Способ диагностики вирусных болезней животных Советский патент 1993 года по МПК G01N33/53 A61K39/12 

Предполагаемое изобретение относится к области вирусологии и может быть использовано в диагностике исследованиях при вирусных инфекциях и определении иммунного статуса животных.

Известен ряд способов анализа вирусов (антигенов) иммуноферментным методом (ИФМ).

Этот метод позволяет за 16-24 часов определять вирусспецифические белки при их концентрации не менее 1-10, нанограм- мов.

Существенным недостатком ИФМ, как и других иммунохимических методов/является то, что они позволяют определять лишь вирусы, которые по антигенной структуре соответствуют производственному штамму. Этого недостатка лишена реакция нейтрализации (РН), в основе которой заложено то, что в случае отличий вирус не нейтрализуется вирусспецифическими антителами и размножается в чувствительной системе.

В настоящее время в вирусологии широко используется РН, которая позволяет идентифицировать возбудителей, вызвавших заболевание, и определять иммунный статус организма. РН - это наиболее универсальная, высокоспецифичная реакция, поэтому она служит эталоном при оценке других реакций в вирусологии.

РН основана на способности специфических иммунных сывороток нейтрализовать инфекционное действие вирусов, т.е. при контакте вируса с сывороткой, содержащее специфические антитела, вирус теряет способность к репродукции в чувствительных системах. Смесь вируса и сыворотки испытывают на чувствительной к данному вирусу системе культивирования. Результаты реакции нейтрализации вируса учитывают по отсутствию: а) гибели или патолого-анатомических изменений; б) ци- толатического действия, бляшкообразова- ния; г) гемагглютининов.

XJ

ю XI XJ о

Известно много разных модификаций постановки РН, касающихся приготовления смесей вирус-сыворотка, условий инкубиро- .вэния смесей и учета результатов РН. Для постановки РН используют сыворотку крови, полученные от зараженных животных.

Наиболее чувствительным является титрование антител по методу реакции бляшек.

Известен способ диагностики вирусных инфекций в РН, включающий следующие операции:

1 - готовят разведение вирусов с содержанием 80-120 БОЕ в 0,1 мл;

2 - смешивают разведения иммунной сыворотки, полученной от больных животных, с постоянной дозой вируса и смесь инкубируют в течение 1 часа при 37°С;

3 - монослойную культуру клеток отмывают солевым раствором Хенкса и инокули- руют смесью, полученной согласно п.2;

4 - реакцию инкубируют 1 час при 37°С;

5 .- во флаконы вносят агаровое покрытие; .

6 - после застывания агара, флаконы инкубируют при 37°С в течение 72 часов;

7 - учет результатов реакции проводят по количеству редуцированных бляшек. Тип вируса соответствует типу иммунной сыворотки, предупредившей развитие бляшек е наиболее высоком, титре. .

Данный способ взят заявителем в качестве прототипа как наиболее близкий по технической сущности и достигаемому результату при использовании.

Существенным недостатком способа- прототипа является длительность иденти- фикации возбудителя и постановки диагноза на болезнь, в связи с длительностью получения исследуемого материала.

Известно, что в сыворотках крови животных, зараженных вирусом ящура, антитела к возбудителю появляются к четвертому дню IgM, а к 14 дню - IgG.

Этим объясняется .то. что для построе-. ния постановки реакции используют сыво- рвтки, полученные от животных не раньше, чем через 7-14 дней после заболевания.

Целью предлагаемого изобретения является ускорение способа.

Поставленная цель достигается тем, что в известном способе диагностики вирусных болезней животных в РН, включающей смешивание антителосодержащей жидкости с вирусом, инкубирование смеси при 37°С в течение 1 часа, внесение ее в многослойную хультуру клеток с последующим инкубирр- ванием. в соответствии с предполагаемым изобретением в качестве антителосодержащей жидкости используют мононуклеарные «слетки (лимфоциты) периферической крови.

Предлагаемый способ соответствует критерию изобретения новизна, так как по сравнению с прототипом он содержит новую совокупность существенных признаков, выраженную в формуле изобретения. Сведения о сущности предлагаемого решения до неопределенного круга лиц не доводились.

По сравнению с прототипом предлагаемый способ отличается тем, что в качестве источника антител используют лимфоциты крови подозреваемых в заболевании животных. В известных аналогичных решениях указанные отличительные признаки в совокупности с известными признаками, указанными в ограничительной части формулы предлагаемого способа, позволяют значительно ускорить исследование иммунного статуса животного, идентификацию возбудителей, так как в известных способах для подобных исследований используют сыворотки крови от переболевших или вакцинированных животных, отобранных не ранее, чём через 7-10 дней после контакта с вирусом.

Известных закономерностей в опубликованных источниках информации не обнаружено.

