Способ получения -лизина Советский патент 1976 года по МПК C12D13/06 

1

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к получению аминокислот с помощью микробной ферментации.

Известен способ получения Ц -лизина

путем выращивания продуцирующих его микроорганизмов, относящихся к одному из роaoBBhev-(bacteh uKH,CohynebQcteh um, устойчивых к аналогам L -лизина, в питательной среде, содержащей усваиваемые источники углерода и азота, неорганические соли, необходимые питательные вещества и органические вещества, стимулирующие рост, при рН от 5 до 9 l.

С целью упрощения процесса и повышения выхода L -лизина из родов В be v bac ;eHum и CohVnebactBe-ium предложено использовать мутантные щтаммы, обладающие наряду с устойчивостью к аналогам лизина потребностью по крайней мере в одном соединении, выбранном из группы, содержащей серии, пролин, аланин, никотинамид, пантотеновую кислоту, тиамин, гуанин, гипоксантин и витамин В| , а именно из родаВ -ВУ Ьасiet ium используют видбос оГе теяЬт штамм

У-108 АТСС 21798, АС-73 АТСС21799 АД-5 АТСС 2180О, АД-162 АТСС 21801, AT-3424 ФЕРМ Р-1711, А1-3425ФЕРМ Р-1712, AT-3429 ФЕРМ Р-1857, AJ 3391 ФЕРМ Р-1570, AT-3394 ФЕРМ Р-1573, AJ-3395 ФЕРМ Р-1574, AJ 3396 ФЕРМ Р-1575, AJ-3392 ФЕРМ Р-1571 или AT-3393 ФЕРМ Р-1572. Из рода11омУ11еЬас в ит используют вид gPutamicUM штамм AJ-3397 ФЕРМ Р-1613, AT -3458 ФЕРМ Р-1982, AT-3460 ФЕРМ Р-1984 или AT-3461 ФЕРМ Р-1985, вид BiSAUm штамм AJ-3464 ФЕРМ Р-2026, вид acetoacJdophiOum штамм AT -3465 ФЕРМ Р-2О27.

В качестве ассимилируемого источника углерода можно использовать углеводы, уксусную кислоту, этанол, В качестве необходимых для роста веществ можно применять природные вещества.

В качестве аналога L -лизина рекомендован S -(2-амино)-Ь -цистеин (АЭЦ).

Индекс ФЕРМ Р указывает на то, что штамм хранится в Исследовательском институте ферментации Управления прикладной науки и технологии Министерства торговли и промышленности Японии, откуда этот штамм может быть получен. Мутанты, нуждающиеся в определенном питательном веществе, были получены путем облучения исходного штамма рентгеновыми лучами или обработкой нитрозогуанидином и последующего выращивания колоний на твердой питательной среде при в течение 4-10 суток. Питательная потребность выделенных ауксотрофных мутантов была определена из вестным способом. Мутации устойчивости к аналогу L -лизина были получены путем повторной обработки ауксотрофных мутантов нитрозогуанидином и выращивания их на синтетической питательной среде с добавлением аналога и необходимого питательного вещества. Некоторые мутанты были получены путем первоначального получения мутации ус тойчивости к аналогу лизина и последующе го введения мутации ауксотрофности. Преимуществом данного способа является получение нового типа мутантов, способ ных образовывать значительные количества L -лизина. Другим достоинством этого способа является отсутствие резкого влияния на биосинтез L -лизина колебаний в содержании L -треонина ,так как штаммы устойчивы к аналогам L -лизина. В качестве ферментационной среды мож но использовать обычные среды, широко применяющиеся в производстве L -лизина. Необходимо только, чтобы в питательно среде присутствовали вещества, нужные для роста мутанта. К числу таких веществ относятся аминокислоты серин, пролин, ала нин, лейцин, различные витамины, наприме витамин BIJ, , тиамин, пантотеновая кислота, никотинамид (или никотиновая кислота пуриновые основания, например гуанин, аде нин, шпоксантин, белковый гидролизат соевых бобов, дрожжевой экстракт, пептон, гидролизат казеина и др. Одним из важных факторов процесса ферментации является содержание в среде требуемых аминокислот и других питательных веществ в количестве ниже того уровня, который является оптимальным для роста штамма. Ферментацию проводят при аэрировании и перемешивании, в течение 24-96 час при температуре 24-37-С. рН среды поддерживают на уровне 5,09,0. Если рН среды в процессе ферментации становится меньше 5, то в среду добавляют мел или водный раствор аммиака. Если в качестве источника углерода используют органические кислоты, то рН имеет тенденцию к повышению и его доводят до необходимого уровня с помощью кислот, например органической кислоты, которую используют в качестве источника углерода, а также с помощью соляной или серной кислоты. L -лизин выделяют из культуральной жидкости обычными методами. Бактериальные клетки могут быть отделены фильтрованием или центрифугированием, а лизин может быть извлечен с помощью катионнообменной смолы. Полученный L -лизин идентифицируют с помощью бумажной хроматографии, методом электрофореза, микробиологическим методом или с помощью лизиндекарбоксилазы. Пример 1. Готовят питательную среду следующего состава: глюкоза - 10,0%, (NH) SO - 5,0%, - 0,1%, MgSO4. - О,О4%, ионы ,2 мг%, ионы - 0,2 мг %, тиамин солянокислый - 50О мкг/л, биотин - 5О мкг/л, белковый гидролизат соевых бобов (содержание азота 7%) - 15 мл/л и мел - 5%, рН среды 7,2. Среду разливают по 20 мл в качалочные колбы объемом 500 мл и стерилизуют. Колбы засевают штаммами, указанными в табл. 1.

