Штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI, предназначенный для получения 2Ъ-дезоксиаденозина Советский патент 1992 года по МПК C12P19/40 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к производству биологически активных соединений.

Способы получения 2 -дезоксиаденози- на основываются на ферментативном гидролизе его природного источника - ДНК до смеси четырех 2 -де.зоксинуклеозидов с последующим выделением целевого продукта тем или иным хроматогрэфическим методом. Общий недостаток этих способов заключается в относительно низком выходе 2 -дезоксиаденозина. Это обусловлено тем. что он является лишь одним из четырех нук- леозидных компонентов ДНК. Например, согласно способа 1. предусматривающего

гидролиз ДНК ферментным препаратом, полученным из Actlnomyces coellcolor, в гид- ролизате методом жидкостной хроматогра- фии обнаруживается 2 -дезоксиаденозин в количестве 15,5% от массы исходной ДНК.

При гидролизе ДНК сырой биомассой гриба Splcaria vlolacea БМ-205 2 в гидроли- зате обнаруживают 20% 2 -дезоксиаденози- на по массе от взятой в реакцию ДНК.

Известен способ получения 2 -дезокси- аденозина, позволяющий резко (до 54,9%) повысить выход целевого продукта из ДНК. Он заключается в применении штамма бактерий Erwinla herblcola ЦМПМ В-3275 3. клетки которого при инкубации их с гидро- лизатом ДНК и аденином при 55-60°С и рН

VJ

О

ел

OJ

4 VI

6,75-7,25 трансформируют нуклеозиды ДНК - 2 - дезоксигуанозин, 21 - дезоксици- тидин и 2 - деэокситимидин в 2 -дезоксиа- денозин, что обеспечивает более полную утилизацию взятой в реакцию ДНК и, таким образом, более высокий выход целевого продукта.

Недостатком известного штамма Erw. herblcola ЦМПМ В-3275 является сравнительно низкая активность его клеток в реакции синтеза 2 -дезоксиаденозина из аденина и гидролиэата ДНК, составляющая 0,4 мкмоль/мин/мг клеток. Это приводит к затрате 3,63 г клеток на получение 1 г целевого продукта.

Целью изобретения является повышение активности штамма.

Штамм Е. coli 2Д/1А получен из музейного тиминзависимого штамма Е. coll W3110 путем отбора наиболее активных вариантов при последовательном выращивании на агаризованной среде Адамса с тимином (1 мкг/мл), затем с тиминарабино- зидом (5 мкг/мл) в качестве источника тими- на и на среде, содержащей тимин (1 мкг/мл) и инозин (1 мг/мл) в качестве единственного источника углерода.

Штамм Е. coll БМТ-2Д/1А депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов под коллекционным номером ВКМ CR- 319Д и характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

Под микроскопом клетки имеют вид лрямых палочек с закругленными концами (1.1-1,5)х(2.0-6,0)мкм. Встречаются отдельно или парами. Спор и капсул не образуют, Клетки обладают подвижностью. По типу движения перитрихи. Грамотрицательные.

В бульоне Хоттингера к 24 ч (37°С) рост выражен в виде легкого помутнения. На дне пробирок образуется комковатый осадок, который полностью взмучивается при встряхивании (S-форма).

На мясс-пептонном агаре и агаризованной среде Адамса (37°С, 3 сут) колонии гладкие, слабо выпуклые, легко сливающиеся. Консистенция вязкая. Цвет колоний сероватый. Поверхность блестящая, рельеф однородный. Края колоний слегка волнистые.

На агаризованной дифференциальной среде Эндо штамм растет в виде полупрозрачных колоний без изменения цвета среды.

Диапазон температуры роста 7-40 С. Оптимальная температура 36-37°С.

Диапазон рН роста 5,5-8.5. Оптимум роста наблюдается при рН среды 7.0-7.5.

Физиолого-биохимические признаки.

