ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ПЛОТНАЯ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА Российский патент 2007 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 

Изобретение относится к микробиологии, именно к получению питательных сред, которые создают оптимальные условия для выделения и культивирования холерного вибриона.

При бактериологическом исследовании на холеру используют питательную среду, включающую, г/л: агар-агар 20,0; гидролизат говяжьего мяса, содержащий аминного азота, 0-12%, натрий хлористый 5,0; 20% гидроокись натрия 0,002; дистиллированная вода до 1 л (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования Биргер М.О., 1972, с.53.)

Недостатком данной среды является ее дороговизна.

Наиболее близкой к предлагаемой питательной среде является среда для культивирования холерного вибриона, содержащая, г/л: панкреатический гидролизат казеина 4,0; панкреатический гидролизад кормовых дрожжей 4,0, в качестве питательной основы - натрий хлористый 5,0; натрий фосфорнокислый двузамещенный 0,4; натрий пиросернистокислый (метабисульфит) 0,5; агар 14,0 и дистиллированную воду до литра (Справочник по микробиологическим питательным средам. Под ред. Меджидова М.М. Махачкала, 1989, с.66.)

Недостатком данной среды является ее высокая себестоимость, сложность приготовления.

Целью изобретения является получение качественной, дешевой питательной среды для культивирования холерного вибриона.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что питательная среда содержит питательную основу - ферментативный гидролизат соевых бобов и стимулирующую добавку - натрий сернистокислый при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

Агар микробиологический11,0-13-0Ферментативный гидролизат соевых бобов60,0-160,0Натрий хлористый4,0-6,0Натрий фосфорнокислый 2-замещенный3,0-5,0Натрий сернистокислый0,3-0-5Дистиллированная водаостальное

В качестве исходного сырья используют сою, плоды которой - бобы содержат в среднем 40% белка, кроме того, соя богата микроэлементами и витаминами. Как известно (Y.P.Yupta, 1987), соевые белки характеризуются повышенным содержанием глутаминовой и аспарагиновой кислот, поставляющих макроэргические связи. Соевые белки содержат также большое количество таких незаменимых аминокислот, как лизин, лейцин, аргинин. Имеются также сведения о способности лейцина, как аминокислоты с разветвленной белковой цепью, инициировать синтез белка (Е.И.Чазов, X.С.Морган (США), 1989).

Приготовление питательной основы для выращивания микроорганизмов заключается в следующем. Плоды сои - бобы в количестве 0,5 кг пятикратно вымачивают в 5 л горячей воды в течение 1 суток, причем последний настой с бобами кипятят в течение 40 мин. Затем настой сливают в 10 л баллон, охлаждают, бобы измельчают мясорубкой и помещают в настой. Добавляют поджелудочную железу КРС из расчета 20,0 на 1 л, устанавливают рН до 8,2 20% раствором натрия гидроокиси в количестве 3 мл, добавляют 1% хлороформа. Гидролиз ведут в термокамере при температуре 37°С в течение 3 сут. Первые 2 ч смесь перемешивают через каждые 15 мин, по 5 в последующем смесь перемешивают через каждые 6 ч. Ежедневно измеряют уровень аминного азота, который на 3 сутки составил 0,6±0,05%.

Питательную среду на основе соевого ферментативного гидролизата для выращивания микроорганизмов готовят следящим образом. Агар микробиологический 12,0; ферментативный гидролизат из соевых бобов, разбавленный дистиллированной водой до показания аминного азота 0,08%, 110 мл, натрий хлористый 5,0; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 4,0; дистиллированная вода до 1 литра.