Штамм

Bi ev baciehium Bactoferttienium У-108 (ФЕРМ Р-1443) АТСС 21798

Bhev4boctetiuni Bactofer men turn

AC-73 (ФЕРМ P-1444) АТСС 21799 Bt-ev bacte L m Saciolet tnenium

АД-5 (ФЕРМ P-1445) АТСС 218OO Brev bacte um BactofeiHieiit/urM

АД-162 (ФЕРМ P-1446) ATCC 21801 Ферментацию проводят в течение 72 час на качалке при 31 PC. Количество полученного L -лизина (в виде гидpoxлopидajуказано в табл. 1. Питательная, среда для штаммов АС-73 и АД-162 содержала 5 мг/л пантотената кальция и 1ОО мг/л аденина и гуанина соответственно. Клеточную массу штамма У-108 и мел удаляют из культуральной жидкости центри фугированием. 1 л культуральной жидкости пропускают через колонку с катионообменной смолой (Амберлиг J R-120). Затем ti -лизин элюируют 3%-ным водным раство ром аммиака. Элюат концентрируют в вакууме. В сконцентрированный раствор добавляют соляную кислоту и помещают в холодильник для осаждения L -лизина. В результате получают 30,2 г неочищенного кристаллического L -лизина солянокислого. П р и м е р 2, Штаммы те же, что в примере 1, выращивают в посевной питательной среде следующего состава: глюкоза - 1,5% аммоний уксуснокислый - 0,3%, KHgPO. -0,1%, .O - 0,04%, ионы Fe и Мл по 0,2 мг %, биотин 50 мкг/л, тиамин солянокислый - 200 мкг белковый гидролизат соевых бобов (содержание азота 7%) - 15 мл/л и дрожжевой

6 ТаблицаJ

Выход L -лизина, Г/10О мл среды

4Д 2,5 3,0 2,8 экстракт - 0,5%. Начальный рН среды 8,0. Посевной материал выращивают при аэрировании и перемешивании среды в течение 16 час при 31°С. 15 мл посевного материала добавляют к ЗОО мл ферментационной среды следующего состава: глюкоза - 3%, аммоний уксуснокислый - 0,5%, мочевина - 0,2%, ,1%, - 0,04%, ионы Fe и Мп ПО 0,2 мг %, биотин - 50 мкг/л, тиамин солянокислый 50 мкг/л, белковый гидролизат соевых бобов - 30 мл/л и те вещества, которые указаны в табл. 2. Начальный рН среды 7,5. Выращивание осуществляют в ферментерах при перемешивании среды со скоростью 1500 об/мин и пропускании воздуха в количестве 1 об. воздуха на 1 об. среды в 1 мин. Температура 31,5С. В процессе ферментации рН среды поддерживают на уровне 7,2-8,0 путем автоматического добавления смеси растворов уксусной кислоты и аммония уксуснокислого в соотношении 0,2 5 молей аммония уксуснокислого на 1 моль уксусной кислоты, причем концентрация уксусной кислоты равна 60%; через 48 час выход L -лизина солянокислого в культуральной жидкости составляет от 4,8 до 6,4 г/100 мл среды. Результаты приведены в табл. 2.

