Способ культивирования штамма BacILLUS аUтRасIS Советский патент 1993 года по МПК C12N3/00 A61K39/10 

ё

Использование: микробиологическая промышленность, производство вакцин. Сущность изобретения: штамм бактерий Bac.antracls 55-ВНИИВВиМ выращивают на водной питательной среде, содержащей {на 1 л) : кислотный гидролизат говяжьего мяса 60-80 мл; аммоний сернокислый 1,5- 2,5 г; калий фосфорнокислый двузамещен- ный 3,0-12,0 г; натрий лимоннокислый 0,8-1,2 г; магний сернокислый 0,15-0,25 г; полипропиленгликоль 0,08-0,12 мл, в течение 46-50 ч при аэрации, при этом первые 27-29 ч скорость растворения кислорода в среде поддерживают 3,5 ±0,2 ммоль на 1 л среды в 1 ч.

Изобретение относится к микробиологии, в частности к биотехнологии вакцинных препаратов, и может быть использовано при изготовлении вакцин.

В настоящее время в СССР применяют две живые споровые вакцины против сибирской язвы: вакцину из штамма 55-ВНИИВ- ВиМ и вакцину из штамма СТИ-1.

Известен способ культивирования возбудителя сибирской язвы в жидкой среде с питательной основной из дрожжевого экстракта. Он позволяет за 1,5-2 суток получить в реакторе споровый материал для изготовления вакцины из штамма СТИ-1. Однакоего невозможно применить при производстве биопрепарата из штамма 55- ВНИИВВиМ, т.к. указанный штамм обладает биологическими особенностями и не образует споры в жидкой дрожжевой среде. Это является одной из основных характеристик невозможности получения

вакцины из штамма 55-ВНИИВВиМ в реакторе по указанному способу.

Вакцину из штамма 55-ВНИИВ-ВиМ изготавливают в 3-литровых бутылях на карто- фельно-пептонном агаре. Для получения спорового материала на одну серию вакцины необходимо проделать следующие операции: подготовить 200-400 штук 3-литровых бутылей (вымыть их, залить расплавленным агаром, простерилизовать, обкатать, выдержать на стерильность), засеять эти бутыли матричной расплодкой вакцинного штамма, поставить на инкубирование, из 10-20 бутылей приготовить мазки для контроля спорообразования, смыть с партии из 200-400 бутылей споровой материал и профильтровать его. На получение спорового материала необходимо 6-7 суток, не считая времени на подготовку посуды и питательных сред. Все вышеуказанные операции выполняются вручную. Кроме того, в

1

О

5

ю

процессе работы часть стеклопосуды бьется, а биопрёдприятия испытывают трудности в обеспечении специальной стеклопосудой.

Целью изобретения является сокращение времени на получение спорового материала.

Это достигается тем, что в известном способе изготовления вакцины против сибирской язвы, включающем выращивание микроорганизмов при температуре 36- 37° на питательной среде, культивирование осуществляют в реакторе с использованием разработанной нами и апробированной жидкости споруляционно- ростовой среды следующего состава:

кислотный гидролизат

говяжьего мяса60-80 мл

аммоний сернокислый

(ГОСТ 3769-78)1,5-2,5 г

калий фосфорнокислый

двузамещенный

(ГОСТ 2493-75)3,0-12,0 г

натрий лимоннокислый

(ТУ 6-09-2248-77)0,8-1,2 г

магний сернокислый (ГОСТ 4523-77)0,15-0,25 г

полипропиленгликоль

(ТУ 6-09-10-1244-77) 0,08-0,12 мл

дистиллированная вода

(ГОСТ 6709-72)до 1000 мл

рН 7,2 ±0,2.

Другое отличие заключается в иных условиях культивирования; выращивание проводят в течение 46-50 часов. В первые 27-29 часов культуру штамма аэрируют воздухом путем барботирования без перемешивания мешалкой, уровень аэрации составляет 3,5 0,2 ммоль, растворенного кислорода на 1 л среды в 1 час, затем аэри- рование прекращают и культуру выдерживают 19-21 час до завершения спорообразования.

