СРЕДА ИНКУБАЦИИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ КАТАЛАЗЫ В ПЛАЗМЕ КРОВИ Российский патент 2001 года по МПК G01N33/48 G01N33/573 G01N33/84 G01N33/68 

Описание патента на изобретение RU2175445C2

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в терапии, кардиологии, биохимии, биологии.

Известна среда инкубации для определения активности каталазы (КФ 1.11.1.6) с реактивом перманганата калия (1) с воспроизводимостью метода до 8,7% и по снижению концентрации перекиси водорода в кювете спектрофотометра при длине волны λ = 240 нм [1].

Известна также среда инкубации, содержащая фосфатный буфер, ацетилацетон / метанол, перекись водорода [2].

Указанные среды инкубации для определения активности каталазы в плазме крови не обеспечивают высокой точности определения активности каталазы в плазме крови и не позволяют проводить кинетическое определение активности каталазы.

Наиболее близкой (прототип) является среда инкубации для определения активности каталазы в тест-системе для определения общего холестерина крови [3], содержащая фосфатный буфер 600 мм/л, pH 7,0, ацетилацетон / метанол 420 мм/л/ 2500 мм/л, гидроксиполиетоксидекан 2,1%, перекись водорода 11,6 мм/л. Конечный объем смеси 760 мкл (длина оптического пути 1 см). Измерение проводят при λ = 405 нм и температуре 37oC после 45-минутной инкубации пробы. Регистрацию начинают после внесения 60 мкл раствора метанол/каталазы. Регистрируют окрашенный комплекс 3,5-диацил-1,4 дигидролутидина с одновременным определением холестеролэстеразы в инкубацинной среде.

Известна среда инкубации для определения холестерола, в которой под влиянием холестеролоксидазы холестерол превращается в холестенон, а побочным продуктом реакции является H2O2, которая под влиянием добавленной каталазы превращается в H2O2 с одновременным окислением метанола в формальдегид. Полученный формальдегид хорошо растворим в воде при температуре 37oC и прозрачен. Он реагирует с ацетилацетоном в присутствии фосфата аммония с образованием окрашенного в желтый цвет 3,5-дигидролутидина, регистрируемого при λ = 405 нм при условии линейной зависимости протекания реакции в течение 9 минут.

Как показали экспериментальные исследования, проведенные нами, среда инкубации-прототип не дает возможности определения линейной зависимости реакции, то есть не позволяет проводить кинетическое определение активности каталазы, так как в среде инкубации прототипа предусмотрена концентрация ингредиентов, оптимальная для предварительного исследования активности холестеролэстеразы, а именно концентрация фосфатного буфера высока и в 10 раз отличается от оптимальной молярности буфера, используемой при определении активности каталазы и других ферментов переокисления [2, 4, 5].

Задачей, решаемой данным изобретением, является повышение качества среды за счет возможности регистрации кинетики активности каталазы.

Поставленная задача решается путем создания инкубационной среды для кинетического определения активности каталазы в плазме крови, содержащей фосфатный буферный раствор, ацетилацетон, метанол, перекись водорода, хлорид аммония и тритон Х-100 при следующем соотношении компонентов, ммоль/л:
K2HPO4/NaH2PO4 - 60
NH4Cl - 500
Ацетилацетон - 500
Метанол - 500
H2O2 - 11,6
Тритон Х-100 - 0,769
В проанализированной авторами литературе не найдено совокупности отличительных признаков и они явным образом не следуют для специалиста из уровня техники. Данную среду инкубации можно использовать для регистрации кинетики активности каталазы в плазме крови.

Таким образом, данное техническое решение соответствует критериям изобретения "новизна" и "изобретательский уровень", промышленно применимо.

Для определения активности каталазы в плазме крови среду инкубации получают указанным выше образом.

Затем вносят 60 мкл плазмы крови.

Регистрацию проводят в течение 10 мин.

Пример 1.

Больной В., 40 лет, обследование в НИИКИФ МЗРФ, г. Томск 21.05.97 г. по поводу ИБС, стенокардии напряжения, ФК II.

