Способ определения иммуногенной активности вакцины против сибирской язвы крупного рогатого скота Советский патент 1993 года по МПК A61K39/00 

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к способам оценки эффективности средств специфической профилактики сибирской язвы с.х, животных.

Известен способ определения иммуно- генной активности противосибиреязвенной вакцины СТИ путем контрольного подкожного заражения споровой культурой вирулентного штамма возбудителя сибирской язвы иммунизированных морских свинок (ГОСТ 15991-86) и овец (ГОСТ 15991-71) и подсчетом количества выживших животных.

Однако известный способ, выполненный на лабораторных животных и овцах и эмпирически экстраполированный на крупный рогатый скот, не позволяет достоверно оценить эффективность средств иммунопрофилактики сибирской язвы у крупных жи- вотных, поскольку при контрольном подкожном заражении даже неиммунизированного крупного рогатого скота возбудителя сибирской язвы, получить летательный эффект не удается.

Учитывая, что смертельное заражение животных возбудителем сибирской язвы в естественных условиях (на пастбище) происходит через корм (перорально), испытывают пероральный метод контрольного заражения крупного рогатого скота, который бы обеспечивал 100%-ный летальный эффект у интактных (неиммунных к сибирской язве) животных. В случае разработки метода используют его для оценки эффективности испытуемых сибиреязвенных вакцин на крупном рогатом скоте.

Целью изобретения является разработка надежного и достоверного способа определения иммуногенной активности вакцины против сибирской язвы на крупном рогатом скоте.

Для этого осуществляют пероральное введение животным инкапсулированной суспензии спор вирулентного штамма воз(Л

С

00 Ю

Ю

00

будителй сибирской язвы с кормом до и после применения вакцины против сибирской яэвы и эффект оценивают по критерию ПЗ (процент защиты).

Способ оценки эффективности испытуемой противосибиреязвенной вакцины на крупном рогатом скоте состоит из следующих этапов;.

1. Иммунизация животных испытуемыми вакцинами против сибирской язвы.

2. Перрральное заражение контрольных (неиммунизированных) и иммунизированных животных возбудителем сибирской язвы в дозах, обеспечивающих 100%-ый летальный эффект у неиммунизированных животных.

3. Оценка эффективности испытуемой вакцины по критерию ПЗ (процент защиты).

На 1-ом этапе проводят отбор животных одинакового возраста (молодняк от 3 до 6 месяцев) или взрослых животных (12 месяцев и старше), формируют из них соответствующие группы (по 6 голов в каждой).

Одну группу животных подкожно иммунизируют испытуемой противосибиреязвенной вакциной (инструкция по применению препарата), а другую группу Животных не иммунизируют, она служит кбнтрблём. Животных обеих трупп содержат в одинаковых условиях.

2-ой этап. По истечении соответствующего поствакцинального периода (через 15, 21, 30 дней, 2, 3, 8, 9, 12 месяцев после иммунизации в зависимости от условий и задачи исследования) животных подвергают контрольному пероральному заражению вирулентным штаммом возбудителя сибирской язвы. Пероральный метод заражения включает следующие подэтапы:

а) приготовление инфекционного материала;

б) оп рёйёттение концентрации и жизнеспособных спор;

в) инкэпсулирование инфекционного материала и введение его животным через рот (перорально).

Для приготовления инфекционного материала споровую культуру вирулентного референс-штамма возбудителя сибирской язвы 4-7 высевают на обычные питательные среды (МПА и МПБ), выращивают 18-24 ч при 3Ј,5-37,5°С. Выросшие культуры идентифицируют согласно общепринятым в микробиологии сибирской язвы методам (морфология, подвижность, капсулообразо- вание, спорообразование).

Для спорообраэования культуру, выращенную в термостате при Зб,5-37,5°С в течение 18-24 ч, в последующем инкубируют

0

5

до полного спорообразования в термостате при 32-33°С.

По истечении 5-6 дней выдерживания в термостате при 32-33°С исходная культура обычно превращается в споровую (95-98% спор), которая является пригодной для дальнейшего использования. Степень спорообразования и концентрацию живых спор в культуре определяют согласно ГОСТу 15991-86, используя оптический стандарт мутности ГИСК им. Л.А. Тарасовича № 10.

Инкапсулирование заражающего материала проводят следующим образом.

Исходную суспензию спор разводят стерильным физиологическим раствором до концентрации 0,5x109 спор/мл. Суспензию набирают в стерильные пипетки объемом 1-2 см3 и вносят ее по 0,5 см3 в быстрорастворимые желатиновые капсулы, употребля0 емые в медицинской практике для внутреннего применения лекарственных препаратов, выпускаемых отечественной промышленностью. Капсулы представляют собой желатиновые цилиндры емкостью

5 0,6-0,9 см3, диаметром 7-10 мм и высотой 22-30 мм.

