Способ определения токсичности водорастворимых веществ Советский патент 1993 года по МПК C12N5/00 G01N33/18 

Изобретение относится к способам определения биологической активности соединений в водной фазе и может быть использовано в токсикологии, охране окружающей среды, экологии, химико-фармакологической промышленности, при санитарнр-гигиенических исследованиях в научно-практических учреждениях санитар- но-шгиенического надзора.

Известен способ определения токсичности жидкостей путем обработки токсикан- том микро- и макроводорослей с подсчетом соотношения живых и мертвых клеток и не- кротизированных участков. Известен способ оценки токсичности водорастворимых соединений путем обработки токсикантом культивируемых млекопитающих с последующей инкубацией и определением репродуктивной гибели клеток.

Цель изобретения - упрощение, повышение экономичности и точности Способа

определения токсичности водорастворимых

вещестб. г --- --...... ..........

Способ заключается в следующем. Берут клетки млекопитающих Hela, культивируемые in vttro, помещают в жидкую питательную среду в ра ёной концентрации (20-30 мл/мл) в контрольных и опытных образцах. Выбор такой плотности связан с тем, что повышенйе Пл6ТЙ1бет1й пТ5и вЬ1йТ к снижению точнбсти за счёт сТШ нияrko/ib- ний; при снижении плотности также происходит снижение точности опрёДёлёМй за счет уменьшения эффективности посева. Затем в опытные пробирки с инокулирован- ными добавляют в соотношении 1 : 50-1 : 100 (в мае. %) раствор токсиканта (0,1-0,05 мл раствора испытуемого вещёства, жащего такую концентрацию, которая при

ч

00

о

О1

ся

4D

указанной операции разбавления создает выбранную рабочую концентрацию). В контрольные пробирки в том же соотношении добавляют солевой раствор, используемый для приготовления растворов токсиканта. После этого образцы инкубируют в герметически закрытых сосудах при 37,0-37,5° С в течение времени, необходимого для появления макроколоний, и судят о токсическом действии,соединения при статическом достоверном отклонении числа колоний в присутствии токс иканта по сравнению с контрольным образцом.

Предлагаемый способ определения токсичности водорастворимых веществ имеет явные преимущества перед известным, чувствительность способа повышается в 30 раз. Материалы, представленные в таблице, иллюстрируют достижение цели,

Предлагаемый способ более экономи- мен, так как отпадает необходимость в использовании дорогостоящего оборудования для создания стерильной газовой среды постоянного состава и влажности в термоста- тируемой. камере, более прост, так как не содержит операций, необходимых для создания различных концентраций клеток в опытных и контрольных образцах, а также операций, связанных с внесением токсиканта в физиологическом растворе, а затем заменой раствора на среду культивирования, потому что в предлагаемом способе токсикант вносят непосредственно весь срок инкубации до появления видимых макроколоний.

Пример 1. Для подготовки культуры клеток берут в виде монослоя в стеклянном матрасе емкостью 0,5 л в среде следующего состава: среда 199-45 %, среда Игла 48 %, сыворотка крупного рогатого скота без консерванта 7 %, стрептомицина по 250 ед/мл. На третий день культивирования клетки снимают со стекла 0,25 %-рас- твором трипсина, ресуспендируют в питательной среде, разбивают комки клеток пипетированием, подсчитывают число клеток в 1 мл и готовят суспензию одиночных клеток в культуральной среде с плотностью 20.клеток/мл, по 5 мл суспензии клеток, т, е. 100 клеток на пробу, инокулируют в 10 камер, 5 из них служат контролем, в 5 вносят 5 х м.г процента хлорофоса. Клетки культивируют при 37° С до появления видимых невооруженным глазом макроколоний, затем подсчитывают число выросших колоний в контрольных и опытных камерах. Среднее число колоний в контрольных пробирках 98, + 1,16, среднее число колоний в опытных камерах 82,5 + 1,5, т, е. выживаемость клеток при действии хлорофоса в концентра

й

JO

15

20 25

30

35

40

45

50

55

ции 5 х мг % равна 84,2 % от контроля. Получают нижний предел определения хлорофоса, равный 5 х 10 мг %.