Общий анализ крови отклонений от нормы не имел. СОЭ 78 мм/ч, НВ 154 г/л; эритроциты 5,5•1012/л.

Активность каталазы в плазме крови определена с помощью предложенной среды инкубации и составляла 6,0 мкат/л.

Кинетическая кривая активности каталазы представлена на графике N 5 (см. фиг. 5).

Среда инкубации для определения активности каталазы была апробирована в ряде экспериментов (см. выше) и при проведении клинических испытаний. При кинетическом определении активности каталазы в плазме крови у 96 больных ишемической болезнью сердца (ИБС) и здоровых лиц (табл. 5 и график N 5).

С целью получения оптимальной среды инкубации для определения активности каталазы крови нами были проведены экспериментальные исследования с использованием среды инкубации способа-прототипа.

С помощью среды инкубации возможно определение активности каталазы, что продемонстрировано нами с помощью введения в инкубационную среду вместо каталазы плазмы крови сухой кристаллической каталазы фирмы "Fluka" в концентрации, указанной в способе-прототипе (2460000 ЕД/л). Кинетика реакции и статистическая обработка результатов представлены на графике N 1 (см. фиг. 1) и в таблице N 1. Реакция протекала нелинейно.

Далее мы внесли в инкубационную смесь концентрацию каталазы, близкую к таковой в плазме крови.

Результаты представлены на графике N 1 и в таблице N 1.

Экспериментальным путем подбирались оптимальные концентрации ингредиентов реакции. Результаты измерения концентрации фосфатного буфера, pH 7,0 с последующим определением кинетики каталазной реакции представлены на графике N 2 (см. фиг. 2). Результаты измерения концентрации ацетилацетона с последующим определением кинетики каталазной реакции представлены на графике N 3 (см. фиг. 3) и в таблице N 3. Результаты изменения концентрации метанола с исследованием кинетики каталазной реакции представлены на графике N 4 (см. фиг. 4) и в таблице N 4. Результаты определения кинетики каталазной реакции в оптимальных условиях представлены на графике N 1 и в таблице N 1.

При изменении концентрации веществ в инкубационной среде в сторону их увеличения или уменьшения реакция замедляется, что свидетельствует о подобранной авторами оптимальной концентрации ингредиентов для фотометрического определения кинетики активности каталазы. При других концентрациях ингредиентов среды инкубации подобного эффекта не достигнуто.

Таким образом, предлагаемая среда инкубации для определения активности каталазы в плазме крови позволила с достаточно высокой специфичностью до 99% определить активность каталазы в плазме крови. Этот факт проверен с блокированием фермента NaN3 • 10 м/л с чувствительностью до 0,01 ед. оптической плотности (прибор ФП-901 позволяет измерять ее с точностью до 0,001) и с воспроизводимостью до 4,06 %.

Используемая же среда инкубации способа-прототипа позволила получить воспроизводимость метода, равную 16,7%.

Данные преимущества использования предложенной среды инкубации для определения активности каталазы в плазме крови были достигнуты дополнительным введением в среду инкубации NH4Cl, снижением в 10 раз концентрации фосфатного буфера [4-6], изменением концентрации ацетилацетона/метанола.

Введение NH4Cl и изменение концентрации компонентов инкубационной среды позволило определить кинетику активности каталазы в плазме крови.

Предлагаемая среда инкубации позволила создать оптимальные условия для кинетического определения активности каталазы в плазме крови в течение 9 минут, что позволяет рекомендовать разработанную среду инкубации для проведения клинических лабораторных исследований. В настоящее время не вызывает сомнений необходимость одновременно с исследованием интенсивности процессов перекисного окисления липидов (определения концентрации малонового диальдегида, активности миелопероксидазы, супероксидисмутазы, глутатионпероксидазы) определения активности каталазы в плазме крови для оценки наследственной предрасположенности к атеросклерозу, возможности ранней диагностики ишемической болезни сердца и острого инфаркта миокарда, а также ряда аутоиммунных заболеваний [6, 7].