Среду кипятят до полного растворения ингредиентов, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, затем устанавливают рН 7,8±0,1 с помощью 20% раствора натрия гидроокиси, добавляют стимулятор: натрий сернистокислый в концентрации 0,4 г/л. Готовую среду разливают в 0,5 л бутылки по 400,0±10,0 мл и стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм. 30 мин. Согласно методическим указаниям по определению качества питательных сред для выращивания холерного вибриона (Инструкция по бактериологическому контролю диагностических питательных сред для холерного вибриона) готовят культуру авирулентного штамма НАГ - вибрион Р-9741. Для чего культуру, хранящуюся на полужидком агаре, высевают в 1% пептонную воду или бульон Мартена (рН 7,6-7,8). Через 18-20 ч роста с агара отбирают гладкие колонии HAT вибриона Р-9741, пересевают их на агаровые пластинки (2-пассаж). Культуру выращивают 3-6 ч при 37°С, после чего используют для контроля. Из суточной культуры готовят взвесь м.т., равной 5 ед по оптическому стандарту мутности по ГИСК им. Л.А.Тарасевича. Затем серийными десятикратными разведениями в физиологическом растворе в объеме 4,5 мл доводят до содержания в 1 мл 1000 и 100 м.к. Из данных разведений взвеси культур высевают по 0,1 мл стерильной бактериологической пипеткой по 3 чашки Петри опытной и контрольной среды. В качестве последней используют заранее проверенный высококачественный питательный щелочной агар. Выращивание производят при 37°С. Питательная среда плотная считается пригодной в том случае, если при посеве 100 и 10 м.к. тест-штамма через 12 ч выращивания вырастают соответственно не менее 30 и 1 колонии диаметром 1 мм на всех чашках.

Пример 1. Тест-штамм выращивали на питательной среде, содержащей, г/л: агар микробиологический 11,0; ферментативный гидродизат сои (бобы) 60,0; натрий хлористый 4,0; натрий фосфорнокислый 2-зэмещенный 3,0; натрий сернистокислый 0,3; дистиллированная вода до 1 л. При таком соотношении ингредиентов количество колоний, выросших на плотных пластинках агара, для холерного вибриона при посевной дозе 100 и 10 м.к. составило соответственно 29 и 1 колонии диаметром 1,0 мм.

Пример 2. Тест-штамм выращивали на питательной среде, содержащей, г/л: агар микробиологический 12,0; ферментативный гадролизат сои (бобы) - 110,0; натрий хлористый 5,0; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 4,0; натрий сернистокислый 0,4; дистиллированная вода до 1 л. При таком соотношении ингредиентов количество колоний, выросших на плотных пластинках агара, для холерного вибриона при посевной дозе 100 и 10 м.к. составило соответственно 45 и 4 колонии диаметром 1,5 мм.

Пример 3. Тест-штамм выращивали на питательной среде, содержащей, г/л: агар микробиологический 13,0; ферментативный гидролизат сои (бобы) 160,0; натрий хлористый 6,0; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 5,0; натрий сернистокислый 0,5; дистиллированная вода до 1 л. При таком соотношении ингредиентов количество колоний, выросших на плотных пластинах агара, для холерного вибриона при посевной дозе 100 и 10 м.к. составило соответственно 31 и 1 колонии диаметром 1,0 мм.

Таким образом, заявленная питательная среда плотная для культивирования холерного вибриона (пример 2), приготовленная на основе ферментативного гидролизата сои (бобы), может применяться для культивирования холерного вибриона как экономически выгодная.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при получении питательных сред для выделения и культивирования холерного вибриона. Питательная среда содержит агар микробиологический, ферментативный гидролизат бобов сои с содержанием аминного азота 0,08%, натрий хлористый, натрий фосфорнокислый двухзамещенный, натрий сернистокислый, дистиллированную воду. Изобретение позволяет получить качественную и дешевую питательную среду для культивирования холерного вибриона.

Питательная среда, плотная для культивирования холерного вибриона, содержащая питательную основу, натрий хлористый, натрий фосфорнокислый двузамещенный, агар микробиологический и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит в качестве стимулирующей добавки натрий сернистокислый, а в качестве питательной основы - ферментативный гидролизат бобов сои с содержанием аминного азота 0,08% при следующем соотношении компонентов, г/л:

агар микробиологический 11,0-13,0ферментативный гидролизат бобов сои с содержанием аминного азота 0,08%60,0-160,0натрий хлористый 4,0-6,0натрий фосфорнокислый двузамещенный 3,0-5,0натрий сернистокислый 0,3-0,5дистиллированная вода остальное