72 4,69 4,75 4,75 4,70 4,72 4,70 4,73 4,74

5 суток хранения ЫГ 471 471 472 470 4,75 4,74 4J2 4,74 4,74 4,71 4,73

10 суток хранения 5л2 5Л§ 478 471 472 4,73 4,73 4,71 4,68 4,70 4,72

20 суток хранения 2,66. 1,§3 1.3 473 472 4,74 4,76 4,76 4,67 4,71 4,74 4,78

30 суток хранения L93 Ы 2Л 477 75 4,72 4,74 4,78 4,69 4,75 4,71 4,75

40 суток хранения проб 1,2.2 2,6$ 2.82 4,68 4,78 4.69 4,70 4,79 4,72 4,74 4,72

0

вычисленная из 200 определений исследуемого показателя (по 200 определений в крови и в сыворотке крови) в сроки, указанные в табл. 2. равнялась 4,63%.

В табл. 3 приведены результаты определения мочевины в сыворотке крови доноров, у которых наблюдались минимальные, средние и максимальные отклонения от величин, полученных по способу-прототипу в день забора крови, которые показывают, что ни одна из величин, полученных по описанному способу, не отличается от величин, полученных по способу-прототипу, более чем на 5%.

Формула изобретения Способ определения мочевины в крови, включающий добавление к пробе крови 5%ного раствора трихлоруксусной кислоты, центрифугирование с последующим добавлением к надосадочной жидкости диацетилмонооксима 5,0 ммоль/л, тиосе- микарбазида 0,9 ммоль/л. соли трехвалентного железа 25,0 мкмоль/л, серной кислоты 0,9 моль/л, затем инкубационную смесь нагревают в течение 10 мин на кипящей водяной бане, охлаждают и колориметрируют в кювете с толщиной рабочего слоя 10 мм

при 490-540 нм, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа за счет стабилизации мочевины, предварительно к пробе добавляют 0,075%-ный водный раствор 9-фенантрилметилтрифенилфосфонийхлорида в соотношении 1:10 проба крови:реактив.

517742626

Продолжение табл.1

---- -------------------------- -«---------------..---..----------..---------------------

Использованная концентрация ФТФ, I

О 1 0,01 | 0,015 | 0,02 | 0,025 Г 0,05 | 0,075То.1 Г 0,15 J0.2 I 0,25 Го.З

50 суток хранения проб

9-§. -.2Z- li.ll 4,76 4,67 4,75 ,704,74 4,76 4,78 4,71 4,6Э

60 суток хранения

9Л§ 9.92 012Z 4,76 4,70 it, 7) 4,734,70 4,70 4,70 Ч, 74 I,76

75 суток

0-9. 9a§ -.§. 4,74 470 4,75it,72 4,74 4,75 4,70 4,70

Примечание: f - вместо ФТФ к биологическим пробам приливали 1 мл дистиллированной воды и хранили их до 75.суток

f - подчеркнуты показатели проб, в которых содержание мочевины уменьшалось в процессе хранения

Таблица.

Показатели содержания мочевины в иН/л в сыворотке крови (п 10) и4крови (п 10) доноров, полученные по предлагаемому способу и способу-прототипу ()

Использованный спо-Сроки хранения биологических жидкостей в сутках

соб определения мо- 1т1г11 -г«.

....i....l.....5......L...7......L..°......1.„л°... u--3--I-is-.I........

Сыворотка крови

По предлагаемому 4v

способун-в 6,66iO,6 6,86iO,3li 6,37-0,30 б..зг 6,97М,25 6,,25 6,,31 6,80iO,3l 6,kS -Q,27 6,,19

$ отличия от показателей,полученных по способу-прототипу

(6.5U0.22 иМ/л)2,35,,22,67,12,55,1 . k,S0,3З.в 4

Сыворотка, хранившаяся без

т М4-т 6,,16 6,27iO,30 6,62iO,30 6,6liO,2S 5,01iO,29 (. 3,7ЭЮ,90 3,l8tO,75 сы«ороткв рваяожипкь

% отличия от показателей,полученных по способу-прототипу(6,,22 нм/л)2,33.72,31,523364251

Кроеь

По предлагаемому

способум ю 5,96tfl,21 5,,23 6,,22 5,,22 5,68-0,21 5,6310,17 5,,19 5,,20 5,,19 5,,22

% отличия от показателей, полученных по способу-прототипу (5,83«0,23 иН/я)2,23,46,31,92,6З,,35,21,70,8

Примечание:

+ - содержание мочевины е пробах уменьа-илось из-за прололхительного их хранения.

++ - содержание мочевины 8 сыворотке крови по способу-прототипу равнялось 6,5110,22 мМ/л и определялось в день забор

сыворотки у доноров +++ - содержание мочевины в цельной крови по способу-прототипу равнялось 5,83iO,23 иН/л и определялось в

день забора в крови у доноров .1111 - средняя величина % отличия 3,58%. I ц11 - средняя величина % отличия 3,55

п - количество доноров, в крови которых определялось содержание мочевины. М - средняя величина, полученная путем статистической обработки. ± m - средняя ошибка средней величиныТаблицаЗ

Показатели содержания мочевины (в нН/л) в сыворотке крови доноров, у которых иаблодапись минимальные средние и максимальные отклонения от величин, полученных по способу-прототипу в день забора крови (в таблице представлены результаты, выбранные из группы, состоящей н 10 доноров