Для предотвращения преждевременного растворения капсул в ротовой полости животного и вторичного рассеивания спор

0 возбудителя сибирской язвы капсулы заключают в куски хлеба размером (5x5)- (10x10) см.

Куски хлеба, содержащие инкапсулированные споры в дозе 0,25x109 спор каждый,

5 скармливают животным по 3 куска на голову. Суммарная доза спор при этом составляет 0,75х109 спор на одну голову, что является оптимальной, вызывающей 100%- ный летальный исход неиммунизированных

0 (контрольных) животных. Скармливание животным хлеба с инкапсулированным споровым материалом производят до приема ими кормов и воды.

На 3-ем этапе проводят оценку эффек5 тивности испытуемой противосибиреязвенной вакцины по критерию ПЗ (процент защиты). Для, этой цели используют три группы крупного рогатого скота одинакового возраста и породы. Одну группу живо0 тных (6 голов) иммунизируют стандартной протвосибиреяэвенной вакциной СТИ, вторую (6 голов) - испытуемой вакциной (ВГНКИ, ВНИИВВиМ и т.д.) согласно инструкциям по применению биопрепаратов,

5 третью группу животных (3 головы) не иммунизируют и она служит контролем.

Через определенный промежуток времени (15. 21, 30 дней, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев после иммунизации) животных всех трупп (вакцибнированных и невакцинированных)

заражают пероральнЪ референтным штаммом возбудителя сибирской язвы в абсолютно смертельной дозе (,75х109 спор). За всеми животными ведут наблюдение в течение всего периода, изучая у них клинику/ измеряя температуру тела, пульс, дыхание. Учитывают количество павших и выживших в каждой группе животных.

.Эффективность испытуемой вакцины оценивают по критерию ПЗ (процент защиты), используя формулу

. .; - :: - .

где ПЗ-процент защиты,

Кп - количество выживших животных, гол.; . , .,. / .-:; Ки - количество использованных в опытах животных, гол.;

100 - коэффициент перевода в проценты. : ...:.- ... .; - ;:: : :

Так, если в группе животных, иммунизированных противосибиреязвенной вакциной СТЙ, выжили 5 голов из 6, использованных в опыте, то подставляя .соответствующие значения в приведённую формулу, получаем П3 83,4%.. ; -:

Пример. Определяют абсолютно смертельные дозы возбудителя сибирской язвы при пероральном введении его неиммунизированному против сибирской язвы крупному рогатому скоту. Для этой цели суспензию спор возбудителя разливают в желатиновые капсулы по 0,10; 0,15; 0,20; 0,25; 0,30; 0,45; 0,50 х 109 спор в 1 см3, капсулы заключают в куски хлеба и скармливают животным по одному, два и три куска на голову. За животными ведут наблюдение в течение 7 суток, при этом учитывают количество павших животных от каждой дбзы. Факт гибели животных от сибирской язвы определяют путем приготовления мазков крови из надреза уха павших животных и микроскопиро- вания их в световом и люминесцентном микроскопе.

: Результаты опытов по определению оптимальной дозы пёрорального заражения крупного рогатого скота спорами возбудителя сибирской язвы представлены в табл. 1. Из материалов таблицы видно, что пе- роральное введение спор возбудителя в один прием даже в больших дозах (0,90-1,80 млрд спор ) не дает 100% - го летального эффекта, в то время как введение дозы 0,75x109 спор в три приема (в 3-х кусках) обеспечивает 100%-ый летальный эффект. Таким образом, абсолютно смертельная доза спор возбудителя сибирской язвы для крупного рогатого скота при пероральном

заражении составляет (0,75-0,90)х109 спор на животное.

П р и м е р 2. Проводят оценку эффективности однократной подкожной иммуни- 5 зации крупного рогатого скота стандартной противосибиреязвенной вакциной СТИ путем пёрорального заражения животных через 15, 21, 30 дней или через 2, 3, 6, 9, 12 месяцев после иммунизации спорами воз0 будителя сибирской язвы в абсолютно смертельной дозе Л Д ,75х109 спор. Животных иммунизируют в одинаковом возрасте (3-6 месяцев или 6-12 месяцев) в соответствии с существующими инструкциями по

5 применению биопрепарата, Группу контрольных животных не иммунизируют, но содержат их (иммунизированных и неиммунизированных) в идентичных условиях, обеспечивающих одинаковое кормление,

0 поение, уход и т.д.

Результаты проверки эффективности однократной подкожной иммунизации 3-4- месячного молодняка крупного рогатого скота противосибиреязвенной вакциной

5 СТИ, перорально, зараженного через 15 дней, 7 и 13 месяцев после вакцинации, представлены в.табл. 2.

