Фрагмент ДНК ALV 7, кодирующий синтез альфа-амилазы, способ его конструирования и штамм бактерий BacILLUS SUвтILIS - продуцент альфа-амилазы Советский патент 1992 года по МПК C12N15/18 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и, в частности, к генетической инженерии, и представляет собой фрагмент ДНК, кодирующий синтез термостабильной а-амилазы, способ его конструирования и штамм В.subtilis - продуцент термостабильной а-амилазы.

а -Амилаза - фермент, разлагающий амилозную компоненту крахмала, используется в пищевой промышленности для разжижения крахмалсодержащего сырья с целью получения гдюкозно-фруктозных сиропов. Кроме того, а-амилаза применяется в текстильной промышленности для расшлихтовки тканей. Эти процессы требуют протекания реакций при высоких температурах (до 105°С), что обуславливает необходимость повышения температуры термоинактивации фермента. Лучшими продуцентами бактериальных разжижающих а -амилаз являются штаммы Bacillus amyloliquefaclens или штаммы Bacillus subtilis, содержащие фрагмент ДНК. кодирующий а -амилазу из Bacillus amylo.iiquefaciens, например штамм В. subtilis (pRT5).

Однако инактивация этой. «-амилазы происходит, уже при 70°С.

Известны штаммы-продуценты «-амилазы: В.subtilis BRB89, В.subtilis BRB360 и В.subtilis BRB361. Штамм В.subtilis BR889 содержит фрагмент ДНК, кодирующий а

О

со со

амилазу из Bacillus amyloliquefaclens, и идентичен штамму B.subtilis (pRT5). B.subtilis BRB360 и B.subtilis BRB361 содержат плазмиды со слитым геном а-амилаза В.amyloliquefaclens - а-амилаза B.licheniformis и обеспечивают синтез фермента с термостабильностью не хуже термостабильности фермента из B.licheniformis. Однако место стыковки последовательностей, кодирующих сигнальный пептид и зрелую форму а -амилазы не является оптимальным по структуре, поэтому продукция термостабильного белка составляет лишь 17% от продукции мезофильной а- амилазы (из B.amylollquefaclens) в подобной конструкции. Штамм BRB360 рассматривают в качестве аналога по сходству в методе конструирования, структуре фрагмента ДНК, кодирующего термостабильную а. -амилазу, и термостабильности получаемого белка.

Известен штамм-продуцент «-амилазы с повышенной температурой инактивации, в котором произведены мутации гена а-амилазы B.amyloliquefaclens в области ответственной за термостабильность белка. Термостабильность белка увеличена на 13 градусов, что однако на 7 градусов ниже термостабильности а- амилазы B.licheniformis.

Целью изобретения является повышение термостзбильности целевого продукта.

Цель достигается использованием фрагмента ДНК ALV7,

Фрагмент ДНК ALV7 кодирует синтез термостабильной а -амилазы. Этот фрагмент получают подстыковкой фрагмента ДНК, кодирующего зрелую форму а-амилазы Bacillus ilchenlformis к фрагменту ДНК, содержащему регу- ляторные элементы (промотор, область связывания с рибосомой) гена а-амилазы в B.amylolfquefaciens и кодирующему сигнальный пептид а-амилазы B.amyloliquefaciens, из плазмиды pRT5.

Фрагмент ДНК ALV7 кодирует синтез термостабильной а -амилазы и содержит регуляторные области гена а-амилазы B.amyloliquefaciens: промотор (нуклеотиды 200-270), область связывания с рибосомой {нуклеотиды 1055-1070) и кодирует сигнальный пептид а-амилазы B.amyloliquefaciens (нуклеотиды 1077-1169) и зрелую форму - амилазы Bacillus lichenrformis (нуклеотиды 1173-2624).

Фрагмент ДНК ALV7 кодирует синтез белка, оптимизированного по структуре области процессинга сигнального пептида, обладающего структурой и термостабильностью а-амилазы B.llcheniformls. Для каждого фрагмента ДНК представлена также кодируемая им аминокислотная последовательность. Последовательности BRB360 и

ALV 7 кодируют полноразмерную зрелую форму термостабильной а-амилазы B.licheniformis. однако BRB 360 имеет область стыковки, различающуюся на 9 нукле- отидов (соответственно аминокислоты:

валин. аспарагин и глицин), в то время как ALV 7 только 3 нуклеотида, соответствующие аминокислоте аланин. Наличие алани- на в месте стыковки наиболее эффективно, так как эта же аминокислота является лоследней аминокислотой сигнального пептида а-амилазы В.licheniformfs.

