Способ определения антигепариновой активности препарата протаминов Советский патент 1993 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к медицине, в частности к биохимическим методам опре- д ления биологической активности протаминов, которые используются для нейтрализации гепарина после проведения операций на сердце.

Цель изобретения - ускорение способа определения антигепариновой активности протаминов и определение вклада каждого компонента протамина в общую активность препарата.

Поставленная цель достигается тем, что водный раствор протаминов центрифугируют, отбирают аликвоту и вводят в хроматограф при скорости подвижной фазы 0,5-1,0 мл/мин, промывают колонку элюентом, содержащим трифторуксусную кислоту в концентрации 0,1-0,5% при 25-45°С и определяют антигепариновую активность прЬтаминов по формуле:

1/Q(A + B + C-D + E + F).

2. с.2.

А где А аСа; , D dCa/; E eCt/; ,9;

Са - концентрация компонента А, .мг/мл;

Сь - концентрация- компонента В, мг/мл;

Q - концентрация исследуемого препарата, мг.

Из литературных данных известно, что на антигепариновую активность препаратов протаминов влияет содержание основного компонента в промышленных образцах. При изучении влияния содержания протамина в препарате на их антигепариновую активность мы учитывали тот факт. что протамины, в частности, осетровых рыб, состоят из 2-х компонентов, имеющих различную энтигепариновую активность. Нами была исследована зависимость антигепариновой активности препаратов протаминов от содержания индивидуальных компонентов А и В с использованием методов математического моделирования и планирования эксперимента.

Для разделения протаминов была использована обращеннофазовая ВЭЖХ. В качестве элюента использовали водноэта- нольный раствор, содержащий трифторуксусную кислоту, позволяющую уменьшить

И

СО

о

со

00

ел

ионное взаимодействие протаминов с сорбентом.

Для ускорения процесс хроматографи- рование проводили при оптимальном интервале температур 25-45°С, при комнатной температуре (18-20°С) скорость хроматографирования понижалась, выше верхнего предела температуры происходила деструкция белка и появлялись дополнительные пики.

В указанном интервале изменения скорости подвижной фазы происходит достаточно быстрое установление равновесия в процессе массообмена между сорбентом и поглощаемым веществом, что также вносит значительный вклад в ускорение процесса определения концентрации компонентов А и В. Было показано, что вклад в общую активность препаратов протаминов А и В различен. Для нахождения зависимости антигепариновой активности препаратов протаминов от содержания их индивидуальных компонентов А и В был использован полином 11 степени. Были приготовлены модельные смеси из компонентов А и В.

Эксперименты реализовали в соответствии с планом второго порядка (см.табли- цу), содержащим 9 экспериментальных точек в области варьирования двух переменных. Границы варьирования концентраций компонентов А и В были выбраны на основе литературных данных, а также в соответствии с рекомендациями по определе- нию антигепариновой активности протаминов. Была определена интигепари- новая активность модельных смесей.

В результате обработки экспериментальных данных, полученных при реализации плана второго порядка было найдена уравнение регрессии;

А а Са + b Сь + d Са2 + е Сь2 + F, где a,b,c,d,e,F - коэффициенты в уравнении регресии,

Са и Сь - концентрации компонентов А и В.

Коэффициенты уравнения регрессии определяли по методу наименьших квадратов, их значимость оценивали по критерию Стьюдента. Остальные коэффициенты в уравнении были статически незначимы и нами не учитывались, Была также построена модель процесса на основании полученногб уравнения, которая адекватно описывала экспериментальные данные. Адекватность модели проверяли по критерию Фишера. Расчетная формула для определения антигепариновой активности протаминов имеет следующий вид:

А 1/Q (236Са + 77Cb + 26,4CaCb - 127,5Са2 + 24Сь2 + 4,9),(1)

Таким образом, сочетание двух методов

- обращеннофазовая ВЭЖК и математическое моделирование позволяет достаточно быстро оценить концентрацию индивидуаль- ных компонентов и, на основе полученных результатов, рассчитать антигепариновую активность препаратов протаминов. . Изобретение описывается следующими примерами определения антигепариновой активности протаминов.

