Способ определения суммарного содержания фибринмономеров и продуктов деградации фибрина в плазме крови Советский патент 1992 года по МПК C12Q1/56 G01N33/68 

Способ относится к биохимии, точнее, к способам исследования активности или содержания компонентов свертывания крови и продуктов их превращения в биологических жидкостях.

Известен способ обнаружения фибрин- мономеров, основанный на том, что при их наличии в плазме после добавления к ней 50% этанола появляется желеобразная масса (В.Г.Лычев Анализ и методика распознавания основных нарушений гемостаза и условий формирования геморрагического синдрома при лейкозах Дисс. на соиск, ученой степени канд. мед. наук. Барнаул, 1975). Желатинизация плазмы рассматривается как признак наличия в ней фибринмономе- ров,

Согласно описанному способу, кровь стабилизируют охлажденным раствором цитрата натрия, содержащим е-аминокап- роновую кислоту (0,1 М), отделяют плазму центрифугированием без осаждения тромбоцитов, к 0,4 мл богатой тромбоцитами плазмы добавляют 0,15 мл 50% этанола,

встряхивают пробирку при комнатной температуре или на холоде и через 10 мин учитывают результат. Появление желеобразного сгустка рассматривается как свидетельство присутствия в плазме фибринмономеров, если сгусток появляется не позже 10-й минуты. В части случаев при добавлении к плазме 50% этанола образуется не гель, а крупнозернистые частицы, что оценивают либо как слабоположительную реакцию, либо как отрицательную.

Существует способ выявления фибринмономеров, дополняющий вышеописанный - протаминсульфатный тест (Lipinskl В., Worowski К. Thromb. Diath. Haemorrh, 1968. v. 20, N 12, p. 44): в цитратной плазме, обедненной тромбоцитами, добавляют 0,1 мл 1% раствора протамина сульфата, встряхивают, через 10 и 30 мин определяют, образовался ли в плазме сгусток или гель, что рассматривается как положительный результат,

СП

с

VI VI о о

Ч)

со

Недостатки метода: 1) субъективность в оценке результатов, т.к. появление хлопьев, зернистости и мути не принимается во внимание, а учитывается только крупный сгусток; 2) возможность ложноположительных результатов.

В связи с этим, протаминсульфатный тест используется только в совокупности с этаноловым тестом. В итоге, оба указанных метода, используемые порознь или одновременно, отличаются субъективизмом в оценке результатов и не позволяют оценить количество продуктов.

Существует и количественный метод определения суммы фибринмономеров и продуктов деградации фибрина (Л.П.Цывки- на и И.Л.Маркина В кн.: Актуальные вопросы гематологии. - Томск, 1976, - В. 1. - С. 47-48) путем установления количества фибриногена, осаждаемого ристомицином. Этот метод по технической сущности и достигаемому результату принят нами за прототип. Суть его заключается в том, что определяется разница в содержании фибриногена в плазме до и после обработки ее ристомицином: к 0,1 мл бедной тромбоцитами плазмы добавляют 0,1 мл раствора ристомицина (8 мг/мл), возникший сгусток удаляют, а в плазме затем определяют содержание фибриногена, осаждая его сульфитом натрия или сульфатом аммония, с помощью нефелометрии. Предварительно определяют содержание фибриногена в исходной плазме. Разница в содержании фибриногена до и после осаждения фибринмономеров и продуктов деградации фибрина характеризует суммарное количество фибрин- мономеров и продуктов деградации фибрина.

К недостаткам метода относится:

1.Неспецифичность, обусловленная тем, что в плазму добавляют большое количество ристомицина, которое осаждает не только исследуемые продукты, но и фибриноген, а также тем, что определение количества исследуемых продуктов проводят косвенно, а именно - по разнице между содержанием фибриногена до и после добавления ристомицина.

2.Трудоемкость и относительно большая продолжительность анализа, обусловленная: а) необходимостью определять фибриноген два раза; б) использованием для определений способа, включающего осаждение фибриногена и нефелометриче- ское его определение.

Цель изобретения - повышение специфичности, сокращение продолжительности и снижение трудоемкости определения.

Поставленная цель достигается в заявляемом способе путем добавления к

плазме ристомицина в оптимальном количестве, т.е. в таком, которое осаждает только исследуемые продукты и не осаждает других белков, в частности, фибриногена. Это обеспечивается добавлением ристомицина в количестве, создающем его конечную концентрацию в плазме, близкую к 0,5 мг/мл. Использование экспериментально обоснованного количества ристомицина обеспечивает повышение специфичности

способа, т.к. этим путем достигается избирательное осаждение растворимых комплексов мономерного фибрина и продуктов деградации фибрина.

