Рекомбинантная плазмидная ДНК pBG М3, определяющая синтез эндонуклеазы рестрикции С @ BI Советский патент 1990 года по МПК C12N15/00 

Изобретение относится к области молекулярной биологии, биотехнологии, в частности генетической инженерии, и представляет собой рекомбинантную плазмидную ДНК, определяющую синтез эндонуклеазы рестрикции cfrBI.

Целью изобретения является получение новой плазмиды, содержащей гены системы рестрикции-модификации cfrBI.

Сконструирована новая рекомбинантная плазмида pBG M3 с генами системы рестрикции-модификации (R-M) cfrBI, эффективно экспрессируемыми в Е. coli.

Рекомбинантная плазмида pBG МЗ размером 7,1 т.п.н., кодирующая эндо/

нуклеазу рестрикции cfrBI, является неко,нъюгативной и состоит из Mlul - фрагмента ДНК вектора pMJR 1560 размером 3,9 т.п.н., Mlul - фрагмента ДНК pZE8 размером 3.2 т.п.н., содержащего гены рестрикции и модификации cfrBI, и содержит три участка узнавания R. EcoRV, расположенных на расстоянии 5,0; 1,6 и 0,5 т.п.н.,

три участка узнавания RbcoRI, расположенных на расстоянии 3,8; 2,4 и 0,9 т.п.н.,

два участка узнавания R. Kpnl, расположенных на расстоянии 4,4 и 2,7 т.п.н. ,

и по одному сайту узнавания для рест- риктаз PstI, Hind III, Hpa I, Xho I;

Ыа-ген, ответственный за синтез J-лактамазы, обеспечивающий устойчивость клеток с плазмидой pBG МЗ к ампициллину;

hsd R. GfrBI-ген, кодирующий зндо- нуклеазу рестрикции cfrBI, обеспечивающий ограничение фаге 0 80 vir, hsd M. cfrBI-ген, кодирующий метила- зу cfrBI, обеспечивающий модификацию д нуклеотидной последовательности ЦЦ А/Т А/Т ГГ и защиту ДНК от расщепления рестриктазой cfrBI, ori - репли- кон плазмиды pMBI,

Конструирование рекомбинантной 5 плазмидной ДНК pBG МЗ.

Экстрахромосомальную ДНК, выделенную из Citrobacter freurdii 4111 - продуцента рестриктазы cfrBI, и ДНК плазмиды pBR 322 гидроличуют рестрик- п тазой Pst1 при 37°С в течение 1 ч в буфере А 10 мМ трис НС1, рН 7,5, 50 иМ Nad, 10 i-M MgCl, 1 Mt- дитлотреитол} фермент инактивируют экстракцией ДНК водонасьщенным фенолом, после чего 25 2 мкг Pstl-гидролизата из C tro- bacter freundii смешивают с 0,2 мкг Pstl-гидролизата pBR 322, добавляют АТФ и проводят реакцию в присутствии 0„1 ед. ДНК-лигазы фага 4 при 10°С 16 ч. Лигазу инактивируют прогреванием при 65°С 10 мин и инкубационную смесь используют для трансформации компетентных клеток Е. coli HB101 по описанной методике.

Среди трансформантов, выросших на 3S селективной агаризованной среде с тетрациклином (20-мкг/мл), отбирают чувствительные к ампициллину (50 мкг/мл), которые затем проверяют на наличие системы рестрикции-модификации cfrBI. 40

Проведенный анализ позволяет заключить, что все они являются контранс- формантами делеционных вариантов плазмиды pBR 322 и плазмиды bZE8, кодирующей систему рестрикции-модификации 45 cfrBI.

На следующем этапе в качестве вектора используют ДНК плазмиды pMJR1560, содержащую уникальный сайт Mlul в структурной части гена lad Т1. ДНК pZESso и ДНК pMJR 1560 гидролизуют рестриктазой Mlul в условиях, рекомендованных фирмой New England Biolabs, 4 мкг Mlul-фрагмента ДНК вектора pMJR 1560 дефосфорилируют щелочной йосфатазой ее из кишечника теленка в условиях, рекомендованных фирмой Boehringer Мап- chein, экстрагируют три раза фенолом, один раз хлороформом и дважды переосаждают спиртом, 2 мкг дефосфорили- рованного Mlul Лрагмента pMJR 1560 смешивают с 4 мкг Mlul фрагментов pZE8 и проводят реакцию в присутствии ДНК-лигазы фага Т4 в описанных условиях. Полученной смесью трансформируют компетентные клетки штамма Е. coli К802, трансформанты подращивают 2 ч в бульоне LB, инфицируют фагом SOvir с множественностью заражения 101 и высевают на агаризованную среду, содержащую 50 мкг/мл ампициллина. Из клонов, резистентных к ампициллину, выделяют плазмидную ДНК pBG МЗ известными способами.

