Диагностическое средство для обнаружения лейкоцитов в моче Советский патент 1992 года по МПК G01N33/48 G01N33/15 

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской биохимии и касается диагностического средства для обнаружения лейкоцитов в моче. Оно представляет собой адсорбционно способный носитель, который пропитывается пригодным буферным раствором, вспомогательными веществами и хромогеном

Целью изобретения является повышение специфичности.

Изобретение поясняется ниже следующими примерами.

Пример 1. Фильтровальную бумагу (например Schleicher & Sch ull 23SL) пропитывают следующими растворами последовательно одним за другим и потом при 60°С или при комнатной температуре высушивают.

Раствор 1.

В воде 0,2 мол/литр трис-(гидроксиме- тил)-амино-метан-НС -буфера, рН 9.0.

Раствор 2.

В ацетоне субстратные растворы концентрацией мол/л (0,01 мол.%):

Активаторы, соответствующие изобретению, добавляют в растворы 1 и 2 (по мере растворимости) таким образом, чтобы при добавлении активаторов общих формул I, II и IV конечная концентрация пропиточного раствора в результате составляла мол/л (0,1 мол/л), а при добавлении активаторов общей формулы III конечная концентрация составляла 2% (W/V).

В табл.1 представлены результаты опытов со следующими субстратами эстеразы и протеазы:

А: ди-ацетил-31, з -дибром-5 , 5п-дих- лор-фенолсульфонфталеин,

В: ди-ацетил-4,5,6 7,3|,5|, З11, 5м-октаб- ром-фенолсульфонфтЈлеин,

С: ди-(№-бензилкарбонил- -злан1 :л)-3|, 5 , 3 , 5 -тетрабромсульфонфтзлеин,

со

с

4

ОЭ -N О О 1

СО

D: ди-(М-бензилоксикарбоиил-1 -фени- лаланил)-3 ,5,3,5 -тетрабром-фенолсуль- фонфталеин.

В табл. 1 указано время реакций, измеряемое от момента погружения опытных полос в стандартный раствор 5000 лейкоцитов/мл в изотоническом растворе поваренной соли до момента начала отчетливого окрашивания. Для сравнения берутся промежутки времени, характерные при проведении реакций компонентов без добавления активаторов. При применении исследуемых здесь четырех соединений окраска меняется от бесцветной до темно-синей.

Подобные результаты достигаются в опытах, если вместо субстратов А, В, С и D вводить другие сульфонфталеиновые эфиры и/или вместо стандартного раствора 5000 лейкоцитов/мл изотонического раствора поваренной соли употребить мочу, содержащую лейкоциты.

П р и м е р 2. Фильтровальная бумага (например Schleicher & Schull 23SL) одним за другим пропитывают следующими растворами и далее сушат при 60°С или при комнатной температуре.

Раствор 1.

Трис-(гидроксиметил)-аминометан-НС1- буфер, 0,2 мол/л, рН 7,0, в воде (для субстратов Е, F и G), или трис-(гидроксиметил)-ами- нометан-НСЬбуфер, 0,2 мол/литр, рН 8,0, в воде (для субстрата Н).

Раствор 2.

Растворы субстратов, 10 мол/л, в ацетоне.

Добавляют такие же активаторы и условия проведения опытов такие же, как и в примере I.

В табл. 2 представлены результаты опытов со следующими субстратами протеазы:

Ё: Тиазол-2-азо-4|-П|-(М-бензилокси- карбонил-Ьананилокси)-5-метокси-нафта- лмн) (изменение окраски бумаги от розовой до красной).

F: 6-Метокси-бензотиазол-2-азо-2/1 - (М-бензилоксикарбонил-Ьананилокси)-на фталин/ (изменение окраски опытной бумаги от розовой до красной).

G: 2)4-Динитро-бензол-азо-4|-/1|-(М- бензйлоксикарбонил-1 -аланилокси}-бензол/ (изменение окраски от желтой до фиолетово-красной).

Н: 2,5-Диметокси-бензол-азо-4|- г-(М- бензилоксикарбоиил-1 -аланилокси)-нафта- лин (изменение окраски опытной бумаги от светло-оранжевой до красной).

Время реакций определяют промежутком времени от момента погружения опытных полос в стандартный раствор 5000

лейкоцитов/мл изотонического раствора поваренной соли до момента начала отчетливого изменения цвета. Для сравнения служит время реакций составов без актива- торов.