В настоящее время в клинической практике отсутствует оптимальная среда инкубации для определения активности каталазы в плазме крови, так как до недавнего времени считалось, что активность этого фермента в крови и моче изменяется только при железодефицитной анемии, талассемии, пернициозной анемии, гематурии, протенурии, пиурии. Однако в настоящее время в связи с решением самых насущных задач профилактической медицины стало необходимо определение активности каталазы одновременно с определением активности креатинфосфокиназы, трансаминаз, ферментов антиоксидантной защиты на разных стадиях коронарного атеросклероза и при разработке способов его профилактики.

Следовательно, разработка среды инкубации для определения активности каталазы в плазме крови насущно необходима в клинической лабораторной практике, так как эта среда инкубации позволяет проводить клиническое определение активности каталазы в биологических объектах.

ЛИТЕРАТУРА
1. Архипова О. Г. в кн: "Методы исследования в профкардиологии", 1988, 127-157.

2. Burs R.F. SIZER L.W. BIOL. CHEM. 1952. N 195. P. 133-140.

3. ROSCHLAN R. et al. Z. KLIN. CHEM. KLIN. BIOCHEM. 1974. N 12. P. 403.

4. Ланкин В.З. и др. Кардиология, 1980, N 7, с. 97-99.

5. Ланкин В.З. Тер. архив, 1985, N 5, с. 58-62.

6. Давиденкова Е.Ф., Шафран М.Г., Векслер Б.М. Клин. Мед., 1990, N 2, с. 34-38.

7. Давиденкова Е.Ф. и др. Клиническая медицина, 1990, N 2, с. 34-38.

8. Прайор. Свободные радикалы в биологии. - М.: Мир, 1979, том 1, 317 с.

9. Осипов А.Н., Азизова О.А., Владимиров В.А. Успехи биологической химии. - М.: Наука, 1990, том 31, с. 180-208.

Похожие патенты RU2175445C2

название год авторы номер документа
СПОСОБ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕЧЕНИЯ ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ СЕРДЦА 1995
  • Канская Н.В.
  • Карпов Р.С.
  • Байков А.Н.
  • Ланкин В.З.
  • Студницкий В.Б.
  • Гриднева Т.Д.
  • Перова Н.В.
RU2122732C1
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИРАДИКАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ 2001
  • Ситожевский А.В.
  • Хавалкин И.В.
  • Иванов В.В.
  • Луста И.В.
  • Груздева О.В.
  • Суслова Т.Е.
  • Федорова Т.С.
  • Кондакова И.В.
  • Бочкарева Н.В.
RU2199749C1
СПОСОБ ОЦЕНКИ ОБЩЕЙ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ КРОВИ 1995
  • Канская Н.В.
  • Байков А.Н.
  • Ланкин В.З.
  • Карпов Р.С.
  • Студницкий В.Б.
  • Гриднева Т.Д.
  • Перова Н.В.
RU2116649C1
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФРАКЦИЙ ЛИПОПРОТЕИДОВ КРОВИ У БОЛЬНЫХ ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНЬЮ СЕРДЦА 2000
  • Канская Н.В.
  • Карпов Р.С.
  • Перова Н.В.
  • Канский А.В.
  • Пахряев Е.Н.
RU2200950C2
СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТЕЧЕНИЯ ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ СЕРДЦА 1995
  • Канская Н.В.
  • Карпов Р.С.
  • Байков А.Н.
  • Ланкин В.З.
  • Студницкий В.Б.
  • Левицкий Е.Ф.
  • Перова Н.В.
RU2102756C1
СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ РАННЕЙ СТАДИИ ПЕРВОЙ ФАЗЫ СИНДРОМА ДИССЕМИНИРОВАННОГО ВНУТРИСОСУДИСТОГО СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ ПРИ ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ СЕРДЦА 1991
  • Тухватулин Р.Т.
  • Канская Н.В.
  • Карпов Р.С.
  • Плеханов Г.Ф.
RU2012886C1
СПОСОБ ВТОРИЧНОЙ ПРОФИЛАКТИКИ ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ СЕРДЦА ПРИ РАННЕЙ ФИЗИЧЕСКОЙ РЕАБИЛИТАЦИИ БОЛЬНЫХ, ПЕРЕНЕСШИХ ИНФАРКТ МИОКАРДА 1998
  • Бородина Л.М.
  • Шалаев С.В.
  • Каземов В.В.
RU2154401C2
СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТЕЧЕНИЯ ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ СЕРДЦА 2000
  • Канская Н.В.
  • Федорова Н.А.
  • Перова Н.В.
  • Гарганеева Н.П.
  • Кожанова А.А.
  • Байков А.Н.
  • Канский А.В.
  • Похряев Е.Н.
RU2210076C2
СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ХРОНИЧЕСКОЙ ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ СЕРДЦА 2001
  • Тепляков А.Т.
  • Телкова И.Л.
RU2200951C2
СПОСОБ РАННЕЙ ФИЗИЧЕСКОЙ РЕАБИЛИТАЦИИ БОЛЬНЫХ ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНЬЮ СЕРДЦА 1998
  • Бородина Л.М.
  • Шалаев С.В.
RU2154460C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 175 445 C2

