Способ определения супероксидустраняющей активности Советский патент 1993 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано для определения супероксидустраняющей (СУА) или суперок- сиддусмутазной (СОД) активности.

Цель изобретения - ускорение и упро- ще ние процесса определения СУА.

Способ осуществляют следующим образом.

В пробирки, помещенные в любое термостати рующее устройство (т 30°С) вносят необходимый объем (0,1 М) карбонатного буфера, рН 10,2 с 1 мМ ЭДТА и 24 мкМ ТЙСТ. Затем в опытные пробирки вносят исследуемые образцы в 0,1 М карбонатном буфере с 1 мМ ЭДТА, в контрольную (холо- ) пробу - равный объем буфера. Реакциюзапускают добавлением гидроксиламина до концентрации 1 мМ, одновременно в холостой и опытных пробах. Через 5 минут после запуска (т.к. за это вр емя достигается экстинкция 0.2) реакцию останавливают добавлением 0,5 мл 1 М

трис-HCI буфера, рН 7,4, содержащего 1% тритона Х-100. После остановки реакции измеряется экстинкция в опытных и холостой пробах. Супероксидустраняющая (Суперок- сиддисмутазная) активность рассчитывается по отношению Eseo контрольной и опытной проб

СУА

ЕббО

2 Е560 °

где СУА - Супероксидустраняющая активность в единицах;

Eseo ЕббО контрольной пробы:

ЕббО° - ЕббО опытной пробы.

Пример 1. Исследовали СУА аминокислоты цистина.

Для определения СУА в 19 пробирках, помещенных на водяную баню (ВБ-2) при t 30°С, вносили по 1 мл 0,1 М Na - карбонатного буфера рН 10,2 с 1 мМ ЭДТА и 22 мкМ ТИСТ (Буфер А). Затем в пробирки добавили

VJ

О

со со VJ

СП

540 мМ раствор цистина в буфере А до необходимой концентрации с учетом последующего разбавления. СУД всех опытных проб ив контроле 1 (холостая проба) определяли в 3-х повторностях. Все пробы дово- дили до объёма 1,8 мл буфером А. Для запуска реакции в пробирки с интервалом 3 с. вводили по 0,2 мл 0.10 мМ раствора гид- роксиламина в дистиллированой воде. Через 5 мин реакцию генерации супероксид-аниона останавливали при достижений экстинкции 0,2 добавлением в каждую пробирку 0,5 мл 1 М трис HCI буфера, рН 7,4 с 1%, тритона Х-100. Останавливающий буфер добавляли также с интервалом 3 с для того, чтобы время генерации для всех пробирок было одинаковым, Экстинкцию (Eseo) проб определяли при пег мощи СФ-26. СУА расчитывали по формуле

СУД- - -

.2 Е5бО °

В таблице 1 приведены значения Eseo для всех 19 проб.

Из табл. 1 видно, что цистин проявляет СУА, увеличивающуюся с увеличением его концентрации.

Время определения СУА в 19 опытных пробах 10 мин в контроле 2 определение СУА одной пробы занимает 15 мин (способ- прототип).

Данные по СУА цистина приведены в табл.2.

Призер 2. Аналогично примеру 1 исследовали СУА аминокислоты гистидина. Данные приведены в табл.2.

Пример 3. Аналогично примеру 1 исследовали СУА аминокислоты метионина. Данные приведены в табл.2.

Из табл.2 видно, что все исследованные аминокислоты проявляют СУА, увеличивающуюся с увеличением концентрации аминокислоты.

Данные, полученные при помощи обоих способов, достоверно не отличались.

Таким образом/предложенный способ позволяет значительно упростить и ускорить в 3-12 раз определение СУА за счет введения опытного образца до запуска генерации супероксид-аниона и останови генерации субстрата в процессе определения.

Использование: биохимия, биотехнология. Сущность изобретения: генерируют супероксид реакций гидроксиламина в щелочной среде с последующей визуализацией путем взаимодействия с тринитроси- ним тетразолия. О величине супероксидустраняющей активности судят по разнице оптических плотностей опытной и контрольной проб, 2 табл.

Формула изобретения Способ определения супероксидустра- няющей активности, включающий введение анализируемого образца в реакционную смесь, содержащую 0,1 М карбонатный буфер с рН 10,2, тринитросиний тетразолий 1 мМ, ЭДТА 1 мМ и гидроксиламин 1 мМ с последующим инкубированием и измерением оптической плотности, по величине котоСупероксидустраняющая активность цистина (Расчет по значениям Еббо)

рой оценивают супероксидустраняющую активность, отличающийся тем, что. с целью ускорения и упрощения процесса, гидроксиламин вводят в реакционную смесь после анализируемого образца, инкубируют реакционную смесь и реакцию останавливают при достижении экстинкции 0,2 добавлением 0,5 объема 1 М трис-HCI буфера с рН 7,4, содержащего 1 % тритона Х-100.

30

Таблица 1

СУА аминокислот цистина. гистидина и метионина (усредненные значения)

Продолжение табл. 1

Таблица 2