Способ определения фосфолипидов в крови при массовых обследованиях Советский патент 1989 года по МПК G01N33/92 

Изобретение относится к медицине, а именно к биохимическому определению содержания фосфолипидов в крови при массовых обследованиях.

Цель изобретения - повышение точности и упроп1ение способа.

Способ осуществляют следуюг им образом.

Для анализа микропипеткой берут О,1 МП крови и равномерно распределяют по фильтру. П1льтры внс ччивают на воздухе, делают на фильтре необходимые пометки карандашом и помеп1ают в эксикатор над твердым сутителем. Пробы в таком яидр. могут храниться

в течение многих месяпеи. атем свободные от крови края фильтра обрезают и выбрасывают, а пробу, разрезанную на мелкие кусочки, помег1ают п про- пробирки и заливают 1,5 мл 0,3 п. раствора едкого натра на сутки. Через сутки 0,5 мл щелочногс смыва минерализуют с О, 1 мл 575,-ного раствора хлорной кислоты в пробирках с плотно- притертыми пробклми при IBTl r до гех пор, пока минерп. тизат не приобретет ВИД белых или бледно-желтых кристаллов (-5-6 ч). К . tзaтy добавляют 1 мл 1%-ного аско 1бино- вой кислоты и О, ;i МП молибдрпово I o

СП

00 00

реактива. Пробы помечают в термостат при на 30 мин, Образонавпуюся молибденовую синь экстрагируют 2 мл изобутилового спирта, тщательно перемешав его с содержимым пробирки и выдерживают в вытяжном пкафу 5 мин, Окраска изобутилового слоя стабильно сохраняется более 2 ч. Окрашенный слой фотометрируют на приборе ФЭК При длине волны 6304:10 им против дистиллированной воды п кювете П1и- риной слоя 3 мм.

Для определения количества липид- ного фосфора строится калибровочна я кривая. Из стандартного раствора готовят несколько разведений в пределах от 10 до 500 мкг/мл фосфора. Стандартный растяор готовят растворением 4,39 г ПИ .,, высушенного до постоянного веса, в I литре дистиллированной воды. По 0,1 мл разнед ний наносят на фильтр, высуигивают на воздухе, предварительно обозначив границы пятна. В дальнейшем обрабатывают фильтр в соответствии с предлженным способом.

После этого строят график зависимости оптической плотности раствора от содержания фосфора, нанесенного на фильтр (мкг/мл).

Для определения концентрации фос- фолипидов в сыворотке крови (мг% используют формулу:

,5

де С - содержание фосфолипидов в

сыворотке крови, мг%; А - содержание фосфора в опытной пробе, определенное по калибровочному графику (мкг/мл ; 100- фактор пересчета на 100 л; 25 - фактор пересчета содержания

липидного фосфора в фосфолипи- ды;

1000- фактор пересчета мкг в мг; 3,55- коэффициент пересчета концентрации фосфолипидов в цельной крови в концентрацию фосфолипидов в сыворотке крови, определен экспериментально по соотношению фосфолипидов в цельной крови и в сьшо- ротке, взятьгх на фильтры у людей и белых крыс. Пример 1. У практически здоро ого донора, 18 лет, через 12 ч после риема пищи берут кровь из пальца в

5

0

5

5

0

0

5

0

5

количестве 0,1 мл, равномерно наносят на фильтр, Высушенньй на воздухе и измельченный фильтр с кровью после обрезания свободных краев заливают, на сутки 1,5 мл 0,3 н. раствора едкого натра. Затем 0,5 мл щелочного смыва минерализуют с 0,1 мл 55%-но- го раствора хлорной кислоты при , к минерализату добавляют 1 мл 1%-ного раствора аскорбиновой кислоты и 0,3 мл молибденового реактива. После термостатирования 30 мин при образовавшуюся молибденовую синь экстрагируют 2 мл изобутилового спирта. Окрашенный слой фотометрируют на приборе ФЭК при красном светофильтре против дистиллированной воды в кювете с lunpuHoii слоя 3 мм. Концентрацию липидного фосфора в крови определяют по графику зависимости оптической плотности раствора от содержания фосфора, нанесенного на фильтр (мкг/мл). Для определения концентрации фосфолипидов в сыворотке крови пользуются с юрмулой: С Л х 0,704 (мг%). Концентрация фосфолипидов в крови донора С 2630,704 185,15 мг%.

Пример2. У больного Н., 48 лет, поступившего н лечебное учреждение с диагнозом: обострение хронического холецистита, берут кровь из пальца в количестве 0,1 мл, равномерно наносят на фильтр. Высушенный на воздухе и измельченный фильтр с кровью после обрезания свободных краев заливают на сутки 1,5 мл 0,3 н.раствора NaOH. Затем 0,5 мл щелочного смыва минерализуют с О,1 мл 60%-ного раствора хлорной кислоты, к минерализату добавляют I мл 1%-ного раствора аскорбиновой кислоты и 0,3 мл молибденового реактива. После термостатирования 30 мин при 45 С образовавшуюся молибденовую синь экстрагируют 2 мл изобутилового спирта, Окрашенньй слой фотометрируют на приборе ФЭК при красном светофильтре против дистиллированной воды в кювете с шириной слоя 3 мм, определяют концентрацию липидного фосфора в крови по графику зависимости оптической плотности раствора от содержания фосфора, нанесенного на фильтр (мкг/мл). Для определения концентрации фосфолипидов - в сьшоротке крови используют формулу С А 0,704 (мг%).

5151

Концентра1Ц1Я фосфолипидов в крови С ,704 643,71 (мг%).

Способ позволяет определять фосфо- липиды с среднеквадратичным отклонением 2,3 по сравнению с 8,6 в прототипе.

Формула изобретения

Способ определения фосфолипидов в крови при массовых обследованиях путем консервации крови на бумажных фильтрах, экстрак1щи, минерализации ,

16

добавления восстановителя и молибденового реактива, экстракции и фото- метрирования экстракта, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и упрощения способа, минерализацию проводят в среде 55- 60%-ной хлорной кислоты, в качестве восстановителя используют 1-2%-ный

раствор аскорбиновой кислоты, а молибденовый реактив готовят из 0,5%-но- го водного раствора молибденовокис- лого аммония и 13 н. серной кислоты в соотношении 2:1,

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к биохимическому определению содержания фосфолипидов в крови, и может быть использовано для контроля содержания фосфолипидов при массовых обследованиях. Целью изобретения является повышение точности и упрощение способа. Цель достигается тем, что берут 0,1 мл крови на фильтр, экстрагируют раствором едкого натра, минерализуют 57%-ной хлорной кислотой. К минерализату добавляют 1 мл 1%-ной аскорбиной кислоты и 0,3 мл молибденового реактива. После термостатирования молибденовую синь экстрагируют изобутиловым спиртом и затем фотометрируют на фотоэлектроколориметре. Содержание липидного фосфора определяют по калибровочной кривой. Концентрацию фосфолипидов рассчитывают по формуле С=А К /мг%/, где С - концентрация фосфолипидов в сыворотке крови, мг%, А - концентрация фосфора в опытной пробе в мкг/мл, К - коэффициент пересчета концентрации липидного фосфора, содержащегося в крови в концентрацию фосфолипидов в сыворотке крови, мг%.