Способ получения 2 @ -дезоксинуклеозид-5 @ -0-(1-тио)трифосфатов Советский патент 1992 года по МПК C07H19/20 

Изобретение относится к усовершенствованному способу получения 2-дезокси- нуклеозид-5 -0-(1-тио)трифосфатов общей формулы I

о о н и

0-Р-О-Р-О-Ро о о

очв

-Опр

он

где В-аденин-9-ил- или тимин-1-ил, и может быть использовано в генетической инженерии и молекулярной биологии.

Цель изобретения - увеличение выхода целевых продуктов и упрощение процесса, - достигается выявлением условий и параметров реакций: времени, реагентов, реакционной среды, присутствием дополнительных реагентов.

П р и м е р 1. 2-Дезоксиаденозин-5 -0- (1-тио)трифосфат (ATRe(S), тетралитиевая соль. Дезоксиаденозин 10 мг (40 мкмоль). высушенный при 110°С, 12 мм рт.ст. над PaOs в течение 8 ч, растворяют при перемешивании и нагревании до 110°С (1 мин) в 0,16 мл ТЭФ, охлаждают , прибавляют пиридин (6,6 мкл, 82 мкмоль), охлаждают до 0°С, прибавляют свежеперегнанную PSCIa (4,5 мкл, 45 мкмоль), встряхивают и выдерживают 10 мин при 0°С. Затем к реакционной смеси добавляют раствор пиро- фосфата три-н-бутиламмония (66 мг. 120 мкмоль) в безводном ацетонитриле (0.6 мл), содержащем три-н-бутиламин (22 мкл, 90 мкмоль), встряхивают, выдерживают раствор при температурел 250С в течение 10 мин, прибавляют 2 мл воды, выдерживают 45 мин и раствор наносят на колонку (0, см) с ДЭАЭ-сефадексом А-25 (НСО з). КоVIVJ

СП

4 О (Л

лонкуэлюируют водой (20 мл) и затем линейным градиентом 0,1-1,0 М МНЦНСОз (рН 8,5), 100 мл. Продукт элюируется при концентрации соли 0,70-0,75 М 560 о.е,260 (92%). После упаривания воды и удаления МНзНСОз в вакууме остаток растворяют в воде (5 мл),.титруют раствор 0,1 М 1 ОН до рН 8,5, пропускают через колонку (0,8-2 см. содержащую в нижней части смолу Chelex 100 (LI4) (1 мл), а в верхней - Дауэкс 50W- 2(Li, 1 мл), злюируют продукт водой (20 мл), раствор упаривают в вакууме до объема 0,1 мл и продукт осаждают 0,5%-ным раствором LICI04 в ацетоне (ОСЧ, 1,5 мл). Осадок центрифугируют, промывают ацетоном (2-1 мл), эфиром (1«1 мл) и высушивают в вакууме над PaOs. Получают 20 мг бесцветного порошка тетралитиевой соли . ЗН20. Продукт гомогенен при высокоэффективной хроматографии на Llchrosorb NH26 5 мкм в градиенте 0-0,3 М фосфат калия (рН 6,5) в 30%-ном водном ацетонитриле, дает два равных по площади пика Rp и Sp-диастере- оизомеров при обращенно-фазовой хроматографии на Nucleos 1 С18, 5 мкм в градиенте 0-40% водный метанол, 0,05 М LICI04, 0.02М, LlOAc (рН 5.0) УФ-спектр (Н20, рН 7, Specord UVVIS, ГДР): Я max (Б) 259 нм (15200), Я min (е) 230 нм (4700). 31Р- ЯМР-спектр (прибор BruKer HX-90, частота 36,43 МГц. внешний стандарт 85% НзР04, Д20/ЭДТА, рН 8.5, 30°С, м.д.): &, 43,30(д) и 42.80(д); ,71(ДД); Ј -5,92(д).

П р и м е р 2. 2 -Дезокситимидин-5 -0-{1-тио)-трифосфат#ГПЗс5), тетралитиевая соль. Дезокситимидин (9,6 мг, 40 мкмоль), после осушки растворяют в 0,08 мл ТЭФ (100°С, 0.5 мин), охлаждают , прибавляют пиридин (6,6 мкл, 83 мкмоль), охлаждают до 0°С, добавляют свежеперегнанную Р5С1з (4,5 Мкл, 45 мкмоль) и выдерживают при той же температуре 45 мин. Далее обработку, выделение и идентификацию продукта проводят, как описано в примере 1. Выход TTPxS 368 о.е.267 (96%). Осаждением (см. выше) получено 18 мг тетралитиевой соли.

Таким образом, выход по данному способу повышается более, чем в 2 раза при уменьшении (примерно четырехкратном) продолжительности процесса.

Формула изобретения Способ получения 2 -дезоксинуклеозид- б -0-(1-тио)трифосфатов общей формулы

О о S

О-Р-О-Р-О-Р-О-/° i | i V О о- о- он

где В-аденин-9-ил- или тимин-1-ил, путем обработки дезоксинуклеозидов тиохлоро- кисью фосфора в триэтилфосфате в присутствии основания при температуре 0-5°С с последующим добавлением раствора пиро- фосфата и гидролизом реакционной смеси, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта, и упрощения процесса, обработку дезоксинуклеозидов тиохлорокисью фосфора проводят в присутствии пиридина в течение 10-45 мин, пирофосфат добавляют в виде раствора его три-н-бутиламмониевой соли в ацето- нитриле и выдерживают 4-10 мин, а гидролиз реакционной смеси осуществляют водой в течение 15-50 мин.

Изобретение относится к химии нуклео- зидов, в частности к получению 2 -дезокси- рибонуклеозид-5-0-(1-тио)трифосфатов общей формулы Ое-Р(0)(Ое)-0-Р(0)(Ое)-0P(SXO 0-CH2-CH-0-CHB-CH2-CH 9H, где В-аденин-9-ил или тимин-1-ил, используемых в генетической инженерии и молекулярной биологии. Цель - повышение выхода и упрощение процесса. Синтез ведут из 2 -де- зоксирибонуклеозидов последовательной обработкой их тиохлорокисью фосфора в триэтилфосфате в присутствии пиридина при 0-5°С 10-45 мин, раствором трибути- ламмония тетрафосфата в ацетонитриле (4- 10 мин) и водой (15-20 мин) с последующим выделением целевых веществ на ионнооб- менных колонках. Выход, %; брутто-ф-ла: а) 92; CioHi3Ll4N2Oi3 РзЗ: б) 92, CgHrcLMNsOnPaS. Способ позволяет повысить выход, более чем вдвое, при уменьшении времени синтеза и расхода реагентов. Ј