П р и м е р 1. Коммерческие препараты протаминов, выделенные из гонад осетровых рыб, в количестве 10 мг растворяли в 1 мл воды, центрифугировали в течение 10 минут при 3000 об/мин, отбирали аликвоту

100 мкл и вводили в хроматограф. Использовали прибор модели Du Pont 8800 (США), применяя колонку Zorbax - ODSO.(0,46x25 см). Детектирование осуществляли при

длине волны 220 нм, Термостатировали колонку с помощью термостата с точностью ±0,2°С, температуру колонки установили на 25°С, скорость подвижной фазы установили 0,5 мл/мин, градиент концентрации этанола

0,65% в минуту, концентрация трифторук- сусной кислоты - 0,1%, Значение антиге- париновй активности протаминов вычисляли по формуле (1). По хроматограм- ме были найдены значения концентраци

компонентов А 0,30 мг/мл: В 0,58 мг/мл.

F н 4,9 Ед;

Q - концентрация исследуемого препарата, 1 мг.

Экспериментально найденные значения: А 121,7 Ед; время определения - 35 минут, ошибка определения - 5%,

Пример 2. Пробоподготовка аналогична примеру 1, параметры хроматографирования: скорость подвижной фазы - 1 мл/мин, температура колонки - 45°С, концентрация трифторуксусной кислоты - 0,5%, Экспериментально найденные значения:, концентрация компонента А - 0-32 мг/мл; компонента В - 0,5 мг/мл, время анализа 30 минут. Расчет значения антигепариновой активности:

А 1 /Q (A + В + С - D + Е + F),

где А аСа 75,5;

В ЬСь 40ДС сСь.4,05;

D dCa2 13,05;

Е еСь2 5.6;

F r 4,9; Q-1 мг.

Значение А 117 ЕД/мг, ошибка определения 6%.

ПримерЗ. Препарат протаминэ из гонад осетровых рыб, в количестве 10 мг растворяли в 1 мл диет, воды, центрифугировали, отбирали аликвоту 100 мкл и вводи- ли в хроматограф. Параметры хроматографирования: скорость подвижной фазы - 0,7 мл/мин, температура колонки - 35°С. градиент концентрации этанола 0,65% в мин, концентрация трифторуксус- ной кислоты - 0,25%. Экспериментально найденные значения: концентрация компонента А 0,28 мг/мл; концентрация компонента В 0,60 мг/мл; время анализа 15 мийут, Значение активности препарата А 1/Q{A + B + C-D + E + F), Где; А аСэ 66,08;

В ЬСь 46,2;

С сСь 4,4;

D-dCa 10,0Е еСь2 8,9;.

F г 4,9. Значение А 120,5 ЕД/мг. ошибка определения 4,1 %.

Наиболее Оптимальные условия для оп- редфления антигепариновой активности протаминов являются: скорость подвижной фазы - 0,7 мл/мин, температура колонки - 35°С, концентрация ТФУ - 0,25%, что соответствует времени анализа 15 мин, ошибки определения 4%, значению А 120,5.

Таким образом, при осуществлении предлагаемого способа определения активности протаминов, не только сокращается время анализа, но и достоверно определяются концентрации индивидуальных компонентов протаминов, позволяющие оценить вклад в общую активность препарата отдельных компонентов, что особенно важно для клинической практики.

Ф о р м у л а и з о б р ете н и я Способ определения антигепариновой активности препарата протаминов, включающий его растворение, центрифугирование раствора, взятие аликвоты с последующей регистрацией, отличающийся тем, что, с целью ускорения способа и определения вклада каждого протамина в общую активность препарата, аликвоту препарат вводят в хроматограф при скорости подвижной фазы 0,5-1,0 мл/мин, промывают колонку элю- ентом, содержащим трифторуксусную кислоту в концентрации 0,1-0,5%, при 25- 45°С, определяют концентрацию препарата и составляющих его протаминов, в общую активность препарата и индивидуальную активность протаминов рассчитывают по формуле

0А 1 /Q (А + В + С - D + Е + F),

где А аСа; Вь Сь; С с Сь; D dCa; Е еСь ; ,9;

а, Ь, с, d, e - коэффициенты; Са - концентрация компонента А, 5 мг/мл;

Сь - концентрация компонента В, мг/мл;.

Q - концентрация исследуемого препарат, мг. 0

0

5

0

5

Использование: в области медицинской биохимии. Сущность изобретения: водный раствор протаминов центрифугируют, отбирают аликвоту и вводят в хроматограф при скорости подвижной фазы от 0,5+1,0 мл/мин, промывают колонку элюентом, содержащим трифторуксусную кислоту в концентрации 0,1+0,5%, при 25-45°С и по формуле определяют антигепариновую активность. Способ позволяет определить вклад каждого компонента протамина в общую активность препарата, а также ускорить процесс определения активности препарата.

Модельные смеси протаминов и их антигепариновая активность