Для достижения цели используют способ конструирования фрагмента ДНК ALV7, кодирующего синтез термостабильной аамилазы, заключающийся в том, что ДНК плазмиды pVS1 гидролизуют эндонуклеаза- ми рестрикции EcoRI и Bgfti, достраивают однонитевую ДНК до двунитевой Кленовым фрагментом ДН К полимеразы 1 Е.соИ, затем

смешивают с EcoRI линкером, имеющим последовательность GGAATTCC, обрабатывают ДНК-лигазой фага Т4, полученной смесью трансформируют клетки B.subtilis известного штамма 21recE4amy4 трансформанты высевают на среду с эритромицином, из полученных трансфорМантов выделяют плазмидную ДНК и гидролизуют эндонукле- азой рестрикции EcoRI и экзонуклеазой Ва{31, продукты гидролиза обрабатывают

Кленовым фрагментом ДНК полимеразы 1 Е.соИ и ДНК-лигазой фага Т4, трансформируют клетки В.sub-tills штамма 21recE4amy4, трансформанты высевают на среду с эритромицином и амилопектиназуром и отбирают клоны, продуцирующие el- амилазу. Выбор штамма B.subtilis 21recE4amy4 в качестве реципиентного обусловлен тем, что этот штамм имеет мутацию в хромосомном гене а -амилазы и соответственно может продуцировать только а-амилазу, кодируемую рекомбинантной плазмидой. Анализ нуклеотидной последовательности ДНК полученных плазмид позволяет выявить плазмиду, содержащую

фрагмент ДНК со структурой ALV7. Плазми- да. содержащая этот фрагмент и сконструированная по предлагаемому способу, является плазмидой pLV7. Особенность фрагмента ALV7 состоит в том, что он крдирует оптимизированный синтез термостабильной а-амияазы. Плазмидная ДНК pLV7, полученная таким способом, содержит последовательность ALV7, которая может быть изолирована на Hindlll фрагменте ДНК

и перенесена на любой вектор, имеющий Hlndlll сайт для клонирования фрагментов ДНК и способный реплицироваться в клетках бацилл.

Для достижения цели используют штамм B.subtilis ВКПМ В-4766-продуцент термостабильной а-амилазы. Штамм получают трансформацией клеток B.subtilis 21recE4amy4 плазмидой pLV7.

Полученный штамм депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов и имеет регистрационный номер ВКПМ В-4766.

Штамм B.subtilis ВКПМ В-4766характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки.

Клетки прямые, палочковидной формы 1,2-1,6x2,0x6,0 мкм, подвижные, грамполо- житёльные, спорообразующие.

Культуральные признаки.

Клетки хорошо растут на простых питательных средах.

При росте на мясо-пептонном агаре, питательном агаре Дифко колонии шероховатые, круглые, прижаты, серые, край неровный, мутные.

При росте в жидких средах: мясо-пептонном бульоне, L-бульоне образуют ровную интенсивную муть.

Физиолого-биохимические признаки.

Клетки растут в пределах от 10 до 50°С при оптимуме рН от 6.5 до 8,0.

В качестве источника углерода используют многие углеводы, спирты, органические кислоты, в частности: D-глюкозу, D-фруктозу, глицерин, сахарозу. Хорошо усваивают крахмал.

В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной и нитратной форме, так и в органической форме в виде пептона, аминокислот.

Нитраты восстанавливают до нитритов. Желатину разжижают.

Устойчивость к антибиотикам.

Проявляется устойчивость к эритроми- цину, обусловленная наличием плазмиды pLV7.

На среде с амилопектиназуром образуют вокруг колоний зоны гидролиза.

Предлагаемый штамм B.subtilis ВКПМ В-4766, содержащий рекомбинантнуюплаз- миду pLV7, полученную на основе фрагмента ALV7, характеризуется более высокой термостабильностью продуцируемой а- амилазы, по сравнению с известным B.subtilis ВКПМ В-4632. Эффект получен за счет того, что в предлагаемом фрагменте ДНК ALV7 произведена оптимальная подстыковка последовательности ДНК, кодирующей полную зрелую часть а-амилазы B.licheniformis к последовательности, кодирующей сигнальный пептид а-амилазы B.amyloliquefaciens.