Накопление биомассы завершается через 12 часов после посева. Спустя 27-29 часов 95-100% выросших клеток образуют споры, которые находятся на разных стадиях созревания. В последующие 19-21 час инкубирования происходят созревание спор и полный лизис вегетативного материала. На завершающем эта.пе выращивания культура состоит из зрелых светопреломля- ющих спор, количество которых в 1 мл составляет 100-300 млн.

Способ получения спор разработан на 5-литровом ферментере Бромма (фирма ЛКБ, Швеция) и воспроизведен в 63-литровом реакторе. Указанный способ может быть осуществлен в сосудах для культивирования различного объема, но для этого не

обходимо знать массообменные по кислороду характеристики используемых сосудов. Массообмен по кислороду можно определить по сульфитному методу, разработанному Купером и усовершенствованному во ВНИИВВиМ Бакуловым И.А, с соавторами (Тез.докл.научн.-теоре- тич.конф. ВНИИВВиМ 14-16 ноября 1983 г., с.178-180, г.Покров),

Пример1. Определениемассообмена по кислороду в 63-литровом реакторе, выращивание культуры штамма 55-ВНЙИВВиМ и получение спор.

Определение массообменна.

В реактор заливают 39 литров дистиллированной воды, в ней растворяют порошок сульфита натрия в.количестве 240,0 г. Отдельно в 1 литре дистиллированной воды растворяют кристаллы сернокислой меди в

количестве 10,0 г. Раствор сернокислой меди заливают в реактор и получают 40 литров смеси растворов с содержанием сульфита натрия 6,0 г/л и сернокислой меди 0,25 г/л. Из реактора с помощью шприца объемом 5 мл и присоединенных к нему 2 пипеток с узким канальцем набирают 5 мл раствора {1-я проба до аэрации), которые переносят в колбу с 70 мл свежеприготовленного 0,01 N раствора йода. В шприце с

пробой не должно быть пузырьков воздуха. Подают сжатый воздух в количестве 0,5 дм /л воды/мин или 20 дм /40 л воды/мин, Фиксируют время аэрации,

Оттитровыввают 1-ю пробу (до аэрации)

в растворе йода добавлением 0,01 N раствора гипосульфита натрия до перехода жидкости из коричневого в желтый цвет. Затем добавляют 3-4 капли 0,5%-ного раствора крахмала. Цвет жидкости становится темносиним. Продолжают добавлять раствор гипосульфита натрия до полного обесцвечивания жидкости.

Например, на титрование пробы потребовалось 6,2 мл раствора гипосульфита натрия.

Шприц с пипетками и колбу для титрования промывают дистиллированной водой, По истечении времени аэрации (30 минут) воздух отключают, отбирают 2-ю пробу

(аэрация 0,5 дм3/д/мин) и оттитровывают ее так же, как и 1-ю пробу.

Например, на титрование пробы потребовалось 8,6 мл раствора гипосульфита натрия.

По формуле определяют уровень аэрации:

Tt - То х 2.5 ммоль

Вр х 5 мл

х 1 час, где:

где То - количество гипосульфита натрия, израсходованного на титрование пробы до аэрации;

TI - после аэрации; Вр - время аэрации (час); 5 мл - объем пробы; 2,5 ммоль - один литр 0,01 N раствора гипосульфита связывает 2,5 ммоль 02. Например

(8,6 мп -6,2 мл ) х 2.5 ммоль

0,5 часа х 5 мл 2,4 ммоль 02/л/час,

х 1 час

т.е. при подаче 0,5 дм воздуха/л/мин в реакторе создается уровень аэрации,рав- ный 2,4 ммоль 02/л/час.

Сразу после отбора 2-й пробы вновь подают сжатый воздух для барботирования в количестве 1 дм /л/мин. По истечении 30-минутного аэрирования воздух отключают, отбирают 3-ю пробу (аэрирование 1 дм /л/мин), оттитровывают ее, определяют уровень аэрации по формуле, причем в этот же раз То будет служить TI из предыдущего расчета.

