Штамм вируса гриппа А(H3N2) для приготовления диагностических препаратов Советский патент 1993 года по МПК C12N7/00 

Изобретение относится к вирусологии и может быть использовано для получения ди- агностйкума вируса гриппа.

В настоящее время особое внимание обращает на себя все усиливающаяся гетерогенность вирусной популяции сероподти- па А (ИЗ N 2) на фоне длительной циркуляции его в популяциии человека (Ген- дон Ю.З., Климов А.И., Дреннер Л: и др. Сравнительный анализ геномов эпидемических штаммов вирусов гриппа // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1984, № 12, с. 24-29; Лузянина Т.Я., Гринбаум Е.Б., Юхнова Л.Г. и др. Лабораторная характеристика вирусов гриппа А (НЗ N 2) возбудителей эпидемии 1983 г. в

Ленинграде // Acta vlrol, 1986, № 4, с. 294- 301.

Нарастание гетерогенности вирусов А (НЗ N 2} может предшествовать появлению нового антигенного варианта данного подтипа возбудителя (Luzyanina Т.Ya., Golubev D.B., Ivanova N.A. et al. Characteristic of antlgenfc and biological properties of influenza A viruses Isolated different epidemic of the same cycle // Ann Microbiology, 1975, 126 b; p 461-470). В связи с этим прогностическое значение может иметь установленные направленности процесса изменчивости антигенной структуры возбудителя, а также оперативно выявление новых антигенных вариантов (Stuk В., Rostolansky F., et al. Характеристика эпиде-ч

00

ю ел

мических штаммов вируса гриппа А 1983 года с помощью поликлональных и монокло- нальных антител и выявление двух одновременно циркулирующих антигенных вариантов // Acta vlrpl., 1986, N2 3, с. 220- 226. Йзоляты эпидемий 1990 г. относились к серооодтипу А (НЗ N 2), в основном были близки международным референс-штам- мам А/Сычуднь/2/87 и А/Гуандонг/39/89.

Предлагаемый штамм А/Караган- да/398/90 является дрейф-вариантом про- тотипного штамма А/Сычуань/2/87. Штамм выделен из н/гл смыва больного человека при пассировании на куриных эмбрионах в феврале 1990 г. во время эпидемической вспышки гриппа в Караганде (Казахская ССР) и хранится в коллекции Института Вирусологии им. Д.И.Ивановского АМН СССР (депозитор № 2264)..

Целью изобретения является получение штамма вируса гриппа А/Караган- да/398/90 (НЗ N 2), обладающего специфической иммуногенностью, позволяющей использовать его для приготовления диагностических препаратов при идентификации вновь выделенных вирусов гриппа.

Антигенную структуру штамма изучали согласно рекомендациям ВОЗ в РТГА (реакция торможения гёмагглютинирующей активности) с использованием набора поликлональных крысиных сывороток к эталонным штаммам А (НЗ N 2) и в РПНА (реакция подавления нейраминидазной активности с кроличьими иммунными сыворотками к рекомбинантным вирусам Р19 (HeqlNl),P9.(HeqlN2) и Р17 (HeqiN2). Дополнительно проводился тонкий иммунолрги- ческий анализ штамма в РТГА с моноклональными антителами к вирусу А/Филиппины/2/82. Кроме того, в иммуно- логическом анализе были использованы мо- иоспецифические антитела к отдельным антигенным детерминантам гемагглютини- на.-..

Результаты изучения антигенной струк- туры даны в табл. 1-5.

Выделенный штамм А/Каратан- да/398/90 характеризуется широтой антигенного спектра при взаимодействии с сыворотками к эталлонным вариантам А/Филиппины/2/82, А/Кен/1/84, А/Мис- сисипи/1/85, А/СССР/2/85, А/Ленмнг- рад/360/86, А/Виктория/7/87, до 1/4-1/1$ гомологичного титра, а с А/Сычу- ань/2/87 до 1/2 гомологичного титра.

Использование в иммунологическом анализе мокорецепторных сывороток к отдельным детерминантам гемагглютинина. полученных методом специфической адсор- бцми, дало возможность получить объективную оценку новизны предлагаемого варианта вируса. Опыты показали, что штамм А/Ка- раганда/398/90 имел своеобразное сочетание антигенных детерминант, характеризующееся наличием одной старой детерминанты Н3.10, встречающейся в составе вирусов бангкокской разновидности и новой - Н3.16 - сычуаньской детерминанты.

Применение моноклональных антител к вирусу гриппа А/Филиппины/2/82 позволило выявить своеобразие нового штамма. Эпитопы его опознавались 6-7 из 13 использованных моноклональных антител.

