Способ определения содержания фибронектина в биологических жидкостях Советский патент 1991 года по МПК G01N33/53 

(21)4642708/14 (22)27.01 89 (46)23.10.91. Бюл. №39

(71)Кемеровский государственный медицинский институт

(72)И.Н. Овчарук, Н.А. Федоров и В А Котиков

(53)615.475(0888)

(56)Y. Lab.Clln Med ,1985.106 4, р 173-180

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ФИБРОНЕКТИНА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ

(57)Изобретение относится к области медицины, преимущественно к гематологии и трансфузиологии, хирургии, терапии, инфекционным заболеваниям, и может быть использовано для определения количества функционально активного фибронектинэ в

биологических жидкостях Цель изобретения - повышение специфичности и чувствительности способа определения содержания функционально активного фибронектина Положительный эффект достигается определенной последовательностью приемов обработки поверхности формалинизирован- ных эритроцитов барана при следующих соотношениях компонентов 1 объем 100%-ных формалинизированных эритроцитов барана 1 обьем 10%-ного медицинского желатина. 1 объем 25%-ного глютарового альдегида и 9 объемов фосфатного буфера. Количественное определение функционально активного фибронектина основано на торможении реакции гемагглютинации желатином, содержащимся в инкубационной среде, с последующим вычислением концентрации фибронектина по предлагаемой формуле

Ј

(Л

Изобретение относится к области медицины, преимущественно к гематологии и трансфузиопогии, хирургии, терапии, инфекционным заболеваниям и может быть использовано для определения количества функционально активного фибронектина в биологических жидкостях

Целью изобретения является повышение специфичности и чувствительности за счет определения содержания функционально активного фибронектина

Пример 1. В качестве биоспецифического сорбента используются формалинизи- рованные эритроциты барана тип 2 (Уфимского НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова). Их отмывают от консерванта 0,2 М фосфатным буфером рН 7 2-7.3.

инкубируют в 0,5 М трис-HCI буфере рН 7,4-7,6, содержащим 10 мМ CaCl2 и 0.01% трипсина, при 37°С в течение 30 мин. Трипсин и продукты гидролиза удаляют 3-4- хкратной промывкой 0,05 М трис-HCI буфером рН 7,4-7,6 и затем промывают 0,9%-ным раствором хлористого натрия.

В центрифужную пробирку вносят 900 мкл фосфатного буфера рН 7,2-7,3, 100 мкл, обработанных трипсином эритроцитов барана. 100 мкл 10%-ного медицинского желатина и 100 мкл 25%-ного раствора глутарового альдегида. Перемешивают и инкубируют 30 мин при 37°С. Полученный диагностикум промывают 3-4 раза фосфатным буфером рН 7,2-7,3 и к осадку эритроцитов добавляют 3 мл 1%-ного раствора

О 00 Оч СО О

бычьего сывороточного альбумина в IM NaCI

Постановку РТПГА выполняли следующим образом.

В начале исследования устанавливают количественное соотношение желатина и фибронектина, при котором наступает торможение реакции гемагглютинации. Для этой цели используют планшеты для иммунологических исследований отечественного производства Неспецифическая сорбция и спонтанная гемагглютинацич эритроцитов устраняется проведением реакции в растворе 1%-ного бычьего сывороточного альбумина, приготовленного на IM растворе хлорида натрия. Данный раствор альбумина используется для разведения желатина С этой целью в восемь пробирок вносят по 1 мл раствора альбумина Затем в первую пробирку приливают 1 мл 0,1%-ного раствора желатина, перемешивают и 1 мл из первой пробирки переносят во вторую, перемешивают и 1 мл из второй пробирки переносят в третью и т д. Таким образом, получают следующие концентрации желатина 0,05%, 0,025%, 0.0125%. 0.00625%, 0,003125%, 0,0015625%, 0,00078125%, 0,00039%. В каждую ячейку планшета первого ряда слева направо вносят по 50 мкл 0 05%-ного раствора желатина: во второй ряд ячеек - 0,025% раствора желатина, в третий - 0,0125%-ный раствор желатина и тд Затем в первую ячейку первого ряда добавляют 50 мкл раствора фибронектина с известной концентрацией (например - 625 мкг/мл) и после перемешивания 50 мкл из первой ячейки переносят во вторую и т д Из 11 ячейки 50 мкл выбрасывают. 12 ячейка служит контролем и не содержит фибронектина Аналогич- ным образом готовят ряд разведений фибронектина в остальных восьми рядах ячеек. Таким образом, концентрация желатина уменьшается в ряду сверху вниз, а содержание фибронектина снижается в каждом ряду слева направо В каждую ячейку, начиная с контрольной, т е. справа налево, вносят по 25 мкл 1 %-ной взвеси эритроцитов барана (дьагностикум). Тщательно перемешивают и оставляют на 2-3 часа при комнатной температуре. Образование кольца в виде венчика указывает на гемагглютинацию, а выпадение эритроцитов на дно ячейки в виде точки свидетельствует об отсутствии гемагглютинации. В каждом ряду находят ячейку, где реакция гемагглютинации отрицательная и на основании данных концентраций желатина и