Подобные результаты могут быть достигнуты, если в Ъпытах вместо субстратов Е, F, G и Н использовать другие сложные эфиры, содержащие азокрасители, описан- 0 ные в заявке Р 2826644.1 и/или вместо стандартного раствора с 5000 лейкоцитами/мл изотонического раствора поваренной соли употребить мочу, содержащую лейкоциты.

П р и м е р 3. Фильтровальную бумагу 5 (например, Schleicher & Schull 23SL) пропитывают следующими растворами, одним за другим, и далее сушат при 60°С или при комнатной температуре.

Раствор 1.

0 Натрий-тетраборат-НС -буфер, 0,2 мол/л, рН 8,0, в воде. Раствор 2.

Раствор субстратов, 10 мол/л, в ацетоне (0,1).

5 В табл. 3 представлены результаты опытов со следующими субстратами протеазы: 1:3-(Ы-Дифенилкарбамоил-1)-ананилок- си)-индол;

J: (5 ,5-Диметил-3-оксоциклогек- 0 сен-1 -ил)-и-аланил-окси индол;

К: 3- Ч-бензилоксикарбонил)-Ь-алани- локси индол.

Время реакций определяют от момента погружения опытных полос в стандартный 5 раствор 5000 лейкоцитов/мл изотонического раствора поваренной соли до начала отчетливых цветовых реакций. Для сравнения принималось время реакций составов без активаторов.

0 Опытные полосы бумаги, пропитанные растворами стремя субстратами, после погружения в раствор, содержащий лейкоциты, изменяли свою окраску от бесцветной до темно-синей.

Подобные результаты достигаются в 5 опытах с другими индоксилэфирами из заявки Р 2854987.3 и/или при употреблении в месю стандартного раствора 5000 лейкоцитов/мл изотонического раствора поваренной соли мочи, содержащей лейкоциты. 0 П р и м е р 4. Фильтровальную бумагу, пропитывают поочередно следующими растворами и затем сушат при 60°С или при комнатной температуре.

с т вор 1. .

5 Трис-(гидроксиметил)-амино-метан-НС - буфер, 0,2 мол/л, рН 9,0, в воде. Раствор 2.

Диацетил-31, 51, з, 5п-тетрабром-фе- нилсульфонфталеин, Ю мол/л, в ацетоне (0,1%).

Активаторы, соответствующие изобретению, добавляют в растворы 1 и/или 2 так, чтобы при введении отдельных активаторов общих формул I, II и IV, конечная концентрация их в пропиточном растворе составляла мол/л, а при введении активаторов общей формулы III конечная концентрация в пропиточном растворе составляла 2% (W/V).

В табл. 4 представлено время реакций, которое измерялось с момента погружения опытных полос в стандартный раствор 5000 лейкоцитов/мл изотонического раствора поваренной соли до начала отчетливой цветовой реакции. Для сравнения приводится время реакции состава без активаторов.

Опытная бумага при погружении в лей- коцитсодержащие растворы меняла окраску с бесцветного до темно-синего цвета.

Подобные результаты опытов могут быть достигнуты при употреблении вместо стандартного раствора 5000 лейкоцитов/мл изотонического раствора поваренной соли лейкоцитосодержащей мочи.

Пример 5. Опытную бумагу пропитывают следующими растворами таким же способом, как и в примере 4:

Раствор 1.

Трис-(гидроксиметил)-аминометан-НС1- буфер, 0,2 мол/литр, рН 8,0, в воде.

Раствор 2.

2-метокси-4-нитробензол-аоо-4|- 11-(ГФ- бензилоксикарбонил- -алаиилокси)-нафта лин, мол/л, в ацетоне 0,1% (В).

При погружении в лейкоцитосодержа- щие растворы опытная бумага меняет окра- ску от светло-оранжевого цвете до красного.

В табл. 5 представлены результаты опытов Время реакции измеряется от момента погружения опытных полос бумаги в стандартный раствор 5000 лейкоцитов/мл изотонического раствора поваренной соли до начала отчетливой первой цветовой реакции Для сравнения служит время реакции состава без активаторов.

