Способ диагностики внутриутробного инфицирования ягнят бруцеллезом Советский патент 1993 года по МПК A61K39/00 

Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано для иммуноло- гической диагностики внутриутробного инфицирования.

Целью изобретения является повышение точности способа диагностики внутриутробного инфицирования.

Способ осуществляется следующим образом.

У новорожденного сразу после рождения до кормления молозивом берут кровь из яремной вены и пробу первородного кала (меконий) из прямой кишки. Определяют наличие специфических антител к возбудителю в преколостральной сыворотке крови новорожденного и антигенов патогена в суспензии мекония. При обнаружении в крови новорожденного до кормления молозивом специфических антител и антигенов в пробе мекония диагностируют внутриутробное инфицирование.

Предлагаемый способ апробирован на новорожденных ягнятах из неблагополучных по бруцеллезу отар и поясняется следующими примерами,

П р и м е р 1. Для определения наличия специфических антител в преколостральной сыворотке крови ягнят с помощью иммуно- ферментного анализа (ИФА) на полистироловую 96-луночную панель для микротитрования сорбируют единый бруцеллезный антиген в разведении 1:100 в 100 микролитрах(мкл) забуференного физиологического раствора(ЗФР) рН 7,2-7,4 при 4°С в течение ночи. Затем панель отмывают 3 раза ЗФР с 0,05% твином-20 (ЗФР-Тв) и 3 раза ЗФР, готовят в лунках панели двукратные разведения лреколостральной сыворотки крови (1:2 и выше) в объеме 100 мкл ЗФР-Тв. После инкубации в течение 1,5 ч при 37°С панель отмывают описанным способом и в лунки вносят антитела кролика против иммуноглобулинов овцы, меченные пероксидазой, в рабочем разведении в ЗФР-Тв. Через 1 ч после инкубации при 37°С повторяют процедуру отмывки с целью удаления несвязанных продуктов реакции,

fe

00

СА) -N СЛ О

а количество связавшегося фермента, а значит, и антител против бруцеллезного антигена определяют количественно по распаду субстрата - H2U2 в присутствии хромогена- ортофенилендиамина. Положительная реакция характеризуется коричневым окрашиванием и просчитывается на фотометре при длине волны 492 нм. Превышение оптической плотности в 2 раза и более в лунках с испытуемыми сыворотками над контролем оценивается как положительная реакция.

П р и м е р 2. По примеру 1 были исследованы преколостральные сыворотки крови 123 ягнят, полученных от овцематок неблагополучной отары по бруцеллезу. Из общего числа обследованных ягнят у 45,5% животных в крови обнаружены антитела к бру- целлам. Результаты ИФП сывороток крови 30 новорождённых, представлены в табл,1.

Как видно из табл.1, титры, противобру- целлезных антител в крови новорожденных были различными. Так например, если у ягнят под инвентарными номерами 3041, 3001, 3082 и 3067 титры антител были одинаковыми 1:2, тогда как с особей под номерами 3081, 3005, 3014 и 3051 значения названного показателя составили соответственно 1:8, 1:256, 1:2048 и 1:8192. Полученные данные указывают на нарушения функции плацентарного барьера, имевшие место в период суягности и возможность инфицирования плодов гематогенным путем. .

ПримерЗ. Для исследования пробы мекония в ИФА на наличие бруцеллезного антигена ее заливают 0,85%-ным раствором NaCI в соотношении 1:10, гомогенезируют, прогревают 15 мин при 100°С в водяной бане, центрифугируют 10 мин при 2000 об/мин и надосадочную жидкость используют в качестве исследуемого образца.

На полоску нитроцеллюлозной бумаги (45х5мм) в 8-ми точках наносят раствор мо- ноклональных антител (МонАт), против антигенов бруцелл, в двукратно убывающей концентрации начиная с 160 мкг/мл в количестве 1 мкл. (В работе были использованы полученные нами МонАт, продуцируемые Штаммом гибридных культивируемых клеток животных Mus MusculusL - продуцент моноклональных антител к бактериям рода Brucella Авт,св. 1604848, опублик. Бюл,41, 1990г.). Свободные участки носителя блокируют 1% бычьим сывороточным альбумином в ЗФР при 37°С 1 ч. Затем полоску отмывают по 3 раза ЗФР-Тв и ЗФР и инкубируют при 37°С в течение 1 ч в исследуемом образце. Повторяют процедуру отмывки и носитель переносят в раствор

МонАт, меченных пероксилазой, и инкубируют при 37°С 1 ч. После тщательной отмывки полоску переносят в раствор субстрата - Нз02 в присутствии 4-хлор-1-нафтола им выдерживают в течение 3-5 мин. Затем отмывают дистиллированной водой и высушивают на воздухе. Положительная реакция, которая отмечается в случае присутствия в образцах бруцеллезного антигена,

0 характеризуется появлением на местах нанесения МонАт серо-фиолетовых точек.

Пр и м е р 4, По примеру 3 были анализированы 123 пробы мекания ягнят из числа исследуемых по примеру 2 и установлено

5 наличие бруцеллезного антигена в первородном кале у 65,8% новорожденных. Результаты ИФА первородного кала 30 животных в сравнении с анализом сывороток крови, полученным по примеру 2, пред0 ставлены в табл.2.