Реферат патента 2001 года СРЕДА ИНКУБАЦИИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ КАТАЛАЗЫ В ПЛАЗМЕ КРОВИ

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в кардиологии, терапии, биохимии, биологии. Сущность изобретения заключается в создании среды инкубации для определения активности каталазы в плазме крови, содержащей фосфатный буфер K2HPO4/NaH2PO4 60 мМ/л, рН-7, хлорид аммония 500 мМ/л, Тритон Х-100 0,769 мМ/л, Н2О2 11,6 мМ/л. Указанный состав инкубационной среды позволил с высокой точностью определить фотометрически кинетику активности каталазы в плазме крови при λ = 405 нм, t = 37oC в течение 9 мин. Изобретение позволяет повысить качество среды инкубации и точность определения. 5 табл., 5 ил.

Формула изобретения RU 2 175 445 C2

Среда инкубации для определения активности каталазы в плазме крови, содержащая фосфатный буферный раствора ацетилацетона, метанол, перекись водорода, детергент, отличающаяся тем, что среда инкубации дополнительно содержит хлорид аммония, а в качестве детергента тритон X-100 при следующем соотношении компонентов, мМ/л:
K2HPO4/NaH2PO4 - 60
Ацетилацетон - 500
Метанол - 500
H2O2 - 11,6
Тритон Х-100 - 0,769
NH4Cl - 500е

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2001 года RU2175445C2

ROSCHLAN R
et al
KLIN.CHEM./KLIN
ВIOСНЕМ
ПРИБОР ДЛЯ ЗАПИСИ И ВОСПРОИЗВЕДЕНИЯ ЗВУКОВ 1923
  • Андреев-Сальников В.А.
SU1974A1
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УРОВНЯ МЕМБРАНОСВЯЗАННОЙ КАТАЛАЗЫ ЭРИТРОЦИТОВ 1992
  • Кашулина А.П.
  • Сотникова Е.Н.
  • Александрова Л.М.
RU2050004C1
ЛЕСОУДЕРЖИВАЮЩАЯ ЗАПАНЬ ДЛЯ ПРИЕМА И ХРАНЕНИЯ ДРЕВЕСИНЫ НА ВОДЕ 1991
  • Чубов Н.И.
  • Байрамов А.Б.
  • Колядинская Л.Ф.
  • Толоконников В.В.
  • Миневич О.О.
RU2013341C1
СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ СТЕНОКАРДИИ И ИНФАРКТА МИОКАРДА 1992
  • Демидов А.А.
  • Вишневецкий Ф.Е.
RU2067769C1

RU 2 175 445 C2

Авторы

Канская Н.В.

Федорова Н.А.

Левицкий Е.Ф.

Перова Н.В.

Ланкин В.З.

Даты

2001-10-27Публикация

1999-11-15Подача