Изобретение относится к аналитической химий объектов окружающей среды и санитарной гидробиологии и ка - сается определения концентрации меркаптанов в природных водах. .jr .Y .Меркаптаны или. тиолы - производные сероводорода являются специфическими и приоритетными загрязнителями природных вод. Они попадают в водоем со Сточными, вода ми предприятий целлюлозно-бумажной, нефтедобывающей и нефтеперерабатывающей и химической промышленности, а также накапливаются в водоемах в результате жизнеде- ятельности многих организмов. Так-, например, содержание сероводорода и меркаптанов в подскипидарной воде различных предприятий целлюлозно-бумажной промышленности достигает от
30 до 1500 мг/л, в очищенных сточных водах 0,1-5 мг/л. В процессе жизнедеятельности организмов, особенно в зарослях водорослей выделяется до 50-400-10 а г на 1 г живого веса в час меркаптаносоединений. Меркапта-.
.. ны относятся к числу высокотоксичных и трудноопределяемых веществ. ПДК в
воде водоемов метилмеркаппана по орган олепти чес кому показателю состав- ляет 0,0002 мг/л.
В настоящее время известны колориметрические; потенциометрические, тит- риметрические, газохромотографические методы .
Эти методы длительны,- трудоемки, имеют невысокую чувствительность и практически не пригодны для оценки
ю
«а О
экологической ситуации в объектах окружающей среды.
Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является спо-g соб определения соединений по ферментативной активности.
Ферменты служат универсальными атрибутами живой клетки, создающими основу биохимической эволюции, и поэто- д му должны учитывать при решении вопросов био огическогсГкбнтроля качества окружающей среды. Сероводород индуцирует активность нитратредуктазы в листьях шпината, уровень активности щ фермента возрастает, что связано с ингибированием ферментов, окисляющих НАДН.
Недостатками известного способа являются:20
применение другого класса Фермента,
определение выполнено на наземных растениях;
невысокая чувствительность по меркаптанам.25
Целью изобретения является определение концентрации меркаптанов в водной среде, повышение точности определения, снижение трудозатрат на одно определение.30
Это достигается тем, что согласно предлагаемому способу, заключающемуся в определении активности фермен- - тов, присутствие меркаптанов в приправило, наблюдается нарастание (индукция) активности ферментов при невысоких дозах реагента и ее снижение по сравнению с контролем - при высоких.
Установлено, что высшее водное растение - элодея канадская - один из распространенных видов в водоемах „ Советского Союза, при инкубации на растворах меркаптана, в частности 2- меркаптоэтанола, изменяет уровень активности уЭ-ЦАС в зависимости от действующей концентрации или дозы реагента. Эта зависимость и положена в основу предлагаемого способа.
Способ определения концентрации меркаптанов в природных водах осуществляют следующим образом.
Определение меркаптанов начинается с построения калибровочной кривой. Для этого организмы фитобентоса,напри мер элодею канадскую, инкубируют в растворах меркаптана различной концентрации от до 10 7моль/л в течение 1-5 сут. Из расчета 8 г фито- массы в литре. По прошествии определенного времени навеску растений 2 г растирают в фарфоровой ступке на холоде, добавляют 5 мл 0,2 М трис-соля- нокислого буфера рН 8,85, смесь от- жикают через марлю в k слоя, переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют 5 минут при 12 тыс. об/мин,
Использование: при проведении анализов воды для контроля экологической обстановки. Цель: повышение точности определякия меркаптанов и снижение трудозатрат. Сущность изобретения: отбирают в качестве проЬ бентосные формы водной растительное-, ти,гомогенизируют пробы в трис-НС1 буфере, добавляют в качестве реагён - тов цистеин, 2-меркаптоэтанол и свинца регистрируют в качестве химического параметра активностью фермента i 3-циано-аланинсинтазы и устанавливают концентрацию меркаптанов в пробе по ка-либровочному графику.Положительный эффект: индикация меркаптанов произво дится в течение 5-60 мин, способ позволяет прои-звоЛиТБ тагф ёс -1-диаТ ностику непосредственно по реакциям биоты без использовйнйя специальной установки и дефицитных реагентов. 1 ил Л 2 а
родных водах определяют по активности ,g надосадочную жидкость отделяют и исфермента А цианоаланинсинтазы в бен- тосных Формах водной растительности водоема.
/5-цианоаланинсинтаза (/J-ЦАС)-пири- доксальзависимая лиаза, которая ката- п лизирует реакцию замещения по схеме SHCHgCHNH/ COOH f RSH-mS-CH2CHNH2COOII + + H2S4
Продуктом реакции являются тио- эфир и сероводород. В присутствии 45 меркаптанов в среде активность /j-ци- .аноаланинсинтазы в макрофитах увеличивается или уменьшается по сравнению с контролем.
