1
Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения мультиплазмидного штамма, используемого для очистки окружающей среды, в частности для резорбции пленки нефти и нефтепродуктов в воде.
Известен штамм Pseudornonas aeruginosa РАО, содержаш,ий нлазмиды САМ, ОСТ, NAH, SAL, контролируюш,ие утилизацию углеводородов, используемый для микробиологической деградации нефти и нефтепродуктов 1.
Недостатком известного мультиплазмидного штамма Р. aeruginosa РАО является низкая скорость утилизации неочишенной нефти.
Исходным штаммом для получения предлагаемого является штамм Р. aeruginosa 121, способный утилизировать октан. Этот штамм использован в качестве реципиента для внесения в него методом коньюгационного переноса плазмид биодеградации 2.
Недостатком этого штамма является также невысокая скорость утилизации нефтепродуктов.
Целью изобретения является получение штамма, способного с высокой скоростью осуществлять деградацию нефти, мазута и смазочных масел, который может быть использован для очистки окрул ающеи среды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами.
Мультиплазмидный штамм Р. aeruginosa 123 получен путем коньюгационного переноса
в исходный штамм плазмид. Нервное САМ нлазмиды в исходный штамм был осуществлен из штамма Р. putida С. 19. Полученный эксконьюгант обладает способностью утилизировать октан и камфору в качестве единственных источников углерода. Затем в исходный штамм, растущий на октане и камфоре, был внесен NAH плазмид из штамма Р. putida 51, носле чего он приобретает способность деградировать октан, камфору, нафталин и салицилат.
В табл. приведена частота переноса СА.М и NAH плазмид.
На фиг. 1 приведены кривые роста штаммов Р. aeruginosa 121 и 123 на неочищенной нефти.
При выращивании штамма Р. aeruginosa 123 на минеральной среде, содержащей нафталин, камфору, октан, салицилат в концентрации 4 мм, наблюдается увеличение скорости роста (кривая а) по сравнению с ростом на среде, где в качестве источника углеродТаблица
iioro питания присутствует только один нз перечисленных углеводородов (кривая б).
Штамм Р. aeruginosa 123 хранится в коллекции Музея лаборатории внехромосомной наследственности ИЬФМ АН СССР и имеет следующую характеристику.
Морфологические культуральные признаки.
Клетки прямые, палочковидные, размеры (2-5}),(0,Ь-0,7) мк. Подвижные монотрихи, грамотрицательные, неспороноснБш.
Мясо-пептонный агар.
Колонии гладкие бесцветные, край неровный, в среде накапливается пигмент зеленого цвета.
Мясо-пептоиный бульон.
Образуется муть, хлопьевидный осадок и флуоресцирующий пигмент.
На стандартных средах, перечисленных выше, образуется пигмент циоцианин.
Картофель. Отмечается хороший рост с образованием слизи.
Физиологические признаки. Аэроб. Растет прн температуре 30-42 С, при 4°С - не растет.
Отношение к сахарам. Использует й-глюкозу, d-фруктозу, d-рибозу, глюконат. Не усваивает трегалозу.
Отношение к углеводородам. Иснользует нафталин, н-алканы, камфору.
Отношение к источникам питания. Ассимилирует аммонийный и нитратный азот.
Нример. Штамм Р. aeruginosa 123 выращивают на минеральной среде следующего состава, г:
10
1
2
0,05
0,01 мг
2 г
0,06 мг
0,3 , мг
3
20 10
0,5
1
В 250 мл колбы вносят 50 мл минеральной среды, 2,5 мл источника углеродного питания (нефть, мазут и смазочное масло) и клеток (до конечной концентрации 10). Культивирование производят на качалке при .
Ежесуточно берут пробы, количество /кизнеспособных клеток определяют высевом разведений на среду М11А. Подсчет колонии осуществляют через 24 часа. Кривые роста штаммов Р. aeruginosa 121
и 1/;3 на неочищенной нефти демонстрируют разницу в способности деградировать неочищенную нефть у экспериментально полученного штамма и исходного, выражающуюся в скорости роста (см. фиг. Ij.