Факультативный анаэроб, В процессе роста сбраживает до кислоты с незначительным выделением газа глюкозу, арабинозу, трегалозу, мальтозу, маннит, глицерин. Не усваивает сахарозу, лактозу, рафинозу, сорбит, дульцит.

В качестве единственного источника углерода может использовать ацетат, но не 0 цитрат и инозит.

Желатину не разжижает.

Крахмал не гидролизует.

Молоко не свертывает.

Гидролизует РНК.

5 Гемолитическими свойствами не обладает. Не токсичен и не патогенен для теплокровных животных.

Усваивает аммонийный и нитратный азот. Наиболее активный рост биомассы 0 обеспечивают органические источники азота (пептон, дрожжевой и кукурузный экстракты, ферментализат БВК).

Продуцирует индол и каталаэу.

Не образует уреазу и оксидазу. 5 Содержание Г + Ц в составе ДНК 50,3 ±0.5 моль.% (определено оптическим методом).

Штамм сохраняет жизнеспособность не менее года при хранении в холодильнике 0 (+4°С) на полноценной агаризованной среде (МПА. среда Хоттингера) подслоем вазелинового масла, а также в лиофильно-высу- шенном состоянии.

Интактные клетки Е.соП БМТ-2Д/1Аоб- 5 л а да ют способностью трансгликозилиро- вать аденин до 2 -дезоксиаденозина с использованием в качестве доноров углеводного фрагмента 2 -дезоксинуклеозиды ДНК с эффективностью 1,2 мкмоль 2 -дезок- 0 сиаденозина/мин/мг клеток (в расчете на сухую массу).

Активность клеток измеряют путем прямого определения количества 2 -дезоксиа- денозина, образующегося при инкубации 5 сырой биомассы клеток со смесью аденина с гидролизатом ДНК. С этой целью реакционную смесь (1,0 мл), содержащую 13,5 мг аденина, 0,37 мл гидролизата ДНК и 1 мг клеток, инкубируют при 60°С в течение 10 0 мин. После инкубации реакционную смесь центрифигируют (8000 д. 10 мин) и надоса- дочную жидкость хроматографируют на тонкослойной пластинке SHufol-UV254 в охлажденной (+4°С) воде. Целевой продукт 5 обнаруживают в УФ-свете, идентифицируя сравнением с положением образца-свидетеля, и элюируют 0,05 М К-фосфатным буфером (рН 7.0). Оптическую плотность элюата измеряют на спектрофотометре. Концентрацию 2 -деэоксиаденозина рассчитывают,

используя коэффициент молярной экстин- ции при длине волны 260 нм. равный 14380.

Эффективность штамма E.coll БМТ- 2Д/1А в сравнении с другими штаммами микроорганизмов представлена в таблице.

Сравнительная оценка эффективности наиболее активных из 120 проверенных штаммов микроорганизмов представлена в таблице.

Из данных таблицы следует, что эффек- тивность клеток E.coll БМТ-2Д/1А в несколько раз выше любого из проверенных штаммов микроорганизмов.

Использование штамма E.coll БМТ- 2Д/1А иллюстрируется следующими приме- рами.

П р и м е р 1. Культуру штамма E.coli БМТ-2Д/1А вносят петлей с косяка в колбу емкостью 250 мл, содержащую 50 мл питательной среды (МПБ с 0,5%-ным дрожже- вым экстрактом), и культивируют на биологической качалке (180 об/мин) в течение 20 ч при 37°С. После осаждения клеток центрифугированием (5000 д,10 мин) получают 0,5 г сырых клеток (0,1 г в расчете на сухую массу) с активностью 1,1 мкмоль/мин/мг сухой биомассы.

П р и м е р 2. Клетки E.coll БМТ-2Д/1А, выросшие в 2-х 250 мл колбах, засевают в лабораторный ферментер АК-3 емкостью 3 л, содержащий 2 л питательной среды. Ферментацию ведут 12 ч при 37°С с аэрацией 0,8 л/мин на 1 л среды.