Известный фрагмент amyamyllchl получен заменой в последовательности ДНК, кодирующей мезофильную а-амилазу B.amyloliquefaciens, 128 нуклеотидных остатков на гомологичный фрагмент, кодирующий часть термофильной а-амилазы B.licheniformis. В результате произведенной мутации фрагмент ДНК amyamylichl обеспечивает синтез и секрецию а-амилазы с термостабильностью, увеличенной на 13 градусов, что однако на 7 градусов ниже термостабильности а-амилазы B.licheniformis. а-Амилаза, кодируемая предлагаемым фрагментом ДНК ALV7, по своим свойствам (молекулярная масса, термостабильность, рН-оптимум) не отличается от а -амилазы B.Hcheniformis. После прогрева культуральной жидкости штаммов, продуцирующих а-амилазу, при 90°С в течении 45 мин сохраняется 95% амилазной активности при использовании штамма B.subtilis ВКПМ-4766 и только 5% - при использовании известного B.subtilis ВКПМ- 4632.

Выход белка при использовании штамма B.subtiHs ВКПМ-4766 такой же как и в случае известного B.subtilis ВКПМ-4632 - 15мг/л в условиях ферментации по примеру 3.

Сравнение продуктивноетей штамма B.subTiiis ВКПМ-4766 С аналогом BRB 360 приведено в табл. 1 и 2. Поскольку из-за недоступности аналога не имеется возможности произвести прямые измерения, сравнение произведено косвенно, по литературным данным, через штаммы B.subtilis BRB89 и B.subtilis (pRT5), являющихся исходными соответственно для штаммов B.subtHfs BRB360 (аналога) и предлагаемого штамма B.subtilis ВКП1И- 4766. Штаммы B.subtilis BRB89 и B.subtiHs (pRT5) содержат фрагменты ДНК. выделенные из B.amyioUquefacJens и обеспечивают синтез мезофильной а-амилазы, направляемой собственными регуляторнымй элементами, поэтому их активность принята за 100%. Штаммы B.subtlHs BRB360 и В-4766 содержат фрагменты ДНК, полученные на основе фрагментов ДНК из соответственно штаммов B.subtilis BRB89 и B.subtiHs (PRT5),

Определение активности а-амилазы производят известным способом. Температурный оптимум для а -амилазы, кодируемой фрагментом ДНК ALV7, составляет

. Меньшая продуктивность штамма, синтезирующего термостабильную а-амилазу связана с меньшей удельной активностью термостабильного белка из B.ticheniformis. измеренной в неоптимальных условиях (37°С).

П р и м е р 1. Конструирование фрагмента ДНК ALV7, кодирующего синтез термостабильной о;-амилазы.

Клетки бактерий B.subtilis (pVS1), содержащие ллазмидную ДНК pVS1, выращивают в 10 мл L-бульона (триптон 10 г/л; дрожжевой экстракт 5 г/л; NaCMO г/л; рН 7,5) с добавлением эритромицина (0,02 мг/мл} до титра 1x10 кл/мл. Клетки осаждают центрифугированием (5000д, 5 мин, 4 С°) и ресуспендируют в 0,t мл лизирующего раствора (лизоцим 2 мг/мл; трис-HGI (рН 8,0) 25 мМ; ЭДТА 10 мМ; глюкоза 50 мМ), выдерживают 5 мин при 0°С. Далее прибавляют 0.2 мл раствора (NaOH 0,2 М; додецилсульфата натрия 1%) и перемешивают до просветления лизата 150 мкл раствора уксуснокислого натрия (рН 4,8) вносят в осветленный лизат, осторожно перемешивают до заметного снижения вязкости (: створа, выдерживают 1 ч при 4°С и образовавшийся осадок отделяют центрифугированием {1000 д. 5 мил, 4°С). К полученному супернатанту добавляют 2,5 объема охлажденного при -40°С этилового спирта и выдерживают при -40°С. Образовавшийся осадок плазмидной ДНК собирают центрифугированием (5000 д, 5 мин, 20 С°) и ресуспендируют в 0,2 мл буфера (10 мМ трис-HCI (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА).