фибронектина вычисляют отношение желэ- тин/фибронектин. Оно характеризует то минимальное соотношение концентраций желатина и фибронектина, при котором на- ступает полное торможение реакции гемагглютинации

Согласно полученным данным это соотношение равно 6 4 и зависит только от чис- тоты и источника желатина

Для определения содержания фибронектина в исследуемой жидкости выбирают, в зависимости от предполагаемого его количестна, раствор желатина (например. 0,0125%-ный раствор) и вносят его по 50 мкл во все ячейки планшета Затем в ячейку первого ряда добавляют 50 мкл исследуемой жидкости, перемешивают и методом переката слева направо готовят ряд разведений. 50 мкл из 11 ячейки выбрасывают, 12 ячейка служит контролем и содержит только раствор желатина. Во втором ряду ячеек готовят аналогичным образом разведение

нового образца исследуемой жидкости. Таким образом на одном планшете для имму- нологических исследований проводят определение количества фибронектина в восьми образцах проб. Далее, начиная с

контрольных ячеек, вносят по 25 мкл 1%- ной взвеси диагностикума, перемешивают и оставляют при комнатной температуре до завершения реакции торможения гемагглютинации (40- 60 минут). Затем в каждом ряду

находят ячейку начала торможения реакции гемагглютинации. Содержание фибронектина определяют по следующей формуле, содержание фибронектина

40

количество желатина л „п 6,4 AVU

где

в знаменателе - полученный коэффициент соотношения желатин/фибронектин 6,4;

в числителе - количество желатина в ячейках ряда;

А - разведение исследуемой пробы в ячейке начала торможение гемагглютинации;

20 - коэффициент перевода данных на

1 мл исследуемой пробы

При сравнительном определении содержания фибронектина в 5 образцах плаз- мы крови человека методом реакции торможения пассивной гемагглютинации и реакцией агрегации частиц латекса получены следующие результаты:

Преимуществами предлагаемого способа определения содержания функционально активного фибронектина в биологических жидкостях по сравнению с прототипом являются:

Высокая (в 10 раз) чувствительность, что позволяет определять содержание фибронектина в спинномозговой и амниотической жидкостях, где его концентрация находится в пределах 50 мкг/мл. Введение в систему желатина исключает возможность неспеци- фической.агглютинации. Способ позволяет одновременно вести в идентичных условиях определение содержания фибронектина в 8-12 пробах, он менее трудоемок и не требует специальной аппаратуры.

Формула изобретения Способ определения содержания фибронектина в биологических жидкостях путем внесения в исследуемую пробу сенсибилизированных желатином корпускулярных частиц сорбента с последующим определением количества фибронектина по титрам реакции агрегации частиц, отличающийся тем, что, с целью повышения специфичности и чувствительности за счет

определения содержания функционально активного фибронектина, в качестве частиц сорбента используют формалинизирован- ные эритроциты барана, при этом их сенсибилизируют путем предварительной

трипсинизации и промывки с последующей инкубацией с желатином в присутствии глу- тарового альдегида в течение 30 мин при 37°С, далее реакцию ведут в среде, содержащей 1 объем 100%-ных формалинизированных эритроцитов барана, 1 объем 10%-ного медицинского желатина, 1 объем 25%-ного глутарового альдегида и 9 объемов фосфатного буфера, а количество функ- ционально активного фибронектина

определяют по титрам реакции торможения гемагглютинации.