Подобные результаты опытов достигаются при применении вместо стандартного раствора с 5000 лейкоцитами/мл изотонического раствора поваренной соли мочи, содержащей лейкоциты.

Примерб. Опытная бумага пропитывается следующими растворами таШМ способом, как и в примере 4:

Раствор 1.

Натрий-тетраборат-НС -буфер, 0,2 мол/литр, рН 8,0, в воде.

Раствор 2.

(2 -нитробензол-сульфенил)-1 -эна- нилокси -индол, моль/л, в ацетоне.

Опытная бумага окрашивается при погружении в лейкоцитсодержащие растворы от желтого до зеленого цвета.

Результаты опытов представлены в 5 табл.6. Время реакций определяют с момента погружения опытных полос в стандартный раствор с 5000 лейкоцитами/мл . изотонического раствора поваренной соли до начала отчетливой цветовой реакции 10 Для сравнения служит время-реакции состава без добавления активаторов.

Подобные результаты могут быть достигнуты, если вместо стандартного раствора 5000 лейкоцитов/мл изотонического 5 раствора поваренной соли применить мочу, содержащую лейкоциты.

П р и м е р 7. Опытную бумагу пропитывают следующими растворами, как это описано в примере 4: 0 Раствор 1.

Натрий-тетракарбонат-НС -буфер, 0,2 мол/л, рН 8,0, в воде.

Раствор 2.

3-М-(Бензоил)-0,1 -аланинокси/-индол, 5 мол/литр, в (с) ацетоне.

Исследумая бумага при погружении в лейкоцитсодержйщие растворы меняет окраску от бесцветной до голубой.

Результаты опытов представлены в 0 табл.7. Время реакций определялось с момента погружения исследуемых полос бумаги в стандартный раствор 5000 лейкоцитов/мл изотонического раствора поваренной соли до начала первой отчетливой 5 цветовой реакции. В качестве сравнения рассматривалось время реакции состава компонентов без добавления активаторов.

Подобные результаты опытов достигаются при употреблении вместо стандартно- 0 го раствора 5000 лейкоцитов/мл изотонического раствора поваренной соли мочи, содержащей лейкоциты.

П р и м е р /а.

Исследуемая бумага пропитывалась 5 следующими растворами таким же образом, как и в примере 4:

Раствор 1.

Натрий-тетраборат-НС -буфер, 0,2 мол/литр, рН 8,0, в воде. 0 Раствор 2.

(Толуол-4 -сульфонил)-Ьаланилок- си -индол, (А) мол/л, в ацетоне 0,1 мол%.

Опытная бумага при погружении в лей- 5 коцитосодержащие растворы меняла окраску от бесцветной до голубой.

Результаты опытов представлены в табл. 7а. Время реакций определялось с момента погружения полос в стандартный раствор 5000 лейкоцитов/мл изотонического

раствора поваренной соли до начала отчетливой цветовой реакции. В качестве сравнения служит время реакции состава без активаторов.

Подобные результаты достигаются при использовании вместо стандартного раствора 5000 лейкоцитов/мл изотонического раствора поваренной соли мочи, содержа- щей лейкоциты.

П р и ме р8.

Фильтровальная бумага (например, Schlelcher & Schull 23SL) пропитывается одним за другим следующими растворами и далее сушится при 60°С или при комнатной температуре:

Раствор 1.

Хлористый лаурилпиридиний, 0,2% в трис-(гидроксиметил)-аминометан-НС -бу- фере, 0,2 мол/л, 2 мол.%, рН 7,0, в воде.

Раствор 2.

Тиазол-2-азо-4 -(М-бензилоксикарбо- нил-Ьалэнилокси)-нафталин, 10 мол/л, в ацетоне ((Ь).

Введение активаторов и услбвия проведения опытов такие же, как и в примере 1.

Испытуемая бумага при погружении в лейкоцитосодержащие растворы меняет окраску от розовой до фиолетовой.

Результаты опытов представлены в табл.8. Время реакций определяется с момента погружения испытуемых полос бумаги в стандартный раствор 5000 лейкоцитов/мл изотонического раствора поваренной соли до начала отчетливой цветовой реакции. В качестве сравнения приводится время реакции состава без добавления активаторов.

Подобные результаты могут достигаться при употреблении других субстратов и активаторов, упомянутых в примерах 1-7, и/или других обычных смачивателей.