ДНК плазмиды hVS1 подвергают гидролизу эндонуклеазами рестрикции EcoRI и Bgtll в буфере, содержащем 50 мМ трис-НСГ (рН 7.6), 50 мМ NaCI, 10 мМ MgCl2, 1 мМ 2-меркаптоэтанол. Липкие концы полученных фрагментов достраивают до двуни- тевой ДНК Кленовым фрагментом ДНК полимеразы 1 Е.соИ в буфере, содержащем 50мМтрисНС1{рН7,5), 10мММдС12,10 мМ ДТТ, 10 мкг/мл АТФ, затем обрабатывают ДН К-лигазой фага Т4 в буфере, содержащем 50 мМ трис HCI (рН 7,5), 10 мМ MgChz, Ю мМ ДТТ. 10 мкг/мл АТФ, и смесью рекомбинан- тных молекул трансформируют компетент- .ные клетки B.subtilis 21recE4amy4, трансформанты высевают на агаризован- ную среду LB С эритромицином. ДНК плазмиды. выделенной из клеток-трансформантов, подвергают гидролизу эндонуклеа- зой рестрикции EcoRI, и в. буфере, содержащем 20 мМ трис 8.1), 12,5 мМ MgCl2, 12,5 мМ CaCl2, 0,6 М NaCI, 1 мМ ЭДТА, - экзонуклеазой ВаЙ1. После обработки ДНК Кленовым фрагментом ДНК полимеразы 1 E.coli и ДНК-лигазой фага Т4, полученной смесью трансформируют клетки B.subtilis 21recE4army4, трансформахты

высевают на среду с эритромицином и ами- лопектиназуром и отбирают клоны, ,проду- цирующие а -амилазу. Плазмидную ДНК, выделенную из клеток-трансфо мантое проверяют на наличие в сЪставе большего

0 Htndtll фрагмента последовательности ALV7. Анализ последовательности ДНК проводят методом дидезокситерминаторов Сэнгера.

П р и м е р 2. Получение штамма

B.subtilis ВКПМ В-4766.

Ночную культуру клеток B.subtiUs 21 гесЕ4аглу4 разводят в 10 раз в 10 мл бульона Спицайзена (К2НР04 18,3 г/л; КН2Р04 6 г/л; ( 2 г/л; натрий лимоннокис0 лый 1,2 г/л; глюкозы 0,5%; казаминовых кислот 0,2 г/л; дрожжевого экстракта 1 г/л; MgS04 50 мг/л) и культивируют 4Ј ч при 37°С с аэрацией. 1 мл полученной куяьтуры смешивают с 6 мл бульона Спицайзена и

5 культивируют в тех же условиях 1,5ч, К f мл полученных компетентных клеток добавляют ДН К плазмидь pLV7, инкубируют 30 мин при 37°С без встряхивайия, разводят в два раза средой LB .(трмптон 10г /л; дрожжевой

0 экстракт 5 г/л;.МаС110 г/л; рН 7,5)с добавлением эритромицина (0,02 мг/мя) и культивируют 30 мин при интенсивной аэрации при 37°С. Транеформанты высевают йа агаризоеаниую среду LB с эритромицином

5 (20 мг/мл) и амилопёктйназуром (0,15%). Отбор трансформантов производят по наличию зон гидролиза амйлопектиназура. Клетки, полученные таким образом, несут плазмиду pLV7 и являются кл$тками штам0 ма B.subtitts 8КПМ 8-4766.

П р и м е р 3. Ферментация штамма B.subtHis ВКПМ В-4766. получение термостабильной а -амилазы и оценка ее термоста6wibHOCfM. u

5 Культуру штамма B.subtiflS ВКПМ-4766 засевают петлёй в пробирку со средой LB (триптон 10 г/л; дрожжевой экстракт 5 г/л; NaCI 10 г/л; рН 7,5) с добавлением эритромицина (20 мг/мл) и выращивают при 37-С

0 в течение ночи при сильной аэрации. Ночную культуру разводят в 100 раз средой LB с добавлением мальтозы (до 2%), CaCl2 (до ЮмМ), (до 10 мМ) и эритромицина (до 20 мг/мл) в объеме 250 мл и проводят фер5 ментацию в течении 48 ч при 37°С в колбах при интенсивной аэрации. По окончании ферментации клетки осаждают центрифугированием (ЮОООд, 15 мин), а в надосадочной жидкости проверяют уровень амилолитиче- ской активности по стандарту. Активность

фермента, полученного таким образом, по-точникоо, таких, например, как а-амилаза

вышается до 0,8 ед/мл.B.licheniformis. что позволяет проводить

Для проверки термостабильности а-гидролиз крахмала при 85-95°С без потери

амилазы, синтезируемой клеткамиего активности и при 105°С (при повышенB.subtilisBKnM-4766, ЮОмклсупернатанта 5ном давлении) в течение времени, необхоклеток делят на 4 части и прогревают 0, 15,димого для разжижения крахмала.