АдапциЬнные свойства. Выделенный от человека вирус А/Караганда/398/90 репродуцируется в системе куриного эмбриона при оптимальной температуре (37° С) до инфекционного титра 5 Ig ЭЙД 50/0,2 мл. Штамм обладает низкой геммагглютиниру- ющей (1 : 32-1 : 128) и высокой иммуноген- ной активностью (титр антител в РТГА 1 : 1280).

Свойство агглютинации. Вирус обладает узким спектром гёмагглютинирующей активности. Он хорошо агглютинирует эритроциты кур (в титре 1 : 32-1 : 128), слабее - морской свинки (1 : 32-1 : 64), в низких титрах эритроциты, белых крыс (1 : 4-1 : 8), совершенно не взаимодействует с эритроцитами мышей, овцы, свиньи, лошади крупного рогатого скота.

Терморезистентность (Тбб-признак). Предлагаемый штамм обладает термостабильным гемагглютинином, активность которого сохранялась после прогревания при 56° С в течение 4 ч и утрачивалась при 62° С в течение 1ч..

Ингибиторочувствцтельность, Вирус А/Карагандэ/398/90 ингибиторезистект- ный.

Адсорбционно-элюирующая активность. Новый штамм обладает высокой сорбирующей способностью по отношению к эритроцитам кур (до 100 %) и практически не элюирует с эритроцитов.

Патогенные свойства. Вирус А/Кара- ганда/398/90 проявляет слабопатогенные свойства для белых мышей.

Штамм, выделенный от человека (А/Ка- раганда/398/90), предназначен для производства гриппозного антигена, который может быть использован при серологической диагностике гриппа. С этой целью штамм размножают путем заражения 9-10- дневных куриных эмбрионов в аллактоисную полость.

Пример. Лабораторные животные - белые полость.

Схема иммунизации. Иммунные сыворотки получают в результате 4-кратной внутрибрюшинной иммунизации белых крыс вируссодержащей аллантоисной жидкостью с недельным интервалом. Животных обескровливают через 10 дней после последней иммунизации. Иммунную сыворотку освобождают от неспецифических ингибиторов обработкой отечественным препаратом нейраминйдазы из нехолерного вибриона.

Титр иммунной сыворотки заявляемого препарата в РТГА с гомологичным антигеном составляет 1 : 1280, с гетерологичным

0

5

антигеном вируса гриппа человека A (HI N 1) реакция отрицательна.

Таким образом, предлагаемый штамм вируса гриппа А/Караганда/398/90 А (НЗ N 2), изолированный от человека, и приготовленные на его основе диагностические препараты могут найти применение в вирусологической практике для- идентификации вновь выделенных штаммов и изучения популяционного иммунитета населения с целью осуществления надзора за распространением вируса гриппа в природе и процессом изменчивости возбудителей гриппозной инфекции.

Использование: штамм вируса гриппа А (НЗ N 2) - А (Караганда) 398/90, применяемый для приготовления диагностических препаратов. Сущность изобретения: штамм (Ш) вируса гриппа А/Караганда/398/90 представляет собой дрейф-вариант прото-. типного штамма А/Сычуань/2/87 (НЗ N 2). Вирус хорошо репродуцируется в системе куриного эмбриона при 37° С в течение 48 ч до инфекционного титра 5 Ig ЭИДбо/0,2 мл. Ш хорошо агглютинирует эритроциты кур, слабее - морской свинки, совершенно не взаимодействует с эритроцитами мышей, овцы, свиньи, лошади и крупного рогатого скота, практически не элюирует с куриных эритроцитов, слабопатогенен для белых мышей, обладает низкой гемагглютинируею- щей активностью и высокой иммуногенностью. Ш А/Караганда/398/90 - ингибиторезистентный. В состав гемагг- лютинина входят Н3.10 и Н3.16 детерми- нанты. Положительный эффект: Ш Ф/Караганда/398/90 может быть использован для производства диагностических препаратов, предназначенных для идентификации вновь выделенных вирусов гриппа и обнаружения антител. 5 табл.

Формула.из обретения Штамм вируса гриппа А (НЗ N 2) ГКВ

2264, для приготовления диагностических

препаратов.

Исследование антигенной структуры гемагглютинина вируса гриппа А/Караганда/398/90 в

РТГА

Примечание: Здесь и в последующих таблицах титры даны в обратнах величинах.

Таблица 1

Т а б л и ц а 2 Анализ в РТГА иммунной сыворотки к вирусу гриппа А/Караганда/398/90

.Таблица 3

Исследование антигенной структуры нейраминидазы вируса гр«ппаА/Караганда/398/90 в

РПНА

Таблица 4 Определение антигенного состава гемагглютинина вируса гриппа А/Караганда/398/90

Таблица 5

Изучение антигенных взаимосвязей штамма вируса гриппа А/Караганда/398/90с моноклональными антителами