После окончания культивирования клетки собирают центрифугированием, получая 20 г сырых клеток (4 г в расчете на сухую массу) с активностью 1,2 мкмоль2 -дезокси- аденозина/мин/мг сухой биомассы.

Для приготовления гидролизата ДНК к 0,8 г ДНК молок лососевых рыб в 25 мл 0,05 М натрий-ацетатного буфера (рН 5,0) прибавляют 0,15 мл 0,25 М хлорида магния, 1,5 мл этанола и сырую биомассу Splcaria vlolacea БМ-205 в количестве 0,5 г (в расчете на сухую массу). Смесь доводят водой до 30 мл и инкубируют 30 ч при 60°С, После фильтрации получают 30 мл гидролизата, содержащего 2 -дезоксизденоэин. 2 -дезоксити мидин, 2 -дезоксигуанозин и 2 -дезоксици- тидин, в концентрациях, соответственно. 22,9 мМ, 24,2 мМ, 15,2 мМ и 17,5 мМ.

Смесь общим объемом 80 мл. содержащую 1,1 г аденина, полученный выше гидро- лизат ДНК, 0,65 г клеток E.coll БМТ-2Д/1А (в расчете на сухую массу), инкубируют 1,5 ч при 60°С. После удаления клеток центрифугированием (8000 g , 10 мин) супернатант кипятят 5 мин и наносят на колонку (100 мл) со смолой АВ-17-2М в ОН-форме. Колонку промывают водой. Фракции, содержащие 2 -дезоксиаденозин (0,6 л), собирают, упаривают до 25 мл и продукт кристаллизуют на холоду. Получают 0,49 г кристаллического 2 -дезоксиаденозина. Выход целевого продукта в расчете на исходную ДНК составляет 61,2 мас.%.

При хроматографировании на тонкослойных пластинках Sllufol-UV254 в системе растворителей хлороформ:этанол (4:1) и n-бутанол: 25%-ный водный аммиак (7:2) подвижность целевого продукта совпадает с Rf заведомо известного препарата 2 -дезок- сиаденозина.

Т.пл. целевого продукта 192-193°С.

Элементный анализ для СюЖзМвОз, .2.

Найдено, %: С 47,92; Н 5,19; N 27,60.

Вычислено, %: С 47.81; Н 5,18; N 27,89.

Использование штамма обеспечивает по сравнению с известным штаммом-прототипом следующие преимущества:

повышение активности биокатализатора в реакции синтеза 2 -дезоксиаденозина из гидролизата ДНК и аденина с 0,4 до 1,2 мкмоль/мин/мг;

снижение расхода клеток на получение 1 г 2 -дезоксиаденозина с 3,63 до 1.3 г;

повышение выхода целевого продукта с 54,9 до 61,2 мас.% от исходной ДНК.

Формула изобретения

Штамм бактерий Escherlchla coll BKM СР-319Д, предназначенный для получения 2 -дезоксиаденозина.

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к производству биологически активных соединений. Целью изобретения является повышение активности штамма. Штамм Escherlchla coll получен из музейного ти- минзависимого штамма путем отбора наиболее активных вариантов при последовательном выращивании на агари- зованной среде Адамса с тимином (1 мкг/мл), затем с тиминарабинозидом (5 мкг/мл) в качестве источника тимина и на среде, содержащей тимин (1 мкг/мл) и инозин (1 мг/мл) в качестве единственного источника углерода. Штамм E.coll БМТ-2Д/1А депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов под коллекционным номером В КМ СВ-319Д и характеризуется тем. что его покоящиеся клетки способны осуществлять трансформацию аденина в 2 -деэок- сиаденоэин, используя в качестве доноров углеводной части молекулы целевого продукта 2 -дезоксинуклеозиды, образующиеся при гидролизе ДНК. Активность клеток при 60°С и рН 7,0 составляет 1.2 мкмоль продукта (мин) мг клеток (в расчете на сухую массу). 1 табл. ё