Способ получения иммобилизованных протеолитических ферментов Советский патент 1982 года по МПК C12N9/48 C12N11/16 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ

Изобретение относится -к медицине и технологии новых биологически активных соединений и может найти применение в производстве иммобилизованных ферментных препаратов для экспериментальных и лечебных целей.

Известен способ получения иммобилизованных протеолитических ферментов, в частности, химотрипсина, путем связывания с носителем-карбоксиметилцеллюлозой азидным методом 1.

Однако полученные таким способом препараты не могут быть использованы в медицине и в биологических иследованиях, связанных с парентергшьным введением их в организм, поскольку используемый носитель чужероден и небезвреден для организма.

Известен способ получения иммобилизованных протеолитических ферментов с использованием в качестве носителя целых эритроцитов, предварительно активированных бифункциональным реагентом - глутаровым альдегидом Из.

Однако получаемый препарат, хотя и является биосовместимым, характеризуется невысокой удельной активностью.

обусловленной малой емкостью химического связывания целых эритроцитов.

Целью изобретения является повышение активности получаемого продукта.

Указанная цель достигается тем, что при осуществлении способа получения иммобилизованных протеолитичес- ких ферментов путем связывания фермен10та с носителем, предварительно активированным глутаровым альдегидом, в качестве носителя используют мембраны эритроцитов.

В качестве прютеолитических фер15ментов используют трипсин, химотрипсин, папаин, фибринрлизин.

Пример. Способ получения иммобилизованного трипсина . Эритроциты из 20 мл свежей крови кролика с

20 добавлением 1/10 части по объему 3,8%-ного цитрата натрия получают центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин и промывают их 2 рааа четырехкратными объемами раство25ра 0,15 М хлористого натрия. Осадок эритроцитов (8 мл) гемолизируют 5 объемами холодной дистиллированной воды. Мембраны осаждают, про«1вают 5 раз пятикратныют объемами холодной

30 дистиллированной воды и отделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин. К осадку мембран (3 млJ добавляют 2,2 объема (6,6 мл 0,1%-ного раствора глутарового диаль дегида на 6,1 М фосфатном буфере, рН 6,8 и инкубируют в течение.1 ч при качании на шуттель-аппарате при комнатной температуре 4-20с. Затем суспензию отмывают центрифугирование при 3000 об/мин в течение 10 мин 4 раза десятикратными объемами холод ной дистиллированной воды. Полученны осалок (2,5 мл ) инкубируют с равным объемом раствора кристаллического Трипсина на 0,1 М фосфатном буфере, рН 6,8, так, что конечная концентрация трипсина составляет 10 г/мл. Инкубацию проводят в течение 6-12 при качании на шуттель-аппарате при +4С. Полученный препарат иммобилизованного трипсина на тенях эритроцитов отмывают десятикратными объемами холодной дистиллированной воды 7 раз до полндго отсутствия активности фермента в последней порции отмывающего раствора и осаждают центрифугированием в течение 15 минут при 3000 об/мин. Таким образом получают препарат трипсина, иммобилизованного на мембранах эритроцитов. Одновременно получают препарат трипс на, иммобилизованного по прототипу на целых эритроцитах кролика. В полученных препаратах определяют активность трипсина методом Ji.Hеена и соотношения фермента и нбсителя. Активность в получаемом препарате 98-114-1оед/г. Препарат,; полученный известным способом, обладае активностью 3553 ед/г. П р и М е р 2. Способ получения иммобилизованного химотрипсина. Мембраны эритроцитов получают и обрабатывают глутаровым альдегидом как описано в примере 1. Концентрация химотрипсина в смеси при инкубации с мембранами составляет 10 мг/мл. Время инкубации 10-12 ч. -Полученный препарат обладает активностью 32880 342000 ед/г. Препарат, полученный по способу-прототипу, обладает активностью 3051 ед/г. Примерз. Способ получения иммобилизованного фибринолизина. Мембраны эритроцитов получают и обрабатывают как описано в примере 1. Концентрация фибринолизина в смеси при инкубации, с мебранами составляет 15 мг/мп. Длительность инкубации 10-12 ч. Получают препарат с активностью 53300-118518 ед/г. Препарат, полученный по способу-прототипу, обладает активностью 320,4 ед/г. Пример 4. Способ получения . иммобилизованного папаина. Мембраны эритроцитов получают и обрабатывают как описано в примере 1. Концентрация папаина в смеси при инкубации с мембранами составляет 10 мг/мл. Время инкубации 8-12 ч. Получают препарат с активностью 9530-11625 ед/г. Препарат, полученный по.способу-прототипу, обладает активностью 874 ед/г. Технико-экономическая эффективность изобретения заключается в значительном повышении активности получаер4ах продуктов. Формула изобретения 1.Способ получения иммобилизойанных протеолитических ферментов путем связывания фермента с носителем, предварительно активированным глутаровым альдегидом, отличающийся тем, что, с целью повышения активности получаемого продукта, в качестве носителя используют мембраны эритроцитов. 2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве протеолитических ферментов используют трипсин, химотрипсин, папаин, фИбрИНОЛИЗИН, Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1.Иммобилизованные ферменты. Под ред. И.В. Березина, Т. 1, МГУ, 1976. 2.Терешин И.М.., Москвичев Б.В. Иммобилизованные ферменты в медицине и медицинской промышленности.В кн. Иммобилизованные ферменты. Тезисы II Всесоюзного симпозиума получения и применения иммобилизованных ферментов. М., 1976.