Предлагаемый способ по сравнению с известным имеет повышенную чувствительность при упрощении определения токсичности водорастворимых веществ.

Пример 2. Осуществляют, как пример 1, но в опытные камеры вносят мг % хлорофоса, контрольные и опытные пробы культивируют около 8 дней. Среднее число колоний в контрольных пробирках 98,0 ± 1,6, в опытных 48,2±1,8, т. е. вьркШаёйость равна 46,1 % от контроля, что свидетельствует о высокой токсичности данной концентрации хлорофоса на репродуктивную способность клеток млекопитающих,

При м е р 3. Осуществляют, как пример 1, но в опытные пробирки вносят 5-меток- ситритамин в концентрации 1 х мг %. Среднее число колоний в контрольных пробирках 91,1 ±2,2, в опытных - 42,2 ± 1,4 т, е. выживаемость равна 46,1 %, высокотоксичное соединение.

Прим е р 4. Осуществляют, как пример 1, но в опытные пробирки вносят 2-амиачно- 2-тиазолин мг % и получают выживаемость 49 % по сравнению с контролем.

Пример 5. Осуществляют, как пример 1, но в опытные камеры не вносят токсикант, а производят замену среды на свежую среду того же состава. После образования видимых макроколоний производят их подсчет в опытных и контрольных камерах. В контроле среднее число колоний составляет 82,0 ±6,3, в опытах-74,8 ±5,9, т. е. 91,2 % от контроля. Таким образом, процедуре смены среды приводит к снижению числа колоний порядка 10 %.

П р и м е р 6. Осуществляют, как призер 1, лишь суспензию одиночных клеток берут в концентрации 30 клеток/мл. Выживаемость клеток при действии хлорофоса в концентрации 5x10 мг-% равна 84,1 ±0,1, что свидетельствует о высокой сходимости результатов в диапазоне клеток в концентрации от 20-30 клеток/мл (сравнение с примером 1). Данные об эффективности и посева в этих опытах приведены в. таблице.

Из данных, представленных в таблице, следует, что именно концентрация 20-30 клеток/мл дает допустимую эффективность посева и наглядно иллюстрирует преимущества предлагаемого способа по .сравнению с прототипом.

Температура культиёйрЪванМ для клеток млекопитающих допустима в приведенных пределах. Время культивирования

клеток зависит от токсиканта, поэтому отмечают появление видимых макроколоний (порядка 8-10 дней со дня посева, но не более

12 дней, так как после этого колонии из-за изменения рН сползают со стекла и их невозможно подсчитать).

Использование: токсикология, охрана окружающей среды, экология, химико-фармакологическая промышленность, санитар- но-гигиенического Надзора. Сущность изобретения: клетки млекопитающих, культивируемые Hela, помещают в жидкую питательную среду (20-30 клеток/мл). Туда же добавляют 1 : 50-1 : 100 (в мае. %) раствор токсиканта. Образцы инкубируют до появления макроколоний. 2 табл.

Формула изобретения

Способ определения токсичности водорастворимых веществ, предусматривающий культивирование клеток млекопитающих, внесение суспензии клеток в термостатиру- емые опытные и контрольные камеры на период, необходимый для прикрепления клеток, внесение в опытные камеры исследуемого раствора и инкубацию его с последующей оценкой числа макроколоний в

опытных и контрольных камерах и отнесение исследуемого раствора при достоверном уменьшении количества макроколоний в опытных камерах, отличающийся тем, что, с целю упрощения и повышения точности способа, культивируют клетки человека Hela, в качестве термостатируемых камер используют герметично закрытые сосуды, суспензию клеток вносят в концентрации 20-30 клеток/мл, а инкубацию проводят до появления видимых микроколоний.

Таблица 1

Таблица 2