7

526295

8 Таблица 2

кальция

П р и м е р 3. Штаммы те же, что в примере 1, вьфащивают в течение 16 час на качалке при 31,5°С в посевной среде следующего состава: глюкоза - 1,5%, мочевина - 0,3%, KHjPO - 0,1%, xVHgO - 0,04%, ионы МгГпоО,2мг% биотин - 50 мкг/л, тиамин солянокислый 20 мкг/л, белковый гидролизат соевых бобов - 15 мл/л и дрожжевой экстракт - 0,5%. Начальный рН среды 8,0.

Выращивание проводят в ферментерах при перемешивании среды со скоростью 1500 об/мин и пропускании воздуха в количестве 1 объем воздуха на 1 объем среды в 1 мин. Температура 31,5°С,

В процессе ферментации рН среды поддерживают на уровне 7,0-7,5 путем добавления газообразного аммиака.

Количество этанола в среде определяют с помощью газовой хроматографии и добавляют по мере надобности, когда содержание его в среде ниже 0.3%.

В табл. 3 приведены данные по содержанию L -лизина солянокислого в культуральной жидкости каждого штамма после 48 час ферментации.

15 мл каждой посевной культуры добавляют к 300 мл ферментационной среды следующего состава: глюкоза - 1,0%, этанол1,5%, (N Н) 0,5%, мочевина - 0,2%, - 0.1%, 7И,О - 0,04%, ионы и jvin no 0,2 мг %, биотин 50 мкг/л, тиамин солянокислый - 50 мкг/п, белковый гидролизат соевых бобов - 30 мл/л и те вещества, которые указаны в табл. 3. Начальный рН среды 7,5,

ТаблицаЗ

Пример4. Штаммы - продуценты: Bhevibactehiuhi ftactof-Bt tientvpH AT 3391 (ФЕРМ Р-1570), AJ-3392 (ФЕРМ Р-1571), AT -3393 (ФЕРМ Р-1572), АГ 3394 (ФЕРМ Р-1573), AI-3395 (ФЕРМ

Р-1574), AS -3396 (ФЕРМ Р-1575).

Состав среды и условия культивирования аналогичны примеру 1 за тем исключе нием, что добавляют белковый гидролизат соевъЕс бобов в количествах, указанных в табл. 4, а в среду для штамма AJ -3396 добавляют 50 мл/л гипоксантина.

Результаты по выходу L -лнзнна после 72 час ферментации приведены в табл, 4.

9

526295

10 Таблица 4

Для штаммов AT -3392 и AJ -3393 вы-ч ход лизина 6,3 г/100 мл среды, что составляет 27,7% относительно использованного этанола.

П р и м е р 7. Штаммы - продуценты: BrevibactebHum Qaclofebmentuni AJ 3424 (ФЕРМ Р-17И), AJ -3425 (ФЕРМ Р-1712) и № 872 (контроль). Состав среды и условие культивирования аналогичны

Примере. Штаммы те же, что в примере 7, выращивают в течение 18 час на качалке при 31°С на посевной среде следующего состава: глюкоза - 1,5%, аммоний уксуснокислый - О,3%, мочевина 0,1%, .- 0,1%, M|SO4X7Hj,O 0,04%, ионы 0,2 мг %, биотин - 50 мкг/л, тиамин солянокислый 20О мкг/л, белковый гидролизат соевых бобов (содержание азота 7%) - 2%. Начальный рН среды 7,5. Состав ферментационной среды: глюкоза - 2%, аммоний уксуснокислый - 0,5%, мочевина - .0,2%, КНдРО - 0,l%,MgSO4.x7Hj,O - 0.04%, ионы Fe и Ми по 0,2 мг %, биотин 50 мкг/л, тиамин солянокислый - 50 мкг/л белковый гидролизат соевых бобов (обший азот 7%) - 2,5%. Начальный рН среды 7,5.

