Способ определения антиокислительной активности карнозина Советский патент 1993 года по МПК G01N21/76 A61K37/02 

Изобретение относится к медицине, в частности к медицинской технологии и фармакологии, а именно к способам биологического тестирования различных лечебных препаратов.

Цель изобретения - увеличение точности способа, уменьшение расхода изучаемого вещества, ускорение и упрощение способа,

Цель достигают тем, что изучается расход гипохлорида натрия при взаимодействии с различными сериями карнозина.

Согласно современным взглядам на патогенез ряда заболеваний, для которых характерно воспаление и деструкция собственных тканей в очаге поражения, в качестве основного поражающего агента может выступать гипохлорид натрия. Поэтому антаврспалительное, ранозаживляющее действие, и другие терапевтические эффекты карноэина (как и тауфона-таурина) могут в значительной степени быть обусловлены именно способностью нейтрализовать токсическое действие гипохлорид-аниона. Поэтому мы считаем, что изучение нейтрализующего действия различных серий карнозина в реакции с гипохлорид-анионом может наиболее отражать его антиокислительную активность. О таком взаимодействии можно судить спектрофотометрически по уменьшению характерного для гипохлорид-аниона поглощения при 292 нм.

Способ осуществляется следующим образом.

Карнозин растворяют в дистиллированной воде до конечной концентрации 1 мМ. При это объем раствора карнозина, требуемый для исследования, составляет 1 мл; это означает, что для тестирования каждой серии требуется всего около 0,2 мг вещества. Об антиокислительной активности карнозина судят по параметру А (А0 - А+)/А0, где АО - оптическая плотность 2,5 мМ плотность 2,5 мМ раствора гипохлорида натрия при 292 нм; А+ - оптическая плотность 1 мМ раствора карнозина, к 1 мл которого добавили 1 мл 5 мМ раствора гипохлорида наСО

G

00

о

4 СлЭ СЛ СА

трия. Чем выше параметр А, тем выше антиокислительная активность карнозина.

Пример 1. Для исследования взят карнозин фирмы Sen/a (США), который использовался в исследованиях без какой-либо предварительной очистки. Приготовлено 1 мл раствора карнозина, для чего было взято около 0,2 мг порошка вещества. Затем к полученному раствору добавили 1 мл раствора гипохлорида натрия и сразу после смешения измерялась оптическая плотность смеси двух растворов при 292 нм А+ 0,4177. Затем определяли поглощение раствора гипохлорида натрия при 292 нм без добавок) параметр А0 1.5671). О биологической эффективности карнозина судили по параметру А (А0 - А+)/А0, которая для коммерческого карнозина фирмы Serve (США) была равна 0,32±0,04 относительных единицы. Анализ занял около 5 мин/состоял из двух операций.

Параллельно определению расхода гипохлорида для карнозина фирмы Sen/a (США) проводили определение антиокислительной активности препарата согласно способу-прототипу.

Для этого получали сыворотку крови крысы, на что уходило 50 мин, добавляли 0,2 мл ее к 10 мл дистиллированной врды. Затем 5 мг карнозина, растворенного в дистиллированной водо, вносили в полученный раствор сыворотки. Такой раствор с добавленным карнозином ставили на магнитную мешалку и активировали окисление сыворотки внесением в систему 1 мл 60 мМ раствора FeSCM. Через каждые 20 мин отбирали по 0,8 мл и смешивали с таким же объемом 20%-ной трихлоруксусной кислоты, спустя 20 мин от смешения каждую пробу центрифугировали в течение 20 мин при 10000 д, к полученному супернатанту добавляли 0,5% раствора тиобарбитуровой кислоты (ТБК) и кипятили полученный раствор в течение 60 мин. Количество ТБК-активных водорастворимых продуктов перекисного окисления оценивали по их флуоресценции в области 530-580 нм. Для возбуждения флуоресценции использовали свет с длиной 515 нм, ширина щели - 3 нм..

