Способ культивирования бактерий вида BacILLUS аNтнRасIS Советский патент 1993 года по МПК C12N1/20 A61K39/00 

сл

с

Изобретение относится к микробиоло- (ии, в частности к способам изготовления Јпор Bacillus anthracis, и может быть ис- фользовано в научно-исследовательских учреждениях, занимающихся -изучением (|ибирской язвы, а также в биологической Промышленности при изготовлении проти- осибиреязвенных вакцин.

Целью изобретения является увеличе- |ие уровня спорообразования и выхода би- о массы спор штаммов Bacillus anthracis, у|меньшение времени изготовления, сниже- е|ие себестоимости и трудозатрат на произ- фдство целевого продукта.

Цель достигается тем, что при изготов- лении споровой формы штаммов Bacillus ajnthracls используют вместо КПА новую форуляционную среду, содержащую сухой

гидролизат кормовых дрожжей 12-15 г/л с содержанием общего азота 1,2-1,5%, аминного азота 0,5-0,7% и дополнительно агар 3,5-40 г/л. хлористый натрий 4-6 г/л, фосфорнокислый однозамещенный .калий 3-7 г/л, фосфорнокислый двузамещенный калий 5-12 г/л, щавелевокислый натрий 0,8-1,2 г/л, твин-80 0.02-0,04%. Указанное количество общего и аминного азота обеспечивает высокий уровень спорообразования (98-99%). Кроме того, культивирование штаммов проводят в иных условиях, а именно через 16-18 ч выращивания при 34-35°С температуру понижают до 28-30°С и культивирование продолжают в течение 56-64 ч.

Применение для наработки спорового. материала штаммов Bacillus antHracis новой питательной среды, а также изменение

00

со VI

о -ч

условий культивирования позволяют повысить выход спор в 15-20 раз по сравнению с прототипом, уменьшить время изготовления, снизить себестоимость и трудозатраты на производство целевого продукта без из- менения биологических свойств штаммов.

Пример. Для изготовления спорового материала штаммов Bacillus anthracis применяют новую споруляционную среду, в которой в качестве источника азотсодержащих веществ используют сухой гидролизат кормовых дрожжей 12-15 г/л. Уменьшение количества гидролизата кормовых дрожжей в составе питательной среды ниже 12 г/л приводит к снижению биомассы спор, увеличение свыше 15 г/л нецелесообразно, так как не способствует повышению выхода спор, но удлиняет процесс спорообразования на 20-25 ч.

Для создания нейтрального рН пита- тельной среды (7,2 ±0,2) на 1 л среды добавляют 5-12 г фосфорнокислого двузамещенного калия и 3-7 г фосфорнокислого однозамещенного калия. Изменение количества этих компонентов ниже или выше приведенных допусков вызывает сдвиг рН в кислую или щелочную сторону, что неблагоприятно сказывается на росте сибиреязвенного штамма. Добавление в среду щавелевокислого натрия (0,8-1.2 г/л) и твина-80 (0,02-0,04%) способствует быстрому спорообразованию, Изменение содер- жания этих веществ приводит к замедлению образования спор.

Затем в питательную среду добавляют агар (3,5-40 г/л), стерилизуют ее автоклави- рованием при 120°С в течение 40 мин и разливают по 0,5 л в бутыли емкостью 2,5 л (четверти), После застывания агара бутыли со средой контролируют на стерильность, выдерживая 16-20 ч при .

Для изготовления спор штамм Bacillus anthracis засевают в мясо-пептонный бульон, посевы инкубируют при Зб-37°С в течение .14-16 ч. Затем бульонную культуру засевают в бутыли со споруляционной средой из расчета 4-6 мл в каждую бутыль. Посевы инкубируют при в течение 16-18 ч, затем температуру понижают до 28-30°С и культивирование продолжают в течение 56-64 ч.

После культивирования Bacillus anthracis в описанных условиях споровую культуру отсасывают из бутылей в стеклянную емкость через сифон с марлевым филь- тром. Затем определяют концентрацию жизнеспособных спор путем рассева на чашках Петри с предлагаемой питательной средой и последующего подсчета выросших колоний.

В результате сравнительных исследований установлено, что уровень спорообразования на предлагаемой споруляционной среде к этому времени составляет 98-99%, тогда как на КПА этот показатель равен 58- 60%, лишь на 4-5-е сутки культивирования на КПА уровень спорообразования составляет 65 и 70% соответственно. Культивирование штамма на разработанной питательной среде свыше 80 ч нецелесообразно, так как выход биомассы и уровень спорообразования при этом не повышаются.

Таким образом, лри культивировании штамма на разработанной питательной среде уровень спорообразования выше, чем на КПА в 1,8-1,9 раза. Кроме того, при выращивании на КПА часть спор находится в незрелом состоянии, а около 15-20% вегетативных клеток не образуют спор, тогда как на предлагаемой среде спорулируют почти все клетки (98-99%).

Большое значение для повышения выхода спор имеют условия культивирования. Установлено, что понижение температуры культивирования до 28-30°С на разработанной питательной среде приводит к значительному увеличению урожая спор (в 8-12 раз).

В результате сравнительных исследований установлено, что выход спор с 1 л новой споруляционной среды при культивировании вакцинного штамма 55- ВНИИВВиМ в описанных условиях составляет (60-74) 1010. тогда как с такого же количества КПА получено (3-4) 1010 спор.

В таблице приведены сравнительные данные, полученные при наработке 5 серий спорового материала вакционного штамма 55-ВНИИВВиМ в параллельных опытах на КПА и новой споруляционной среде. Учитывая то, что одна иммунизирующая доза вакцины для крупных животных составляет 2 10 спор, с 1 л новой споруляционной среды получено 30000-37000 доз. тогда как с 1 л КПА - 1500-2000 доз сибиреязвенной вакцины.

Таким образом, выход спор вакционного штамма 55-ВНИИВВиМ с единицы новой споруляционной среды в разработанных условиях культивирования в 15-20 раз выше, чем в прототипе. °

Формула изобретения

Способ культивирования бактерий вида Bacillus anthracis, включающий посев и инкубирование бактерий при 34-35°С на плотной споруляционной среде, содержащей источник азота, натрий хлористый, агар и воду, отличающийся тем, что, с целью

повышения уровня спорообразования, выхода спор и ускорения способа, инкубирование проводят в течение 16-18 ч на среде, содержащей в качестве источника азота гидролизат кормовых дрожжей с содержанием общего и аминного азота 1.2-1,5 и С,5-0,7% соответственно и дополнительно содержащей калий фосфорнокислый одно- эамещенный. калий фосфорнокислый дву- эамещенный, натрий щавелевокислый и т вин-80 при следующем соотношении комВыход спор вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ с 1 л питательной среды

понентов, г/л: гидролизат кормовых дрожжей с содержанием общего и аминного азота 1.2-1,5 и 0,5-0,7% соответственно 12-15; агар 35-40; натрий хлористый 4-6; натрий щавелевокислый 0,8-1,2; калий фосфорнокислый однозамещенный 3-7; калий фосфорнокислый двузамещенный 5-12; твин-80 0,2-0,4; вода до 1 л, далее температуру понижают до 28-30°С и дополнительно инкубируют на той же среде в течение 56-64 ч.