П р и м е р 9. Фильтровальную бумагу (например, Schlelcher &. Schull 23SL) пропитывают следующими растворами одним за другим и далее сушат при 60°С или при комнатной температуре:

Раствор 1.

Трис-(гидроксиметил}-амино-метан-НС1- буфер, 0,2 мол/литр, рН 7,0, в воде.

Раствор 2.

Триазол-2-азо-1 (М-бензилоксикар- бонил-и-аланилокси)-нафталин, мол/л, в ацетоне ($).

Добавление активаторов и условия проведения опытов такие же, как в примере 1.

Испытумемая бумага при погружении в лейкоцитосодержащие растворы окрашивается в цвета от розового до сине-фиолетового.

5

0

В табл. 9 представлены результаты опытов. Время реакций определялось от момента погружения испытуемых полос в стандартный раствор 5000 лейкоцитов/мл

изотонического раствора поваренной соли до начала отчетливой цветовой реакции. В качестве сравнения указывается время реакций составов без активаторов.

Подобные результаты достигаются при

0 использовании и других сложных эфиров, содержащих азокрасители, других активаторов, названных в примерах 1-7, и/или других обычно употребляемых комплексо- образователей.

5 ПримерЮ. Фильтровальная бумага (например, Schlelcher & Schull 23SL) пропитывается одним за другим следующими растворами и далее сушится при 60°С или при комнатной температуре:

0 Раствор.

Бромат калия, 10 мол/л (0,1 мол.%), в буферном растворе тетраборат-натрий-HCl, 0,2 мол/л, рН 8,0, в воде. Раствор 2.

3- М-формил-1 -аланилокси -индол, 10 мол/л, в ацетоне.

Добавление активаторов и опыт производят, как в примере 1.

Испытуемая бумага при погружении в лейкоцитЬсодержащие растворы меняется от бесцветной до голубой.

Резул аты опытов представлены в табл.10. Время реакций определяется от момента погружения испытуемых полос в

5 стандартный раствор 5000 лейкоцитов/мл изотонического раствора поваренной соли до начала отчетливой цветовой реакции. Для сравнения приводится время реакции состава без активаторов.

0 Подобные результаты могут быть получены также при применении других индок- силовых эфиров, других активаторов, описанных в примерах 1 - 7, и других обычно употребляемых окислителей.

5 Составы диагностического средства по указанным примерам и дополнительным примерам представлены в таблицах.

С применением предложенных активаторов значительно повышается специфич0 ность способа, поскольку в известном техническом решении имеется большое количество редуцирующих веществ, мешающих окраске.

Рецептура примеров (1-10) представле5 на в таблицах 11-15 (примеры 1,2,3). Формула изобретения Диагностическое средство для обнаружения лейкоцитов в моче, содержащее носитель, пропитанный субстратом фермента, уфером и вспомогательными веществами,

отличающееся тем, что, с целью повышения специфичности, в качестве субстрата фермента оно содержит субстрат эс- теразы и/или(роотеазы формулы А R

R:

где RV - замещенный радикал карбоновой кислоты, снабженный защитной для азота группой радикала аминокислоты или пептида;

R211 - атом галогена;

Ra - атом галогена;

R411 - водород или атом галогена или соединений формулы В

A1 -N-N-B1 (ОК)п,

где А1 -тиазол, 6-метокси-бензотиазол, 2,4- динитробенздл, 2,5-диметоксибензол или радикал 2-метокси-4-нитробензола;

В1 - замещенный водородом или группой алкокси радикал бензол или нафталин;

R - снабженный защитной для азота группой радикал аминокислоты или радикал пептида;

М.

или соединений формулы С

К У

где Rill,R211, Ra. R4M - соответственно водород;

X - аминогруппа;

А - радикал аминокислоты или пептида; .