Из табл. 2 видно, что стандартная про- тивосибиреязвенная вакцина СТИ, введен0 мая крупному рогатому скоту подкожно в возрасте 3-4 месяцев однократно, создает напряженный иммунитет через 15 дней, через 6-7 месяцев у однократно привитых вакциной СТИ молодняка иммунитет

5 ослабляется (ПЗ не более 67%), у взрослых животных, однократно иммунизированных вакциной СТИ, вырабатывается достаточно высокий противосибиреязвенный иммунитет ().

0 ПримерЗ. Проводят сравнительную оценку эффективности предлагаемой противосибиреязвенной (штаммы ВГНКИ, ВНИИВВиМ-55 и т.д.) и стандартной вакцины СТИ. Опыты проводят также, как и в

5 примере 2, но лишь с той разницей, что в

опыт берут три группы крупного рогатого

скота: контрольная (невакцинированная),

иммунизированная стандартной вакциной

СТИ и вакцинированная испытуемой проти0 восибиреязвенной вакциной (ВГНКИ, ВНИ- ИВВиМ-55). Иммунизацию животных одинакового возраста проводят в соответствии с инструкциями по применению препаратов, кормление и уход - в идентичных

5 условиях, пероральное заражение животных осуществляют по примеру 2.

По результатам.опыта учитывают ПЗ и определяют преимущества или недостатки предлагаемой противосибиреязвенной вакцины. Опыты Показывают, что однократное

применение вакцины СТИ обеспечивает надежный противрсибиреязвенный иммуйи- тет у взрослого крупного рогатого скота в течение 13;Тмёсяцёв по еле вакцинаийй;;что свидетельствует о нецелесообразности дву- кратной иммунизации взрослого поголовья указанного вида животных против сибирской язвы. В отличие от взрослых животных молодняк крупНогЬрогатбго скота, йММунй- зированный однократно вакциной СТИ, не приобретает достаточного напряжейЙогО иммунитета против сибирской язвы (ПЗ через 7 месяцев после применений вакцины СТИ не превышает 67%), что предполагает проведение повторной вакцинации (ревак- цинации) мрлрднякйГб этом 6зрасте.

Технико-экономические преимущества предлагаемого способа пЬ7сравнёнйю с прототипом заключаются в следующем:

1. Применение перорального контроль- ного заражения крупного рогатого скота в предлагаемом способе обеспечивает 100%- ую гибель контрольных (невакцинированных) животных, что позволяет достоверно, а /не экстраполяцибнно, как в известном brio- србе, оценить эффективность испытуемой противосибиреязвенной вакцины.

2. Предлагаемый способ позволяет разработать, рациональную схему применения противосибиреязвенной вакцины СТИ на крупном рогатом скоте, которая в настоящеевремя применяется двукратно без учета возраста, чтб предполагает перерасход трудовых и материальных средств.

3. Применение дифференциальной схемы иммунизации вакциной СТИ с учетом результатов контрольного перорального заражения иммунизированных животных в различные периоды после применения вакцины позволит сэкономить значительное количество трудовых и материальных затрат, если учесть, что в настоящее время в стране согласно существующей схеме подвергаются двукратной вакцинации СТИ десятки миллионов голов крупного рогатого скота, значительную часть которых составляет взрослое поголовье. Переход на однократную иммунизацию вакциной СТИ взрослого крупного рогатого скота, обоснованный результатами испытания предлагаемого способа, позволит сэкономить 50% выпускаемой отечественной биопромышленностью дорогостоящей противосибиреязвенной вакцины СТИ. .....

Использование: ветеринария, оценка средств профилактики, сибирская язва. Сущность изобретения: до и после применения испытуемых средств специфической профилактики сибирской язвы животным перорально с кормом вводят инкапсулированную суспензию спор вирулентного штамма возбудителя сибирской язвы в дозе (0.75 ,90 Ю9) спор. Суспензию спор инкапсулируют в желатиновую капсулу и закладывают в кусок хлеба размером (5x5)-

Ф6рмул а изо брётени я : Способ определения йммуногенной активности вакцины против сибирской язвы крупного рогатого скота, включающий иммунизацию животных исследуемой вакциной с последующим заражением споровой культурой возбудителя и оценкой результатов по количеству ёы кившй животных, от л и ч а ющ и и с я тем, что, с целью повыше30

ния достоверности способа, иммунизируют крупный рогатый скот, а заражение осуществляют пёрорально споровой культурой в дозе 0,75 109 - 0,90 -109 спор, заключенной в быстрорастворимую желатиновую капсулу, заложенную в кусок хлеба размером 5x5- 10x10 см.

40

Таблица 1

1789218

10 Таблица 2