Таким образом, способ, отличающийся

от известного признаками, приводящими к ускорению анализа предлагаемым способом, т.е. к положительному эффекту, который неизвестен в аналогичных решениях, отвечает критерию изобретения существенные отличия. .

Благодаря использованию новой совокупности известных и отличительных признаков, характеризующих предлагаемый способ, достигается положительный эффект, выраженный в цели изобретения: сокращению времени на постановку диагноза и идентификацию вируса, вызвавшего забо- левание. Достижение положительного фекта, по нашему мнению, можно объяснить

тем, что в качестве источника антител используются лимфоциты подозреваемых в заболевании животных.

Известно, что после попадания в организм антигена происходит коммитирование

стволовых клеток (лимфоцитов - предшественников). Антитела продуцируются в небольших количествах (104-10 молекул на клетку) и функционируют только как рецепторы клеточной поверхности.

Наряду с этим в ранний период после введения антигена в организме образуются клетки памяти. Вероятно, в это же время при стимулированном антигенном размножении клона образуются антителосекретирующие клетки либо из коммутированных

предшественников антителообразующих клеток, либо из клеток памяти при повторной встрече с аналогичным антигеном. Отличительная особенность В-лимфоцитов заключается в том, что на их поверхности присутствует легко возбудимый иммуногло- булин, который играет роль рецептора для антигена. Пролиферация и дифференциров- ка В-лимфоцитов после их взаимодействия с антигеном приводят к образованию клеток, секретирующих иммуноглобулины. Каждый малый В-лимфоцит имеет приблизительно 100000 молекул рецепторных им- муноглобулинов. Уже через 24 часа после введения вируса (например, ящура) на лимфоцитах обнаруживаются антигенсвязыва- ющие участки антител. После введения инактивированного антигена на мембранах лимфоцитов антигенсвязывающие участки антител обнаруживаются значительно позже. При смешиваний лимфоцитов, содержащих антигенсвязывающие центры антител, с вирулентным возбудителем происходит образование комплексов, которые осаждали центрифугированием, а недостаточную жидкость отбирали и вносили в чувствительную культуру клеток. При этом размножения вируса в клетках не происходило.

Если комплексы антитело-лимфоциты- вирус не образовались, то после внесения в культуру клеток надосадочной жидкости, содержащей вирулентный возбудитель, происходила адсорбция вируса на мембранах клеток и в последующем репродукция вируса.

Для пояснения сущности предлагаемого способа приводятся примеры его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Л р и м е р 1. Кровь от подозреваемого в заболевании крупного рогатого скота отбирают в стерильные флаконы с гепарином (20 ед на мл крови). Мононуклеарные клетки лимфоциты выделяют из стабилизированной крови путем центрифугирования в градиенте фиколл-пака (Pharmacia Швеция). Для этого в центрифужные пробирки помещают 5 мл фиколла и осторожно наслаивают 5 мл гепаринизированной крови. Центрифугируют 40 мин при 2000 об/мин, при температуре 18°С. После центрифугирования в пробирке образуется 4 слоя: I - плазма, II - лимфоциты, III - фиколл, IV - гранулоциты и эритроциты. Взвесь лимфоцитов осторожно отбирают пастеровской пипеткой в центрифужные пробирки и отмывают средой 199 путем 5-минутного центрифугирования при 1200 об/мин. Повторную отмывку лимфоцитов проводят сбалансированным солевым

раствором Хенкса без индикатора. Полученный осадок клеток ресуспендируют в растворе Хэнкса(1:10). Готовят несколько проб суспензии лимфоцитов по 0,4 мл. К каждой 5 пробе добавляют ло 0,1 мл вируса ящура различных типов, адаптированных к культуре клеток ВНК-21 и инкубируют при 37°С в течение 60 мин. Смесь центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мл, надосадок

0 инокулируют в культуру клеток ВЕК-21. Инкубируют 72 часа при 37°С. Учет результатов проводят по ЦПД.

Результаты исследований, характеризующих эффективность предлагаемого

5 способа по сравнению с прототипом, представлены с таблицах.