В11 - защитная для азота группа, буфер со значением со значением рН 7,0-9,0, а в качестве вспомогательных веществ оно со- держит активатор общей формулы I, или И, или IV, и/или 111,

(при производные пиридина общей формулы I

где RI - водород, хлор, метил, метоксил; R2 - водород или хлор;

Ra - водород, бром, метил, метоксил, этоксил, винил-хинуклидил-карбонил группа, винилгруппа, замещенная фенилом, пи- ридилом или тиазолилом; 5R/i - водород, хлор, бром, Ci-Сз-алк л,

метокси-или винилгруппа, замещенная радикалом пиридина;

RS - водород, хлор, бром, Ci-Сз-алкил

или винилгруппа, замещенная фенилом, ме0 токсифенилом, диметиламынофенилом,

нафтилом, пиридилом или радикалом фурила;

RI и Ra - аннелированное бензольное

кольцо, которое может быть замещено так5 же бромом, гидроксилом, а d-Сз-алкилом,

метоксилом, этоксилом, а также совместно

двумя группами брома и одной группой метоксила, или аннелоированное бензольное

кольцо, к которому аннелировано бензо0 льное кольцо, или кольцо пиридина, которое

может быть замещено метилом, а также аннелированный радикал индено;

Ra и Ra - аннелированйое бензольное кольцо, которое может быть замещено Ci- 5 Сз-алкилом или метоксилом, или аннелированное бензольное кольцо, к которому аннелировано пиридиновбе КоЖцо, которое может быть замещено метилом;

II - производные имидазола общей фор0

мулы

W

N-R1,

где RI - водород, метил, этил или кадикал 5 фенила, замещенный в случае необходимости гидроксильной группой;

R21 - водород, радикал аминоэтила, низший N-ацетил-аминоалкил, низкоатомная алифатическая Ci-Сз- в случае необходимо- 0 сти ненасыщенная Сз-карбоновая кислота и в случае необходимости М-ацетилирован- ный радикал алаиила;

III- спирты общей формулы III: X-A-OH, где X - водород или гидроксильная группа;

5 А при X - водород означает алифатический Се-С22-углеводородный радикал, циклический насыщенный или ненасыщенный алифатический Сб-С1 -углеводородный радикал, а при Х- гидроксильная группа - нена0 сыщеиный или насыщенный С5-С12-углево- дородный радикал;

IV- комплексы металлов общей формулы IV

Dm B(CN)n(ONO)p, 5 где D - ион калия или натрия; В - ион тяжелого металла; m - целое число от 2 до 5; п - иелое число от 4 до 8; или 1, причем число m задается по валентности тяжелого металла и числа п

при следующем соотношении компоненТОВгМОЛЬ.%: ---..--. . -.....,,. :v-ri-c.:, ......

Субстрат эстеразы и/или

протеазы0,1-2,4;

Активатор по формуле , .

1,11, IV0,5-11;

И/ИЛИ..-:.,

Активатор по формуле III 17,8-71,3; Буфер: До 100.

2. Диагностическое средство по п.1, о т- л и ч а ю щ е е с я тем, что, с целью усиления окраски, оно в качестве вспомогательных

веществ дополнительно содержит бромат калия в концентрации 3,2-5,5 мол,%. :

3.Диагностическое средство по п. 1, о- т л и ч а ю щ е вся тем, что, с целью усиления окраски, оно в качестве вспомогательных веществ дополнительно содержит лаурил- пиридинийхлорйд в концентрации 2,3-9,0 мол.%.

4.Диагностическое средство по п. 1, о т- личающееся тем, что, с целью усиления окраски, оно в качестве вспомогательных веществ дополнительно содержит ацетат цинка в концентрации 0.3-2,4 мрл.%.

t а б л и ц а 1

Изобретение относится к медицине и касается диагностического средства для обнаружения лейкоцитов в моче. Целью изобретения является повышение специфичности. Дигностическое средство состоит из адсорбционного пригодного носителя, пропитанного известными субстратами эс- теразы и/или протеазы на основе сульфо- конфталеинового эфира, или азокрасителя, или индоксилэфира с добавлением активаторов на основе производных пиридина, имидазола, спиртов и комплексов металлов, а также для усиления цвета к нему добавляют активаторы, или смачиватели, или комп- лексообразователи. 16 табл.