Сокращение продолжительности и

снижение трудоемкости достигается тем, что отделившийся после добавления ристомицина осадок растворяют в 1 М едком натрии и непосредственно определяют оптическую плотность раствора, которая позволяет рассчитать суммарное содержание фибринмономеров и продуктов деградации фибрина.

Положительный эффект предлагаемого способа по сравнению с прототипом заключается:

1.В повышении специфичности, достигаемой: а) тем, что добавление к плазме экспериментально обоснованного количе- ства ристомицина избирательно и специфично осаждает фибриномономеры и продукты деградации фибрина, не вызывая в отличие от способа-прототипа со- осаждения фибриногена; б) тем, что в предлагаемом способе путем спектрофотометрии проводится определение непосредственно исследуемых продуктов, в то время как в способе-прототипе об их содержании судят по степени убыли фибриногена после добавления ристомицина.

2.В сокращении продолжительности и снижении трудоемкости, что достигается отказом от двукратного определения фибриногена в исследуемой плазме с помощью

нефелометрии, используемых в способе- прототипе, и проведении прямой спектро- фотометрии раствора исследуемых продуктов.

Способ осуществляется следующим образом:

1. 2 мл венозной крови, стабилизированной 3,8% раствором цитрата натрия (1:9), помещают в коническую пробирку и центрифугируют 15 мин с ускорением 375 д.

2.Отделяют 0,5 мл плазмы в сухую пробирку и цинтрифугируют 20 мин с ускорением 1500 д, плазму переносят в сухую пробирку.

3.К плазме добавляют 0,1 мл раствора ристомицина (2,5 мг/мл), экспонируют 5 мин при комнатной температуре.

4.Смесь плазмы с ристомицином центрифугируют 5 мин с ускорением 1500 д.

5.Недостаток удаляют и добавляют в пробирку 0,5 мл 0,14 М раствора хлорида натрия, суспендируют осадок и центрифугируют 5 мин с ускорением 1 500 д.

6.Надосадок удаляют и повторяют промывание физиологическим раствором 2-й раз, после чего к осадку в пробирке добавляют 3 мл 1 М раствора едкого натра, помещают в пробирку на 3-5 мин на кипящую водяную баню - происходит растворение осадка.

После охлаждения раствор помещают в кварцевую кювету с рабочей длиной 10 мм . и при 280 нм определяют оптическую плотность против 1 М едкого натра.

Расчет производится по формуле:

С

А280 П Ь 10

15,1

где С - концентрация фибринмономеров и продуктов деградации фибрина в г/л плазмы;

А280 оптическая плотность исследуемого раствора при 280 нм;

п - коэффициент пересчета на 1 мл плазмы;

b - коэффициент пересчета с учетом разведения осадка едким натром;

10 - коэффициент перехода от концентрации в % к г/л;

15,1 - оптическая плотность 1 % раствора фибриногена.

Существенные отличительные признаки заявляемого решения.

1.Добавление к исследуемой плазме ристомицина в количестве 0,5 мг на 1 Мл в течение 5 мин обеспечивает выпадение фибринмономеров и продуктов деградации фибрина. Строго заданная концентрация ристомицина обеспечивает специфичность способа, т.е. осаждение только исследуемых продуктов.

2.Определение фибринмономеров и продуктов деградации фибрина позволяет оценить их суммарное количество в одной пробе, что наряду с использованием прямой спектрофотометрии снижает трудоемкость и продолжительность анализа.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

а) Кровь у здоровых доноров взяли в шприц со стабилизирующим раствором (3,8% р-р цитрата натрия) в соотношении 1:9. Пробы поместили в центрифужную пробирку по 2 мл каждая, центрифугировали с ускорением 375 g в течение 15 мин;

б 0,5 плазмы из каждой пробирки перенесли в сухие пробирки и повторили центрифугирование (1 500 д, 20 мин), затем плазму вновь перенесли в сухие центрифужные пробирки;

в)к плазме в каждой пробирке добавили по 0,1 мл раствора ристомицина (2,5 мг/мл);

г)после 5-минутной экспозиции пробирки со смесью центрифугировали (1 500 д, 5 мин), надосадки удаляли и к осадкам прилили по 0,5 мл 0,14 М раствора хлорида натрия, суспендировали осадки и вновь центрифугировали (1 500 д, 5 мин);

д)повторили пункт г и удалили надоса- док;

е)к осадку в каждой пробирке прилили по 3 мл 1 М раствора едкого натра и поместили пробирки на кипящую водяную баню на 3 мин;

ж)растворы охладили и определили их оптическую плотность против растворителя при 280 нм (см.табл.1).