Как видно из табл.2, у 17 новорожденных выявлены как антигены бруцелл в пробах первородного кала, так и специфические антитела. Полученные данные свидетельству5 ют о том, что отсутствие специфических антител преколостральной сыворотке крови новорожденного не служит доказательством не инфицированности плода. Так, например, у 2 голов при рождении в крови

0 отсутствовали противобруцеллезные антитела, однако в пробах мекония выявлены антигены бруцелл. Данный пример указывает на заражение плода при нормальном функционировании плацентарного барьера

5 путем проглатывания инфицированной ам- ниотической жидкости, У 9 голов не выявлены антигены возбудителя, однако в сыворотке крови имелись специфические антитела к бруцеллам, что является доказа0 тельством повышенной проницаемости плаценты и инфицирования плода гематогенным путем.

Способы диагностики инфекционных болезней, основанные на обнаружении ан5 тител, известны и широко используются в медицинской и ветеринарной практике. Однако обнаружение антител у новорожденных сельскохозяйственных животных еще не свидетельствуют об инфицированности

0 организма, поскольку эти антитела могут быть материнского происхождения. Если взятие крови у новорожденного будет осуществляться после скармливания молозива, то в сыворотке крови могут обнаруживаться

5 антитела материнского происхождения.

Предлагаемый способ отличается тем, что пробы крови у новорожденного берутся до первого кормления молозивом. Это очень важно, поскольку у сельскохозяйственных животных с десмохориальным и

эпителиохориальным типом плацентации антитела через плаценту в организм плода не проникают. Обнаружение антител в крови у новорожденного до первого кормления молозивом свидетельствует о нарушении плацентарного барьера, трансплацентарном проникновении пассивных антител или возбудителя и синтез специфических антител организмом плода.

Важным отличительным признаком предлагаемого способа является и то, что по этому способу проводятся также исследования первородного кала на наличие антигенов возбудителя. Обнаружение антигена является непосредственным доказательством инфицирования плода,

Комплексное определение в преколост- ральной сыворотке крови антител и в первородном кале антигенов возбудителя также является важным отличительным призна ком,поскольку позволяет более достоверно выявлять животных, инфицированных в фе- тальный период развития.

Существенным признаком предлагаемого способа является и то, что для обнаружения антигенов возбудителя использовались не поликлональные сыворотки, а моноклональные антитела высокой специфичности, что позволяет исключить ошибки, обусловленные реагированием антител с родственными антигенами различных возбудителей.

Отличительные признаки, характерные предлагаемому способу, являются весьма существенными, а ихсовокупность позволяет значительно повысить точность диагностики. Доказательством существенности признаков является непосредственное обнаружение антигенов возбудителя в организме новорожденного.

Основанием для суждения о внутриутробном инфицировании по известному способу является 4-кратное превышение титров антител у новорожденного по сравнению с материнским организмом. Дейст-

вительно, антитела образуются в организме в ответ на действие антигена. Однако синтез антител и накопление их в крови зависит от многих факторов: дозы антигена и крат5 ности его поступления, состояния иммунной системы, условия кормления, содержания и многих других. Поэтому они являются косвенным показателем инфицирования.

10Предлагаемый способ основан на обнаружении антигенов возбудителя в организ ме новорождённого, т.е. прямого показателя инфицирования.

Эффективность диагностики обусловле15 ны комплексным определением в организме как специфических антител, так и антигенов возбудителя4. Результаты иссле дований (см.табл.2) свидетельствуют о том, что встречаются животные (3044, 3078) в сы- 20 воротке которых антитела отсутствуют при наличии антигена в организме. Также имели место случаи, когда антиген отсутствовал, а антитела обнаруживались в диагностических титрах (3005, 3081, 3029, 3006, 3049. 25 3069, 3041, 3001). Комплексное обнаружение в организме антител и антигенов возбу дителяпозволяет избежать диагностических ошибок и своевременно принять меры по профилактике болезни у 30 новорожденных.

Эффективность диагностики повышена также за счет использования моноклональ- 35 ных антител. Последние обеспечили повышение чувствительности реакции по обнаружению антигенов до 1 нг/мл.

40Формула изобретения

Способ диагностики внутриутробного инфицирования ягнят бруцеллезом путем определения антител в сыворотке крови, о т- личающийся тем, что, с целью повыше45 ния точности способа, одновременно с определением антител в сыворотке крови проводят определение антигенов в первородном кале.

Использование: ветеринария, иммуно- логическая диагностика. Сущность изобретения: для диагностирования внутриутробного инфицирования ягнят бруцеллезом. Одновременно с определением антител в сыворотке крови проводят определение антигенов в первородном кале, 2 табл.

Таблица 1

Примечание. За значение оптической плотности (ОП) контроля взят средний показатель ОП 10 проб преколостральных сывороток новорожденных ягнят благополучной по инфекционным и незаразным болезням опары по аналогичной схеме постановки ИФА.

О - специфические антитела не обнаружены.

Продолжение таблицы 1

Таблица 2

Примечание. В качестве контрольного образца использовались пробы меконий новорожденных ягнят благополучной по инфекционным и незаразным болезням отары.

Чувствительность использованного ИФА по отношению к бруцеллезному антигену соста вила 1 нг/мл.

Продолжение таблицы 2