После стерилизации к ЗОО мл ферменП р и м е р 9. Штаммы те же, что в примере 7.

Посевной материал выращивают в среде такого же состава, как описано в примере 8, но вместо уксуснокислого аммония добавляют 0,5% этанола и 0,3% мочевины.

Вьфащивание осуществляют в течение 18 час при температуре 31°С в условиях аэрирования.

примеру 1 за тем исключением, что в среду добавляют 200 мкг/л тиамина солянокислого, а в среду для штамма.AT -3425 дополнительно добавляют 3% белкового ги- дролизата соевых бобов.

Данные по выходу L -лизина солянокиолого через 72 час ферментации представле ны в табл. 7i

Таблица 7

тационной среды добавляют 15 мл посевного материала.

Ферментацию ведут в стеклянных ферментерах общим объемом 1 л при перемешивании со скоростью 15ОО об/мин и про пускании воздуха со скоростью 1 объем воздуха в расчете на 1 объем среды в 1 мин. Температура 31-33°С.

В процессе ферментации рН среды поддерживают автоматически на уровне 7,2- 8,0 путем добавления смеси растворов уксусной кислоты и аммония уксуснокислого в следующем соотношении: 0,25 молей уксуснокислого аммония на 1 моль уксусной кислоты. Концентрация уксусной кислоты 60%.

Данные по выходу L -лизина солянокислого через 55 час ферментации представлены в табл. 8.

Таблица 8

Ферментацию ведут вватхгячво примеру 8, но в ферментадЕонную cpcMiy вместо уксусяоквсяого аммсжия добаваяют 1% глкжо зы, 1% этанола и 0,5% свреевяяааяго аммония.

В процессе ферментации рН среды цодгдерживают иа уровне 7,2-8.2 путем ло6л ления газообразного аммиака.

Количество этанола в среде определяют

с помощью газовой хроматографии и производят добавку этанола, когда его содержание в среде становится ниже 0,3%.

Пример 10. Штамм Bhev bQiGteNum fiactofefmeHlum AJ -3429 (ФЕРМ Р1857), Посевной материал выращивают в бульоне. Готовят ферментационную среду следующего состава: глюкоза - 1О%, (N H) 4,5%, - 0,1%, Mg SO - 0,04%, ионы Fe и ,2мг% биотин - 50 мкг/л, тиамин солянокислый - 200 мкг/л, белковый гидролизат соевых бобов (обший азот 7%) - 1%, СаСОд - 5%. Начальный рН среды 7,0.

Среду разливают по 2О мл в качалочные колбы объемом 50О мл и стерилизуют 5 мин при .

Ферментацию проводят в течение 72 час на качалке при 31°С.

Выход L -лизина солянокислого составПример 12. Штаммы - продуценты как в примере 11.

Условия ферментации аналогичны примеру 2 с использованием в качестве основного источника углерода уксусной кислоты за тем исключением, что в питательную среду дополнительно добавл5пот 0,5% дрожжевого

Данные по выходу L -лизина солянокислого после 48 час ферментации приведены в табл, 9.

Таблица 9

ляет 5,1 Г/1ОО мл среды (51% выхода в

расчете на потребленную глюкозу).

Пример 11. Штаммы - продуценты: Co yиefaacleb-iu tl gPutqhi-icum AJ -3397 (ФЕРМ Р-1613), AJ -3458 (ФЕРМ Р 1982), AJ -3460 (ФЕРМ Р-1984), AJ (ФЕРМ Р-1985), Corynebacieh um AJ -3464 (ФЕРМ Р-2026) и Co yl1ebac :eh um acetoaddoph eum AJ 3465 (ФЕРМ Р-2027).

Состав сред и условия культивирования

аналогичны примеру 10 за исключением того, что в среду для штамма AJ -3460 дополнительно вводят 0,5% дрожжевого экстракта.

Данные по выходу L -лизина после

2 час ферментации представлены в табл.Ю.

Таблица 10

экстракта, а рН среды поддерживают на уровне 7,0.