В качестве контроля использовали окисление той же сыворотки без добавления карнозина. Об эффективности препарата судили по величине подавления им в описанной системе ТБК-активных продуктов перекисного окисления: S R/Fi Vn, где Ft- интенсивность флуоресценции контроля за i-тый промежуток времени окисления, F - интенсивность опытного образца (с 2,2 мМ карнозина) за 1-гый промежуток времени окисления, п - количество измерений. Чем выше эта сумма, тем больше биологическая эффективность препарата кзрнозина. Точность данного метода зависит от времени проведения анализа: для статически достоверных различий достаточно уже взять четыре пробы, т.е. достаточно проводить окисление в присутствии карнозина в течение 80 мин. Для карнозина фирмы Serva

(США), который использовали в исследованиях без какой-либо предварительной очистки ii 1,81 ±0,3.

Суммарный расход карнозина для такого анализа составлял 5 мг, ингибирующая концентрация в суммарном растворе сыворотки и FeSCM-2,2 мМ, время анализа -3,4 ч, количество операций - 5.

П р и м е р 2. Для исследования взят

карнозин фирмы Serva (США), который использовался в исследованиях с предварительнойочисткой (одна перекристаллизация). Приготовлено 1 мл 2 мМ раствора карнозина, для чего было взято

около 0,2 мг порошка субстанции. Затем к полученному раствору добавили 0,8 мл раствора гипохлорида натрия и сразу после смешения измеряли параметр А также, как в примере 1. Этот пример был равен

0,33+0,03 относительных единицы,

Анализ занял около 5 мин, состоял из двух операций.

Для этой же серии карнозина так же, как в примере 1, проводили определение антиокислительной активности препарата соп. гласно способу-прототипу. Параметр Zj ,

отражающий антиокислительную активность был равен 1,21 ±0,2.

Суммарный расход карнозина для такого анализа составлял 5 мг, ингибирующая концентрация в суммарном растворе сыворотки и FeSCM - 2,2 мМ, время анализа - 3,5 ч, количество операций - 5,

П р и м е р 3. Для исследования взят карнозин фирмы Serva (США), который использовался в исследованиях с предварительнойочисткой (фи перекристаллизации), Приготовлено 1 мл 2

Q мМ раствора карнозина, для чего было взято около 0,2 мг порошка субстанции. Затем к полученному раствору добавили 0,8 мл раствора гипохлорида натрия и сразу после смешения измеряли параметр А также, как

g в примере 1, Этот параметр был равен 0,35±0,03 относительных единиц.

Анализ занял около 5 мин, состоял из двух операций.

Для этой же серии карнозина так же, как в примере 1, проводили определение антиокислительной активности препарата соп, гласно способу-прототипу. Параметр 2|,

отражающий антиокислительную активность был равен 1,0±0,3.

Суммарный расход карнозина для такого анализа составлял 5 мг, 50% ингибирую- щая концентрация в суммарном растворе сыворотки и FeSCM для этой серии образцов не достигалась даже для 100 мМ концентрации карнозина, время анализа - 3,5 ч, количество операций - 5.

Пример 4. Для исследования взят карнозин, выделяемый из мяса крупного рогатого скота по оригинальной методике, разработанной на кафедре биохимии МГУ и внедренной на Ленинградском заводе мед- препаратов мясокомбината им.С.М. Кирова. Следует отметить, что по уравнению с коммерческим выпускаемым дипептидом, продукт из мяса обладает рядом особенностей, которые позволяют его считать более чистым, лишенным примесей от реагентов химического синтеза. Приготовлено 1 мл 2 мМ раствора карнозина, для чего было взято около 0,2 мг порошка субстанции. Затем к полученному раствору добавили 1 мл раствора гипохлорида натрия и сразу после смешения измеряли параметр А также, как в примере 1, Этот параметр был равен 0,31 ± 0,06 относительных единиц.

Анализ занял около 5 мин, состоял из двух операций.

Параллельно определению расхода гисталлизованный коммерческий препарат фирмы Serva (США) демонстрировал согласно способу-прототипу даже меньшую антиокислительную активность по сравнению с неочищенным препаратом фирмы

5 Serva (США). С другой стороны, новый способ тестирования дает величины А 0,32±0,04, 0,33±0,03, 0,35±0,03 и 0,31 ±0,06 относительных единиц для разных серий карнозина, что реально отражает

10 его антиокислительную активность, так как неочищенные коммерческие образцы содержат, согласно данным нашего анализа, более высокое содержание химически реак15 тивных компонентов - антиоксидантов, которые блокируют окисление в способе-прототипе. По мере очищения синтетического коммерческого карнозина пу- . тем перекристаллизации происх одит

20п.