Пиридин , , А 11070чЮ1 50

3-Этил-пиридин1)565 0 %

Jt-Метокси-пиридин110-65ч 0450

Хинолин ,75503203 0

2-Метил-хинолин 5 55 30.0350

, Д ч-Бром-хинолин. . 6060370 . 330

3-Метокси-хинолин 5050310380

Изохинолин8555350380

Бензо-(Ь)-хинолин-акридин9065280330

Бензо(с)-хинолин-фенантридин, 7560260360

2-Мётил-фенантридин100.65250370

2-Этил-фенантридин. 8070300360

2-Пропил-фенантридин8060280330

2-Метокси-фенантридин8560260350

Бензо-(Ј) -хинолин90АОЗЮ310

Бензо-(Ь)-хинолин .90552903 0

1,7-Фенантролин7565ЗчОчЮ

ч,7-Фенантролин8о7.0270380

ч-Аза-флуорен120502чО290

Хинин11070350330

Хинидий7065375280

Хинхонин. 6050ЗчОЗЯО

Хинхонидин6555390320

13

1784097

14 Продолжение табл.1

Таблица2

151784097 16

Продолжение табл.2

17178409718

Продолжение табл.2

Пиридин

2-Бром-пиридин

2,б-Диметил- -этоксипиридин

Хинолин

2-Метил-хинолин

7-Изопропил-хинолин

3-Метокси-хинолин

2-Метил-б-бром-хинолин

5,7 Дибром-8-метоксихинолин

Изохинолин

3-Пропил-изохинолин

7-Метил-изохинолин

1 -Хлор-изохинол -н

1-Метокси-5-хлор-изохинолин

1-Хлор- -метил-5-метоксиизо

Бензо-(Ь)-хинолин-акридин

Бензо- (с)-хинолин-фенантрид

2-Этил-фенантридин

2-Метокси-фенантридин

Бензо-(f)-хинолин

Бензо-(§)-хинолин

2, -Диметил-бензо- (g) -хинол

Бензо-(Ь)-хинолин

1,7-Фенантролин

2-Метил-1,7 Фенантролин

2,8-Диметил-1,7 фенантролин

4,7-Фенантролин

З-Метил- , 7 фенантролин

3,8-Диметил-А,7-фенантролии

ТаЬлица 3

1,10-Фенантролин 170

2,9-Диметил-1,10-фенантролин1 5

4-Аза-флуорен90

Хинин150

Хинхондин125

Купреин 160

2- У -Метокси-фенил -винил-пиридин- (21)95

2-tV -(N,N-Диметиламино)-фенил - винилпиридин-(2 )

(фенил)-винил -пиридин-2 ,k J 120

2- Нафтил- (1 |-винил-пиридин-(2( )

2- Пиридил- (211) -винил-пиридин- (2)

2- Пиридил- С) -винил-пиридин- (21 )

2- Пиридил- (3 )3-винил-пиридин- (3)

2- Пиридил-(3) -винил-пиридин-(4)

2- Тиенил-(2 )Д-винил-пиридил- (Ь )

Имидазол

1-фенил-имидазол

Гистамин

N, о(-Ацетил-гистамин

Имидазолил-Aj-уксусная кислота

L- Гистадин

N- -Ацетил-Ь-гистидин

Гексанол-(1)

Октанол-(1)

Нонанол-(I)

Деканол-(1)

Додеканол-(Х)

Пентадеканол- ()

Гептадеквнол-(Х)

Октадеканол-(1)

Понадеканол-(I)

Докозанол-(Х)

Продолжение табл.3

35 5 35 30 30 35

45

231784097 24

Продолжение табл.3

25

Активаторы

оста в без активаторов для сравнения

1- Фенил -винил-пиридин-(2)

Гексадеканол-(1)

Активаторы 1 и 2

2-{Пиридил-(4)-винил-пиридин-(4()

Линалоол

Активаторы 3 и 4

Хинхолин

Ди-натрий-пентациано-нитрозил-феррат-И

Активаторы 5 и 6

1784097

26 Таблица 4

Таблица 5

Таблица б

Таблица 7

Время реакции, с

90

70 55 40 40 50 30 75 60 40

27

1784097

28 Таблица 7а

Таблица 8

Таблица 9

Рецептура примеров 1-3

Рецептура примеров 4, 5, б и 7

Рецептура примера 8 .

Рецептура примера 9

Таблица 11

Таблица 12

Таблица 13

Таблица 14

Рецептура примера 10

Рецептура примеров 11-16

Субстрат

Активатор 1,И, IV Активатор III Буфер

Окислитель (бромат калия)

Смачиватель (лаурил пиридиний бромид)

Комилексообра зова Продолжение табл. 14

Таблица 15

Таблица 16

10- 5,5

ю- 3,6

2.ic-a go