В ферментационную среду, кроме того, добавляют 2,5% белкового гидролизата соевых бобов.

Результаты по выходу L, -лизина после 55 час ферментации представлены в табл., 11.

15

При мер 13. Штаммы - продуценты: CohVheЪolCteh un1 g&utami.cw.nr AI -3397 (ФЕРМ P-1613),Cors/nebaGteNum AI -3464 (ФЕРМ P-2026,CohVnebo(Gi:eHum acetoac lJopИ eu rl AJ -3465 (ФЕРМ Р-2027).

Состав посевной среды: глюкоза- 1,5%, мочевина - 0,3%, 0,1%. Мо - 0,О4%, ионы ,2 мг% биотин - 5О мкг/л, тиамин солянокислый - 200 мкг/л, белковый гидролизат соевых бобов (общий азот 7%) - 1,5%. Начальный рН 7,0.

Посевной материал выращивают в течение 18 час при 31°С при перемешивании и аэрации.

Состав ферментационной среды: глюкоза 1%, этанол - 1%, (NH.),gO,- 0,5%, мочеФормула изобретения 1. Способ получения L -лизина путем выращивания продуцирующих его микроорганизмов, относящихся к одному из родов , Cot ynebaoteNiJm устойчивых к аналогам лизина, в питательной ереце, содержащей усваиваемые источники угле рода и азота, неорганические соли и органические вещества, стимулирующие рост, при рНот5до9, отличающийс я тем, что, с целью упрощения процесса

526295

16 Таблица 11

О,2 мг %, биотин - 50 мкг/л, тиамин солянокислый - 50 мкг/л, белковый гидролизат соевых бобов (общий азот 7%) - 2,5%. Начальный рН 7,5.

После стерилизации 300 мл ферментационной среды засевают 15 мл посевного материала. Ферментацию ведут в стеклянных ферментерах объемом 1 л при температуре 31-33°С, перемешивании и продувании 1 объема воздуха в расчете на 1 объем среды в 1 мин.

В процессе ферментации рН среды поддерживают на уровне 7,2-7,8 путем добавления газообразного аммиака.

Количество этанола определяют с помощью газовой хроматографии и добавляют его при падении уровня этанола в среде ниже 0,3%. и повышения выхода продукта, из родов B-hev bofCler u и и СоьупеЬас егчиж используют один из мутантных штаммов, обладающих наряду с устойчивостью к аналогам лизина потребностью по крайней мере в одном соединении, выбранном из группы, содержащей серин, пролив, аланин, никогинамид, пантотеновую кислоту, тиамин, гуанин, гипоксантин и витамин В, а именно, из родаВгеvibflLetehiujtti используют вид B.Bactofehmentum , штамм У-108 АТСС 21798. АС-73 АТСС 21799, АД-5 АТСС 218OOfc

17

АД-162 АТСС 21801, AJ -3424 ФЕРМ Р-1711, AJ -3425 ФЕРМ Р-1712, AJ 3429 ФЕРМ Р-1857, AJ -3391 ФЕРМ Р-1570, AJ -3394 ФЕРМ Р-1573, AJ 3395 ФЕРМ Р-1574, AJ -3396 ФЕРМ

Р-1575, A3 -3392 ФЕРМ Р-1571 или AJ -3393 ФЕРМ Р-1572, из родаСоьупдfeotG-tenuhi используют видС.2СиЫписи,П1 штамм AJ -3397 ФЕРМ Р-1613, AJ 3458 ФЕРМ Р-1982, AJ -3460 ФЕРМ Р-1984 или AJ -3461 ФЕРМ Р-1985, видС.Рн0Ш№ штамм AJ -3464 ФЕРМ Р-2026, видC.acetoQ c dop 1J6u n, штамм AT -3465 ФЕРМ Р-2О27.

5- Способ по п. 1, отличающийся тем, что аналогом L -лизина является S -(2-аминоэтил)- L -цистеин.

18

Приоритет по п. 1 по признакам:

3O.11.72 L,o(cioleh nenium AT-3425 ФЕРМ P-1712; Brev-i Lactofe mentum AJ -3424 ФЕРМ P-1711.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1. Патент ФРГ № 2034406, кл. 6в16/ОЗ.