Проведен анализ наличия рестриктазы cfrBI в клетках Е. coli.

Для этого клетки Е. coli K802/ /pBG МЗ выращивают в 10 мМ LB бульона до поздней логарифмической стадии роста, собирают центрифугированием, ресуспендируют в 5 мл буфера В, (10 мМ трис НС1, рН 7,5, 50 мМ Nad, 10 мМ ЭДТА, 10 мМ 2-меркаптоэтанола), разрушают ультразвуком, центрифугируют при 6000 об/мин 1 ч для освобождения от клеточных обломков.

Для определения активности готовят разведения экстракта в буфере С (10 м трис НС1, рН 7,5, 50 мМ NaCl, 10 мМ ЭДТА, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 100 мкг/мл 1:10, 1:100, 1:200, 1:400, 1:1000. В инкубационную смесь (9 мкл) содержащую 10 мМ трис-HCl, рН 7,5, 10 мМ MgCU, 7 мМ ДТТ, 50 мМ NaCl, 1 мкг ДНК фага Д с 1857 добавляют 1 мкл соответствующих разведений экстракта и инкубируют при 37 С в течение 1 ч. Результаты гидролиза проверяют с помощью электрофореза.

1 мл полученного экстракта содержит до 2x10 единиц активности.

Таким образом, получена рекомбинан тная плазмида pBG МЗ, содержащая гены системы рестрикции - модификации cfrBI. Данная плазмида обеспечивает сравнительно высокий уровень синтеза эндонуклеазы рестрикции cfrBI. Наличие детерминанты резистентности к ампициллину позволяет переносить плазми ду pBG МЗ путем трансформации в разные штаммы Е. coli, оптимизировать культивирование целевых штаммов и выращивать штамм продуцент в селективных условиях. i Формула изобретения

Рекомбинантная плазмидная ДНК pBG МЗ, определяющая синтез эндонуклеазы

515

рестрикции cfrBI размером 7,1 т.п.н., содержащая: Mlul - фрагмент ДНК вектора pMJR 1560 размером 3,9 т.п.н., Mlul - фрагмент ДНК pZE8 размером 3,2 т.п.н. с геном системы рестрикции- модификации cfrBI,

сайты рестрикции:

три участка узнавания рестриктазой EcoRV, расположенных на расстоянии 5,0 т.п.н., 1,6 т.п.н; 0,5 т.п.н,

три участка узнавания рестриктазой Ec6RI, расположенных на расстоянии 3,8 т0п.н, 2,4 т.п.н, 0,9 т.п.н;

два участка узнавания рестриктазой Kpnl, расположенных на расстоянии

266

4,4 т.п.н, 2,7 т.п.н;

-уникальные участки узнавания для рестриктаз PstI, Hindlll, Hpal и

Xhol;

-генетические маркеры: Ыа-ген, ответственный за синтез

р- лактамазы, обеспечивающий устойчивость клеток к ампициллину; hsd R

cfrBI-ген, кодирующий эндонуклеазу

рестрикции cfrBI, обеспечивающий ограничение фага (4 SOvir; hsd M cfrBI-ген, кодирующий метилазу cfrBI, обеспечивающий модификацию нуклеотидной последовательности ЦЦ А/Т А/Т ГГ и защиту ДНК от расщепления рестриктазой.

Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии, в частности генетической инженерии, и представляет собой рекомбинантную плазмидную ДНК, определяющую синтез эндонуклеазы рестрикции CFRBI. Целью изобретения является получение новой плазмиды, содержащей гены системы рестрикции-модификации CFRBI. Для достижения цели сконструирована новая рекомбинантная плазмида PBG МЗ с генами системы рестрикции-модификации (R-M)CFRBI, эффективно экспрессируемыми в Е. COLI. Гены R-M системы выделены из экстрахромосомальной ДНК CITROBACTER FREUNDII 4111 и методами генетической инженерии перенесены в Е.COLI.