Например, на титрование 3-й пробы было израсходовано 13 мл раствора гипосульфита натрия. Определяют уровень аэрации:

(13 мл-8.6 мл )х 2.5 ммоль , 0,5 часа 5 мл 4,4 ммоль 02/л/час

1 час

Сразу после отбора 3-й пробы вновь подают сжатый воздух для барботирования в количестве 1,5 дм /л/мин..После 30-минутного аэрирования воздух отключают, отбирают 4-ю пробу (аэрация 1,5 дм3/л/мин). оттитровывают ее, определяют по формуле уровень аэрации, причем То будет Ti из предыдущего расчета.

Например, на титрование 4-й пробы было израсходовано 19,6 мл раствора гипосульфита натрия. Определяют уровень аэрации:

(19.6 мл -13 мл ) х 2,5 ммоль1

0,5 часа -5мл час

6,6 ммоль 02/л/час

После каждого отбора пробы и ее титрования шприц, пипетки и колбу тщательно промывают дистиллированной водой.

Таким образом, получают числовые зна- чения 3-х измерений, которые используют для построения графика.

Полученный график позволяет определить скорость растворения кислорода (уровень аэрации) при подаче известного количества воздуха для барботирования среды и, наоборот, количество воздуха, которое потребуется для создания необходимого уровня аэрации,

Выращивание культуры штамма 55- ВНИИВВиМ и получение спор.

В реакторе объемом 63 литра приготавливают 40 литров споруляционно-ростовой среды по прописи (см.выше). Реактивы растворяют в той же последовательности, в которой они написаны, Устанавливают рН среды 7,2 ±0,2 добавлением 20%-ного раствора гидроокиси калия. Среду стерилизуют при 121°С в течение 45 минут и охлаждают доЗО-35°С.

В реактор с питательной средой заливают через пробоотборник посевной материал - споровую суспензию штамма 55-ВНИИВВиМвколичестве2-10х1010жиз- неспособных спор, что составляет 0,5- 2,5x10 спор на 1 мл среды. Весь посевной материал должен содержаться в объеме 0,5-2,0 л....

Устанавливают температуру инкубиро- вания 37°С, в питательную среду подают сжатый воздух через барботер в объеме 0.8 дм /л/ среды, что по графику массообмена соответствует уровню аэрации 3,5 ммоль 02/л/час, Культивируют 27 часов. Следующие 21 час культуру инкубируют при той же температуре, но без аэрирования.

Через 27 и 48 часов культивирования из реактора отбирают пробы культуры, исследуют их на чистоту роста и спорообразова- ние.

Культура вакцинного штамма 55-ВНИ- ИВВиМ, выращенная в этих условиях, состоит из зрелых жизнеспособных спор, количество которых в 1 мл составляет 100- 300 млн.

Использование предлагаемого способа получения споровой формы вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ возбудителя сибирской язвы обеспечивает следующие преимущества:

позволяет получать в реакторах большие объемы спорового материала для изготовления вакцины против сибирской язвы:

значительно снижает затраты труда «а изготовление вакцины против сибирской язвы, ликвидирует тяжелый ручной труд, позволяет механизировать производственный процесс;

сокращает время на получение спорового материала в 3-4 раза.

Формула изобретения

Способ культивирования штамма Bacillus anthracis 55-ВНИИВВиМ на пита

тельной среде,содержащей органиче-кислотный гидролизат

схий источник азота до максимальногоговяжьего мяса -60-80 мл;

образования спор, отличающийсяаммоний сернокислый - 1,5-2,5 г;

тем, что, с целью сокращения времени накалий фосфорнокислый

получении спорового материала, в среду5 двузамещенный -3,0-12.0 г;

дополнительно вводят калий фосфорно-натрий лимоннокислый -0,8-1.2 г;

кислый двузамещенный, натрий лимон-магний сернокислый -0.15-0,25 г;

нокислый, магний сернокислый,полипропиленгликоль -0,08-0.12 мл;

полипропиленгликоль и воду, а в качест-вода- до 1000мл, ве источника азота используют кислот-10 при этом культивирование осуществляют в

ный гидролизат говяжьего мяса итечение46-50ч, из них первые 27-29 ч при

аммоний сернокислый, при этом указан-аэрации, поддерживая скорость раствореные компоненты вводят в следующем со-ния кислорода в среде 3,5+0,2 ммоль на 1 л

отношении:среды в 1 ч.