30 и 45 мин при 90°С. Затем определяютПолученный положительный эффект

активность а -амилазы, для чего образцыпредлагаемых изобретений достигается за

инкубируют с 300 мкл 1%-ного растворасчет свойств сконструированного фрагменамилолектиназура, 0,03 М AcNa, рН 8,0. 4 юта ДНК ALV7, кодирующего синтез термомМ CaCl2 при 37°С в течение 30 мин. Затемстабильной а -амилазы. Предлагаемый

раствор разбавляют до 1,3 мл водой, цент-фрагмент ДНК позволяет также конструирорифугируют при 12000 об/мин и проверяютвать штаммы других микроорганизмов, крооптическую плотность супернатанта приме B.subtilis, продуцирующие термоста600 нм. Она должна быть одинаковой у каж- |5бильные а -амилазы

дои пробы, что свидетельствует о термоста-Формула изобретения

бильности фермента, кодируемого1. Фрагмент ДНК ALV7, кодирующий

фрагментом ALV7.синтез альфа-амилазы, содержащий регуляПредлагаемые изобретения позволяютторные элементы гена а-амилазы

повысить термостабильность а-амилазы, сек- 20B.amylollquefaciens и структурную часть геретируемой клетками B.subtilis. Термоста-на а-амилазы B.lichenfformls с нуклеотидбильность продуцируемого фермента неной последовательностью фрагмента ДНК

отличается от термостабильности лучшихALV7: ферментов, выделенных из природных исgatcatccgcaaagggcgcattcaagtatcagtatcaacaagcggggcaa 50 geaccccgcataggaaaagactggctgaaaacattgagcctttgatgact 100 gatgatttggctgaagaagtggatcgattgtttgagaaaagaagaagacc 150 ataaaaataccttgtctgtcatcagacagggtattttttatgctgtccag 200 . actgtccgctgtgtaaa.aataaggaataaaggggggttgttattatttta 250 ctgatatgtaaaatataatttgtataagaaaatgaggta.atgactceaac 300 ttattgatagtgttttatgttcagataatg;cccgatgactttgtcatgca 350 gctccaccgattttgagaacgacagcgacttccgtcccagccgtgccagg 400 tgctgcctcagattcaggttatgccgctcaattcgctgcgtatatcgctt 450 gctgattacgtgcagctttcccttcaggcgggattcataeagcggccagc 500 catccgtcatcca tatcaccacgtcaaagggtgacagcaggctcataaga 550 cgccccagcgtcgccatagtgcgttcaccgaatacgtgcgcaacaaccgt 600 cttccggagactgtcatacgcgtaaaacagccagcgctggcgcgatttag.650 ccccgacatagccccactgttcgtccatttccgcgcagacgatgacgtca 700 ctgcccggctgtatgcgcgaggttaccgectgeggcctgagttttttaag 750 tgacgtaaaatcgtgttgaggccaacgcccataatgcgggctgttgcccg 800 gcatccaacgccattcatggccatatcaatgattttctggtgcgtaccgg 850 gttgagaagcggtgtaagtgaactgcagttgccatgttttacggGagtga 900 gagcagagatagcgctgatgtccggcggtgcttttgccgttacgcaccac 950 cccgtcagtagctgaacaggagggacagctgatagaaacagaagccQctg 1000 gagcacctcaaQQQCQCcatcatacactaaatcagtoagbtggcncjcQt.c 30130 ассадааааtgagagggagaggaaacatgattcaaaaacgaaagcggacn 1100 gtttcgttcagacttgtgcttatgtgcacgctgttatttgtcagtttgcc H50 gattacaaaaacatcagcggcggcaaatcttaatgggacgctgatgcagt 1200