уменьшение параметра 2,1 , который оценивается в способе-прототипе, но нет статистически значимых изменений параметра А согласно новому способу. Следовательно,

25 использование способа-прототипа не позволяет с достаточной точность определять антиокислительную активность карнозина разного происхождения или разных серий. Напротив, по сравнению со спо30 собом-прототипом новый способ обладает большей точностью/позволяет уменьшить расход изучаемого вещества (0,2 мг в HQBOM способе и 5 мг в способе-прототипе согласно примерам 1-4), ускорить (5 мин в новом

похлорй$а для карнозина из мяса проводи- 35 способе и 3,5 ч в способе-прототипе) и упро- ли биологическое тестирование препарата согласно способу-прототипу. Для этого также ка.|с. .-Примере 1 определяли параметр

Si 0,8±0,2, характеризующий эффективность подавления карнозином образования вторичных перекисных продуктов. Суммарный расход карнозина для такого анализа составлял 5 мг, 50% ингибирующая концентрация в суммарном растворе сыворотки к РеЗСм для.этой серим образцовое достигалась даже для 100 мм концентрации карнозина, время анализа - 3,5 ч.

40

45

стить способ (2 в новом способе и 5 процедур в способе-прототипе согласно примерам 1-4).

Формула изобретения Способ определения антиокислительной активности карнозина путем добавления окислителя к раствору карнозина с последующей регистрацией оптических свойств пробы, отличающийся тем, что, с целью ускорения и упрощения способа, регистрируют изменения оптической плотности пробы, при 292 нм в качестве окислителя используют гипохлорид на.Из приведенных примеров 1-4 можно убедиться, что карнозин, выделяемый из мя- ,.. трия. са крупного рогатого скота, или перекриСоставитель О. Батдиева. Редактор С. Кулакова Техред М.Моргентал Корректор М, Керецман

Заказ 1374Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

сталлизованный коммерческий препарат фирмы Serva (США) демонстрировал согласно способу-прототипу даже меньшую антиокислительную активность по сравнению с неочищенным препаратом фирмы

Serva (США). С другой стороны, новый способ тестирования дает величины А 0,32±0,04, 0,33±0,03, 0,35±0,03 и 0,31 ±0,06 относительных единиц для разных серий карнозина, что реально отражает

его антиокислительную активность, так как неочищенные коммерческие образцы содержат, согласно данным нашего анализа, более высокое содержание химически реактивных компонентов - антиоксидантов, которые блокируют окисление в способе-прототипе. По мере очищения синтетического коммерческого карнозина пу- тем перекристаллизации происх одит

п.

уменьшение параметра 2,1 , который оценивается в способе-прототипе, но нет статистически значимых изменений параметра А согласно новому способу. Следовательно,

использование способа-прототипа не позволяет с достаточной точность определять антиокислительную активность карнозина разного происхождения или разных серий. Напротив, по сравнению со способом-прототипом новый способ обладает большей точностью/позволяет уменьшить расход изучаемого вещества (0,2 мг в HQBOM способе и 5 мг в способе-прототипе согласно примерам 1-4), ускорить (5 мин в новом

способе и 3,5 ч в способе-прототипе) и упро-

способе и 3,5 ч в способе-прототипе) и упро-

стить способ (2 в новом способе и 5 процедур в способе-прототипе согласно примерам 1-4).

Формула изобретения Способ определения антиокислительной активности карнозина путем добавления окислителя к раствору карнозина с последующей регистрацией оптических свойств пробы, отличающийся тем, что, с целью ускорения и упрощения способа, регистрируют изменения оптической плотности пробы, при 292 нм в качестве окислителя используют гипохлорид натрия.

Использование: медицинская биохимия. Сущность изобретения: к 1 мл 1 мМ раствора карнозина добавляют 1 мл 5 мМ раствора гипохлорида натрия и спектрофо- тометрируют при 292 нм. Антиокислительную активность дипептида карнозин определяют по параметру А (А0 - А+)/А0, где Аб - оптическая плотность 2,5 мМ раствора гипохлорида натрия при 292 нм, А+ - оптическая плотность 1 мМ раствора карнозина. Изобретение позволяет упростить и ускорить способ определение антиокислительной активности карнозина.