Пример 2.

а)Кровь трех больных с механической желтухой взяли в шприц со стабилизирующим раствором (3,8% р-р цитрата натрия) в соотношении 1:9. Пробы поместили в центрифужную пробирку по 2 мл каждая, центрифугировали с ускорением 375 g в течение 15 мин.

б)0,5 мл плазмы из каждой пробирки перенесли в сухие пробирки и повторили центрифугирование (1 500 д, 20 мин), затем плазму вновь перенесли в сухие центрифужные пробирки;

в)к плазме в каждой пробирке добавили по 0,1 раствора ристомицина (2,5 мг/мл);

г)после 5-минутной экспозиции пробирки со смесью центрифугировали (1 500 д. 5 мин), надосадки удаляли и к осадкам прилили по 0,5 мл 0,14 М раствора хлорида натрия, суспендировали осадки и вновь центрифугировали (1 500 д, 5 мин);

д)повторили пункт г и удалили надоса- док;

е)к осадку в каждой пробирке прилили по 3 мл 1 М раствора едкого натра и поместили пробирки на кипящую водяную баню на 3 мин;

ж) растворы охладили и определили их оптическую плотность против растворителя при 280 нм (см.табл.2).

Пример 3.

а)Кровь взята у трех белых крыс, которым предварительно ввели в вену тромбин (0,120 мг/100 г массы), т.е. создали экзогенную тромбинемию, что ведет к появлению фибринмономеров и продуктов деградации фибрина, на стабилизатор (3,8% р-р цитрата натрия) в соотношении 1:9. Пробы поместили в центрифужную пробирку по 2 мл каждая, центрифугировали с ускорением 375 g в течение 15 мин;

б)0,5 мл плазмы из каждой пробирки перенести в сухие пробирки и повторили центрифугирование (1 500 g, 20 мин), затем плазму вновь перенесли в сухие центрифужные пробирки;

в)к плазме в каждой пробирке добавили по 0,1 мл раствора ристомицина (2,5 мг/мл);

г)после 5-минутной экспозиции пробирки со смесью центрифугировали (1 500 g, 5 мин), надосадки удаляли и к осадкам прилили по 0,5 мл 0,14 М раствора хлорида натрия, суспендировали осадки и вновь центрифугировали (1 500 g, 5 мин);

д)повторяли пункт г и удаляли надоса- док;

е)к осадку в каждой пробирке прилили по 3 мл 1 М раствора едкого натра и поместили пробирки на кипящую водяную баню на 3 мин;

0

5

0

ж) растворы охладили и определили их оптическую плотность против растворителя при 280 нм (см.табл.3).

Формула изобретения Способ определения суммарного содержания фибринмономеров и продуктов деградации фибрина в плазме крови путем обработки плазмы ристомицином, отделения полученного осадка с последующим из- мерением оптической плотности и расчетом, отличающийся тем, что, с целью повышения специфичности способа, его упрощения и ускорения, проводят смешивание плазмы и ристомицина в объемном соотношении 5; 1, при этом используют рис- томицин в конечной концентрации 0,5 мг/мл, полученный осадок растворяют в 1 М растворе едкого натра, оптическую плотность определяют при 280 нм, а количество фибринмономеров и продуктов деградации фибрина в плазме С рассчитывают по формуле

25

С

D260 П Ь 10

15,1

где Dseo - оптическая плотность раствора при 280 нм;

п - коэффициент пересчета на 1 мл плаз- мы;

b - коэффициент пересчета с учетом разведения осадка едким натром;

15,1 -оптическая плотность 1% раствора фибринмономера;

10 - коэффициент перехода от концентрации в % к г/л.

Таблица 1

Использование: медицина, методы определения активности или содержания факторов свертывания или продуктов их превращения в крови. Цель изобретения - повышение специфичности способа, его упрощение и ускорение. Сущность изобретения: спектрофотометрически определяют количество фибринмономера и продуктов деградации фибрина, осаждаемых из плазмы добавкой ристомицина.

Таблица 2

1779693

10 Таблица 3