n171763312

attttgaatggtacatgcccaatgacggccaacattggaagcgcttgcaa 1250

aacgactcggcatatttggctgaacacggtattactgccgtctggattcc 1300

cccggcatataagggaacgagccaagcggatgtgggctacggtgcttacg 1350

acctttatgatttaggggagtttcatcaaaaagggacggttcggacaaag 1400

tacggcacaaaaggagagctgcaatctgcgatcaaaagtcttcattcccg 1450

cgacattaacgtttacggggatgtggtcatcaaccacaaaggcggcgctg 1500

atgcgaccgaagatgtaaccgcggttgaagtcgatcccgctgaccgcaac 1550

cgcgtaatttcaggagaacaccgaattaaagcctggacacattttcattt 1600

tccggggcgcggcagcacatacagogattttaaatggcattggtacoatfc 1650

ttgacggaaccgattgggacgagtcccgaaagctgaaccgcatciaLaag 1700

tttcaaggaaaggcttgggattgggaagtttccaatgaaaacggcaacta 1750

tgattatttgatgtatgccgacatcgattatgaccatcctgatgtcgcag 1800

cagaaattaagagatggggcacttggtatgccaatgaactgcaattggac 1850

ggtttccgtcttgatgctgtcaaacacattaaattttcttttttgcggga 1900

ttgggttaatcatgtcagggaaaaaacggggaaggaaatgtttacggtag 1950

ctgaatattggcagaatgacttgggcgcgctggaaaactatttgaacaaa 2000

acaaattttaatcattcagtgtttgacgtgccgcttcattatcagttcca 2050

t /cgtcatcgacacagggaggcggctatgatatgaggaaattgctgaaca 2100

gtacggtcgtttccaagcatccgttgaaagcggttacatttgtcgataac 2150

catgatacacagccggggcaatcgcttgagtcgactgtccaaacatggtt 2200

taagccgcttgcttacgcttttattctcacaagggaatctggataccctc 2250

aggttttctacggggatatgtacgggacgaaaggagactcccagcgcgaa 2300

attcctgccttgaaacacaaaattgaaccgatcttaaaagcgagaaaaca 2350

gtatgcgtaaggagcacagcatgattatttcgaccaccatgacattgtcg 2400

gctggacaagggaaggcgacagctcggttgcaaattcaggtttggcggca 2450

ttaataacagacggacccggtggggcaaagcgaatgtatgtcggccggca 2500

aaacgccggtgagacatggcatgacattaccggaaaccgttcggagecgg 2550

ttgtcatcaattcggaaggctggggagagtttcacgtaaacggcgggtesf 2600

gtttcaatttatgttcaaagatagaagagcagagaggacggatttcctga 2650

aggaaatccgtttttttattttgcccgtcttataaatttctttgattaca 2700

ttttataattaattttaacaaagtgtcatGagccctcaggaaggacttgc 2750

tgacagtttgaatcgcataggtaaggcggggatgaaatggcaacgttatc 2800

tgatgtagcaaagaaagcaaatgtgtcgaaaatgaeggtatcgcgggtga 2850

tea.

2 Способ конструирования фрагментазой фага Т4, полученной смесью

ДНК ALV7 кодирующий синтез альфа-ами-трансформируют клетки B.subtHfs штамма

лазы заключающийся в том, что ДНК плаз-21 . recE4amy4, трансформанты высевают

миды pVS1 гидролизуют зндонуклеазами55 на среду с эритромицином, из полученных

рестрикции EcoRI и Bg0I, достраивают кон-трансформантов выделяют плазмидную

цы ДНК до двунитевых Кленовым фрагмен-ДНК, гидролизуют эндонуклеазой рестриктом ДНК полимеразы 1 Е.соЙ, смешивают с. ции EcoRl и экзонуклеазой Bat231. продукEcoRI линкером, имеющим последователь-ты гидролиза обрабатывают Кленовым

ность GGAATTCC. обрабатывают ДНК-лига-. . фрагментом ДНК полимеразы 1 Е.соб и

ДНК-лигазой фага Т4, полученной смесью трансформируют клетки B.subtills 21recE4amy4, трансформанты высевают на среду с эритромицином и амилопектиназу- ром, отбирают клоны, продуцирующие аамилазу, из которых выделяют плазмидную ДНК, включающую фрагмент ДНК ALV7.

3. Штамм бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-4766-продуцент а- амилазы.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и генетической инженерии. Целью изобретения является повышение термостабильности целевого продукта. Фрагмент ДНК ALV 7 сконструирован на основе фрагмента ДНК, кодирующего структурную час.ть гена а-амилазы B.licheniformis и фрагмента ДНК, содержащего регуляторные элементы а-амилазы B.amyloliquefaciens. Фрагмент ALV 7 кодирует синтез «-амилазы, термостабильность которой достаточна для промышленного применения. Разработан способ конструирования фрагмента ДНК, кодирующего синтез термостабильной а -амилазы клетками Bacillus subtilis. Получен штамм Bacillus subtilis ВКПМ В-4766, являющийся продуцентом термостабильной а-амилазы. 3 с.п. ф-лы. 2 табл. k

Таблица 1

Таблица 2