Способ получения пуриновых дезоксинуклеозид-5 - трифосфатов Советский патент 1979 года по МПК C07H19/20 A61K31/7076 C12P19/32 

Изобретение о,тносится к усовершенствованному способу получения пуриновых дезоксинуклеозид-5-трифосфатов, которые используются в би химических исследованиях, например, для получения синтетических аналогов дезоксинуклеиновых кислот. Известен способ получения дезоксинуклеозид-5-трифосфатов, заключающ 1йся в фосфорилировании соответствукицих дезоксинуклеозид-5-монофосфатов в присутствии ионов вцетилфосфата, аденозиндифосфата, цистина, очищенного ферментного пре парата (очищенной ацетокиназы), выделенного из Esciierictiia coEi ( E.coCi) и буфера трис- НСб при рН 7,5. Выход дезоксинуклеозид-5-трифосфатов 60-75% в расчете на исходный дезоксинуклеозид-5-монофосфат 1. Недостатками такого способа явля ются использование высокоочищенного ферментного препарата (очистка которого требует многократного фракционирования выделенного из клеток Ё.СО&1 фермента), что осложняет про цесс, и относительно невысокий выхо целевого продукта (60-75%) . Целью изобретения является упрощение процесса и повышение выхода целевого продукта. Цель достигается использованием в .качестве ферментного препарата цельного, нефракционированного экстракта из E-CoEi MRE 600. Это позволяет избежать трудоемких стадий фракционирования фермента и повысить выход целевого продукта -до 80-82%. Способ получения пуриновых дезоксинуклеозид-5 -трифосфатов согласно изобретению заключается в том, что соответствующие дезоксинуклеозид-5-монофосфаты фосфорилируют в присутствии ионов Mg- t ацетилфосфата, в трис-НС€ буфете при рН 7,5, используя цельный нефракционированный экстракт E.coei MRE 600. Выход целевого продукта 80-82%. Пример . Приготовление ферментного препарата. 50 г клеток E-coEi 600 суспендируют в 150 Мл 0,05 М трисНС буфера (рН 7,5) и разрушают ультразвуком на ультразвуковом генераторе с частотой 18±0,4 кгц в течение 15 мин. Суспензию центрифугируют в течение 20 мин при 12000 , .надосадочную жидкость собирают и используют в качестве ферментного п парата. Концентрация белка в нем 14 мг/мл. Ферментный препарат хранят в замороженном виде при - 10ОС. Синтез дезоксиаденозин-5-трифо фата. 1500 мл реакционной смеси состава, мкмоль/мл: дезоксИаденозин-5-м нофосфат 10; ацетилфосфат 30, трис -ЙСе буфер (pri 7,5) 40; ацетат магни 15; ферментный препарат 0,25 мг/мл термостатируют при 37°С в течение 2 ч. Реакцию останавливают прогреванием реакционной смеси в кипящей водяной бане в течение 2-3 мин, оа затем быстро охлаждают. Образовавшийся осадок белка удаляют центрифугированием и надосадочную жидкость хроматографируют на ионообменной Дауэкс 1x2 в ррадиент LI се при рН 2,3, Фракции элюата, содержащие дезоксиаденозин-5-трифосфат, объединяют и нейтрализуют гидратом окиси лития до рЯ 7,0. Де оксиаяенозин-5-трифосфат осалодают в виде литиевой, соли охлажденно смесью этанол-ацетон (10:1)-. Осадо собирают центрифугированием и лиоф но высушивают. Выход дезоксиаденозин-5 -трифосфата 82% в расчете на ИСХОДНЫЙ дезоксиаденозин-5-монофо фат. Содержание основного вещества в продукте 94%, спектральные отнош ния, рН 2: 0250/02.60 0,82, 0280/0260 0,22. 64 И р и м е р 2. Синтез дезоксигуанозин-5-трифосфата проводят в условиях примера 1. Готовый продукт выделяют, как в примере 1,. Ьыход дезоксигуанозин-5-трифосфата 80% в расчете на исходный дезоксигуанозин-5-монофосфат. СЬдержание основного вещества в продукте 99%. Спектральные отношения, рЛ 2: 0,50/0,,04; - 0,69 О. Предлагаемый способ получения пуриновых дезоксинуклеозид-5-трифосфатов прост в технологическом исполнении и может быть применен в промышленном масштабе. Формула изобретения Способ получения пуриновых дезоксинуклеозид-5 -трифосфатов путем фосфорилирования соответствующих дезоксинуклеозид-5 -монофосфатов в присутствии ионов Mg, ацетилфосфата, ферментного препарата, выделенного из Esciierictiia coEi, и буфера трисйсе при рН 7,5, отличающийс я тем, что, с целью упрощения процесса и повышения выхода целевого продукта, в качестве ферментного препарата используют цельный нефракцирнированный экстракт из Esctierictiioi coEi /ARE 600. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе l.Lebman 3.R.,Bessman fA.3-,Sims E.S-, Kornterg А-Entvma-tic Ssnlhesis o D&ox ribonucEeic Acid-3-BioE-C1ieiii- 233, №.1, p. 163- (1958) ;