В основе предлагаемого способа экспериментальные данные, полученные авторами при изучении закономерности индукции А-ЦАС на растворах меркаптанов.
Известно, что в ответ на загрязнения, на токсиканты организмы реагируют изменением биохимических пока зателей, характеризующих ключевые звенья метаболизма гидробионтов . Как
50
5
пользуют для определения активности /Ь-ЦАС.
Для определения активности в пробирку приливают 1,2 мм 0,2 М трис-аце татного буфера рН 9,25; 0,2 мл Ферментного экстракта; 0,2 мл 0,1 М цис- теина и 0,2 мл 0,1 М меркаптоэтанола; 0,2 мл 0,002 М ацетата свинца. В контрольной колбе вместо раствора ацетата свинца добавляют 0,2 мл дистиллированной воды. Пробирки тщательно встря хивают и инкубируют в термостате при 37°С 30 минут. Затем изменяют оптичес кую плотность опытных растворов относительно контрольных при Д ЗбО нм в кюветах 0,5 см.
Активнрсть фермента рассчитывают по формуле
А 158.Д, где А - активность фермента, нмоль
мг- мини ; Д - оптическая плотность;
158- пересчетный коэффициент.
g надосадочную жидкость отделяют и исп
5
0
5
пользуют для определения активности /Ь-ЦАС.
Для определения активности в пробирку приливают 1,2 мм 0,2 М трис-аце- татного буфера рН 9,25; 0,2 мл Ферментного экстракта; 0,2 мл 0,1 М цис- теина и 0,2 мл 0,1 М меркаптоэтанола; 0,2 мл 0,002 М ацетата свинца. В контрольной колбе вместо раствора ацетата свинца добавляют 0,2 мл дистиллированной воды. Пробирки тщательно встряхивают и инкубируют в термостате при 37°С 30 минут. Затем изменяют оптическую плотность опытных растворов относительно контрольных при Д ЗбО нм в кюветах 0,5 см.
Активнрсть фермента рассчитывают по формуле
А 158.Д, где А - активность фермента, нмоль
мг- мини ; Д - оптическая плотность;
158- пересчетный коэффициент.
5
На основе полученных данных строя колибровочную кривую активности /э-ЦА откладывая на оси абсцисс концентрацию меркаптана (моль/л) или его лозу (мг/г), а на оси ординат - сте пень индукции /}-ЦАС.
На чертеже представлена калибровочная кривая.
Пример. Определение меркаптанов начинают с отбора проб организмо фитобентоса в районе выпуска сточных вод и условно чистом створе.
Растения отбирают известными гидробиологическими методами, разбирают по видам. Берут навеску индикаторног растения, тщательно гомогенизируют и подготавливают ферментный экстракт, как описано выше при построений калибровочного графика.
Определяют активность -ЦАС и по калибровочной кривой находят концентрацию меркаптана.
Результаты определения меркаптана в водах предлагаемым и известным способом приведены в табл.1.
Предлагаемый способ является экспресс-методом, т.к. позволяет провести индикацию меркаптанов в течение 5-60 минут, в то время как известным методом до 4 часов. Предлагаемый ме- тод погволяет исключить ряд длительных процедур пробоподготовки и выделения меркаптанов (табл.2), использование специальной установки и остродефицитных реагентов.
Разделение компо- нетов отдувкой током С02
0
Кроме того, предлагаемый способ позволяет проводить более быструю и точную диагностику загрязнения природных вод непосредственно по реакциям биоты, что важно при организации экологического мониторинга в сети Госкомгидромета в рамках общегосударственной службы наблюдений и контроля за загрязненностью объектов природной среды (ОГСНК).
Формула изобретения
Способ определения концентрации меркаптанов в водной среде, предусматривающий отбор проб, их гомогенизирование, добавление реагентов, регистрацию химического пераметра и установление концентрации меркаптанов в пробе по калибровочному графику, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения и снижения трудозатрат, в качестве проб отбирают бентосные формы водной растительности, гомогенизацию пробы осуществляют в трис-HCl буфере, перед добавлением реагентов проводят цент i рифугирование гомогената и приготовление ферментной вытяжки,в качестве реагентов используют цистеин, 2-мер- каптоэтанол и ацетат свинца, а в качестве химического параметра регистрируют активность фермента /з-цианоала- нинсинтазы.
Таблица 1
Таблица 2
отсутствует
не менее 3 ч
Осаждение суспензией карбоната кадмия
Выделение меркаптанов из солей
Отбор проб растений и подго
Калибровочный график два отоаделеотя мерюатанов в прфодшвГвадаг
% ISO
(00
50
IQ-4
не менее 3 ч 2-10 мин
I 10
моль/,