Кривая а показывает изменение плотности клеток (количество клеток в мл среды штамма) штамма Р. aeruginosa 121 во времени при концентрации нефти в 5-ной среде. Кривая б показывает существенное увеличение
скорости роста штамма Р. aeruginosa 123 при наличии САМ, iNAH и ОСТ признаков, контролирующих деградацию алканов, бициклических, полициклоароматических, ароматических углеводородов нефти. Максимальную
плотность клеток bXltl штамм Р. aeruginosa 123 достигает на нефти на третьи сутки, исходный щтамм плотность З-Ш клеток/мм достигает на нятые сутки.
На фиг. 2 представлены ростовые характеристики двух штаммов Р. aeruginosa 121 и 123, утилизирующих мазут, как единственный источник углеродного питания.
Максимальная плотность клеток штамма Р. aeruginosa 121 на мазуте 5-10 - Ю клеток/мл (кривая а). Кривая б показывает увеличение скорости роста штамма Р. aeruginosa 123 на мазуте п степени его деградации за счет включенных в клетку плазмид биодеградации. Минимальная плотность клеток штамма Р. aeruginosa 123 на мазуте 10 клеток/мл. За двое суток экспериментально полученный штам Р. aeruginosa i23 осуществляет резорбцию нефтяной пленки, утилизируя составные части нефти и мазута.
При сравнении нредлагаемого мультиплазмидного штамма с известными видно, что скорость роста штамма Р. aeruginosa 123 на неочищенной нефти и мазуте значительно превышает скорость роста штамма аналога
Р. aeruginosa РАО, так как штамм Р. aeruginosa РАО нарастает до максимальной плотности за 5-6 суток, а сконструированный нами штамм Р. aeruginosa 123 - за 2-3 суток. Таким образом, характерной особенностью
мультиплазмидного штамма Р. aeruginosa 123,
сконструированного путем коньюгационного переноса плазмид биодеградацни, является способность утнлизнровать алканы, ароматические, циклические и полициклическне органические соединения, а также способность деградировать нефть и нефтепродукты с высокой скоростью.
Формула изобретения
Штамм Pseudomonas aeruginosa 123, несущий ОСТ+, САМ+, NAH+ плазмиды, используемый при биологической очистке воды от нефти и нефтепродуктов. Хранится в коллекции музея лаборатории внехромосомной наследственности ИБФМ АН СССР.
Морфологические признаки. Клетки прямые, палочковидные, размеры (2-5)Х(,7) мк. Подвижные монотрихи, грамотрицательные неспороиосные.
Культуральные признаки. Мясо-пептонный агар. Колонии гладкие, бесцветные, край неровный, в среде накапливается пигмент зеленого цвета.
Мясо-пептоиный бульон. Образуется муть, хлопьевидный осадок и флуоресцирующий пигмент.
Картофель. Отмечается хорощий рост с образованием слизи.
Физиологические признаки.
Отнощение к углеводам. Усваивает d-глюкозу, й(-фруктозу, (i-рибозу, глюконат. Не усваивает трегалозу.
Отношение к углеводородам. Использует нафталин, н-алканы, камфору.
Отнощение к источникам питания. Ассимилирует аммонийный и нитратный азот.
Желатину разжижает. Молоко свертывает.
Растет при температуре 30-42°С.
Аэроб. Рост не наблюдается при 4°С.
Предлагаемый щтамм в отличие от известного позволяет за двое суток осуществлять резорбцию нефтяной пленки, утилизируя составные части нефти и мазута.
20Источники информации,
принятые во виимание при экспертизе
25 2. Штамм Pseudomonas aeruginosa 121. Хранится в коллекции музея лаборатории внехромосомной наследственности ИБФМ АН СССР, 1976.
сз 5
tV)
-О
S
Cj
о
S
Q §
.
Время(дни)
Фиг.1
Время (дни.)
Фиг.2.