П р и м е р 2. Кровь от подозреваемых свиней отбирают в стерильные флаконы с гепарином (20 ед/мл крови). Лимфоциты вы0 деляют из плазмы, которую получают после слабого центрифугирования крови в течение 15 мин., при 900-1000 об/мин. Плазму отбирают в центрифужные пробирки, клетки осаждают центрифугированием при 1200

5 об/мин - 15 мин. если в осадке присутствуют эритроциты, их лизируют добавлением 1. мл дистиллированной воды, в течение 30 сек., затем добавляют 10 мл среды 199, вновь центрифугируют, полученный осадок

0 повторно промывают солевым раствором Хэнкса без индикатора, клетки ресуспендируют в 1 мл растворе Хэнкса. Готовят несколько проб лимфоцитов по 0,4 мл с содержанием 700-1000 тыс. лимфоцитов в 1

5 мл. К одной части пробы добавляют по 0,1

мл вируса ящура, к другой по 0,1 мл вируса

везикулярной болезни свиней, к третьей по

0,1 мл вируса везикулярной экзантемы сви ней. Смесь инкубируют 60 минут при 37°С,

0 затем центрифугируют и надосадок инокулируют в культуру клеток СП. После инкуби- рования во флаконы вносят агаровую смесь и после его застывания флаконы инкубируют при 37°С в течение 72 час. Учет результа5 тов проводят по количеству бляшек. Тип вируса вызвавшего заболевание, соответствует типу возбудителя, размножение которого ингибируется лимфоцитами больного животного.

0. П р и м е р 3. Кровь от зараженных вирусами ящура или иммунизированных антигенами вирусов ВЭС или ВВС морских свинок отбирают в стерильные флаконы с гепарином (20 ед/мл крови). В дальнейшем

5 проводят исследования так, как описано в примере 2.

Результаты этих исследований представлены в таблицах 2, 3 и 5.

П р и м е р 4. Кровь отобранную до заражения и через три дня после инфицирования вирусом ящура овец отбирали в стерильные флаконы с гепарином и в дальнейшем исследования проводят так, как описано в примере 2.

Результаты этих исследований представлены в таблице 6.

Как видно из данных таблицы 1, предлагаемый способ позволяет определять возбудитель, вызвавший болезнь на 3 день после заражения в то время, как способ прототип - на 7 день. Это свидетельствует о явном преимуществе предлагаемого способа перед прототипом. Предлагаемый способ позволяет на 4 дня ускорить идентификацию возбудителя.

Результаты, представленные в таблице 2 подтверждают данные, приведенные в таблице 1 и свидетельствуют о возможности использования для постановки РН иммунных лимфоцитов. .

Учитывая выше приведенные результаты, была изучена возможность определения подтиповой принадлежности вируса ящура предлагаемым способом (таблица 3).

Данные этих исследований свидетельствуют о возможности ранней идентификации штаммов вируса ящура предлагаемым способом,

0

5

0

5

В серии опытов была показана возможность идентификации возбудителя везикулярной экзантемы свиней предлагаемым способом (табл. 4 и 5).

В таблице 6 представлены данные, подтверждающие ранее приведенные данные (табл. 1-5) и свидетельствующие о возможности достижения поставленной цели и на овцах.

Аналогичные результаты получены при использовании для постановки РН лимфоцитов, выделенных из костного мозга и лимфоузлов.. --

Технико-экономическая эффективность.

Предлагаемый способ диагностики везикулярных болезней с помощью реакции нейтрализации по сравнению с прототипом дает возможность сократить время определения возбудителя в реакции нейтрализации на 4-1-1 дней. Ускорение идентификации возбудителей инфекционных болезней имеет большое значение для своевременного купирования очага, а в последующем и ликвидации его.

Предлагаемый способ относится к категории изобретений, не создающих экономию при использовании.

Использование: ветеринария, вирусология. Сущность изобретения: при диагностике вирусных болезней смешивают антителосодержащую жидкость от подозреваемых в заболеваниях животных с эталонным вирусом. Смесь инкубируют, вносят ее в монослойную культуру клеток. Затем инкубируют инфицированную культуру и учитывают результаты реакции. В качестве антителосодержащей жидкости используют лимфоциты. Способ позволяет идентифицировать возбудитель по ранней стадии заболевания.

Формул а изобретения

Способ диагностики вирусных болезней животных в реакции нейтрализации, включающий отбор антитёлосодержащего материала от испытуемых животных, смешивание его с эталонным вирусом, инкуТ а б л и ц а 1 Результаты идентификации вируса, вызвавшего ящур у крупного рогатого скота

бирование смеси, внесение ее в монослой- ную культуру клеток, инкубирование инфицированной культуры и учет результатов реакций, о т ли чающийся тем, что, с целью ускорения способа, в качестве анти- телосодержащёго материала используют лимфоциты.

Таблица 2

Изучение возможности постановки реакции нейтрализации с лимфоцитами морских свинок зараженных вирусом ящура А22 № 550

ТаблицаЗ

Результаты исследования лимфоцитов морских свинок, зараженных вирусом

ящура типа А

Таблица 4 Результаты исследований лимфоцитов свиней, зараженных вирусом ящура А22

Таблица 5

Результаты исследований лимфоцитов морских свинок иммунизированных

антигеном вируса ВЭСА-48

Та блица 6 Результаты исследования лимфоцитов овец предлагаемым способом п 7