Способ получения суммы фенольных соединений Советский патент 1993 года по МПК A61K35/78 

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается производства лекарственных средств из растительного сырья.

Цель изобретения - упрощение и сокращение продолжительности способа, увеличение выхода целевого продукта, повышение активности целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что способ получения суммы фенольных соединений из надземной части молочая грузинского (Euphorbia Iberica) осуществляют путем обезжиривания сырья хлороформом в аппарате Сокслета методом непрерывной экстракции (до исчезновения зеленой окраски хлороформа, вытекающего из экстрактора аппарата Сокслет) с последующим подсушиванием сырья под тягой, затем одновременно осуществляют измельчение

и экстрагирование сырья 96%-ным этиловым спиртом при соотношении сырье: экстрагент в интервале 1:15 - 1:20 способом вихревой экстракции, затем экстрагируют методом непрерывной экстракции горячим 96%-ным этанолом не менее 30 мин. далее экстракт отделяют от шрота фильтрованием через бумажный фильтр, фильтрат упаривают под вакуумом и высушивают остаток при 70°С.

В литературе мы не нашли сведений об аналептическом действии флавоноидов,

В предлагаемом способе вихревая экстракция сырья осуществляется в приборе Мельэкстрактор, где одновременно происходит два процесса: измельчение и экстракция; причем, благодаря наличию двух пар ножей, расположенных горизонтально и под углом 45° к рабочей оси прибора,

ваямЗ

ОкЕкчй

измельчение сырья идет по всем направлениям с разрывом клеточных стенок, что способствует дополнительно извлечению полифенолов не только из межклеточного, но и из внутриклеточного сока, а следовательно, это способствует увеличению выхода целевого продукта. За счет высокой скорости перемешивания в максимально короткий срок наступает равновесие в сис- деме сырье: экстрагент, что значительно сокращаетпродолжительностьтехнологических процессов.

Дальнейшее экстрагирование сырья в аппарате Сокслета горячим этанолом способствует максимальному извлечению сум мы .фенольных соединений из сырья.

Способ поясняется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1. 100 г надземной части молочая грузинского подвергали обезжириванию в аппарате Сокслета с 0,5 л хлороформа до тех пор, пока хлороформ, вытекающий из экстрактора аппарата Сокслета, не станет бесцветным. Затем сырье подсушивали в вытяжном шкафу до удаления остатков растворителя, после чего сырье загружали в прибор Мельэкстрактор. заливали 1,5 л- 96%-ного этилового спирта (комнатной температуры) и перемешивали в приборе Мельэкстрактор при скорости вращения измельчающих ножей 8000 обор./мин в течение 5 мин. Затем сырье с экстрагентом переносили из стакана прибора Мельэкстрактор в аппарат Сокслета и далее в нем экстрагировали сырье методом непрерывной экстракции при температуре кипения этилового спирта в течение 30 мин. Затем экстракт отделяли от шрота фильтрованием через бумажный фильтр. Фильтрат упаривали примерно до 50 мл под вакуумом и сушили остаток в вакуум-сушильной шкафу.

Выход суммы фенольных соединений 27,65% к сырью, т.е. 27,65т из 100 г сырья. Общая продолжительность процесса - . 2ч. . . . ..;.. .

Целевой продукт - сумма фенольных соединений из молочая грузинского .- представляет собою порошок бурого цвета со специфическим запахом и горьковато-кислым вкусом, растворим в воде, этаноле.

Прим е р 2. 100 г надземной части молочая грузинского подвергали обезжириванию в аппарате Сокслета с 0,5 л хлороформа до тех пор, пока хлороформ, вытекающий из экстрактора аппарата Сокслета, не станет бесцветным. Затем сырье подсушивали в вытяжном шкафу до удаления остатков растворителя, после чего сырье загружали в прибор Мельэкстрактор, заливали 1 л 90%-ного этилового спирта (комнатной температуры) и перемешйва- ли в приборе Мельэкстрактор при скорости вращения измельчающих ножей

6000 обор./мин в течение 3 мин. Затем сырье с экстрагентом переносили из стакана прибора Мельэкстрактор в аппарат Сокслета и далее в нем экстрагировали сырье методом непрерывной экстракции при тем0 пературе кипения этилового спирта в течение 15 мин. Затем экстракт отделяли от шрота фильтрованием через бумажный фильтр. Фильтрат упаривали примерно до 50 мл под вакуумом и сушили остаток в вз5 куум-сушильном шкафу.

Выход суммы фенольных соединений составляет 27.56% к сырью, т.е. 27,56 г из 100 г сырья.

Общая продолжительность процесса 2 ч.

0 Пример 3. 100 г надземной части молочая грузинского подвергали обезжириванию в аппарате Сокслета с 0,5 л хлороформа до тех пор, пока хлороформ, вытекающий из экстрактора аппарата Сокслета, не ста5 нет бесцветным. Затем сырье подсушива

ли в вытяжном шкафу до удаления остатков растворителя, после чего сырье загружали в прибор Мельэкстрактор. заливали 2 л 96%-ного этилового спирта (комнатной тем0 перзтуры) и перемешивали в приборе Мельэкстрактор при скорости вращения измельчающих ножей 10000 обор./мин в течение 8 мин. Затем сырьё с экстрагентом переносили из стакана прибора Мельэкст5 рактор в аппарат Сокслета и далее в нем экстрагировали сырье методом непрерывной экстракции при температуре кипения этилового спирта в течение 45 мин. Затем экстракт отделяли от шрота фильтрованием

0 через бумажный фильтр. Фильтрат упаривали примерно до 50 мл под вакуумом и сушили остаток в вакуум-сушильном шкафу при 70°С.

Выход суммы фенольных соединений

5 составляет 27,64% к сырью, т.е. 27,64 г из 100 г сырья.

Общая продолжительность процесса 2 ч.

П р и м е р 4 (по способу-прототипу). 100

г измельченной надземной части молочая

0 грузинского заливали смесью хлоро- формхпирт (9:1) в количестве 1 л и экстрагировали на кипящей водяной бане 6 ч. Полученные экстракты (6-кратная экстракция) объединяли (5,5 л), упаривали на водя5 ной бане до 1/10 (0,5 л) объема, а затем проводили доотгонку в вакууме досуха. Остаток растворяли в 20 мл этанола. прибавля- ли 60 мл дистиллированной воды, перемешивали и кипятили 30 мин с водяным холодильником. Далее остывший раствор

декантировали с образовавшегося осадка (повторили 4 раза). Полученные водно-спиртовые вытяжки объединили и упаривали в вакууме досуха.

Выход целевого продукта составил 9,17 г, или 9,17% к сырью.

Общая продолжительность способа-48 ч.

Нами изучена зависимость выхода суммы фенольных соединений от ряда технологических параметров (табл. 1, 2, 3).

Из табл. 1 следует, что оптимальным соотношением сырье: зкстрагент является предел 1:15-1:20. при этом обеспечивается наибольший выход суммы фенольных соединений.

Из табл. 2 следует, что оптимальной концентрацией экстрагента - этилового спирта является 96%. т.к. это обеспечивает наибольший выход суммы фенольных соединений.

Из табл. 3 следует, что максимальный выход суммы фенольных соединений обеспечивается при продолжительности экстрагирования горячим этанолом при продолжительности не менее 30 мин.

Полученная сумма фенольных соединений была подвергнута качественному анализу:

1. Реакция с цинком .в среде соляной кислоты (на флавоноиды) 0,50 г полученной суммы фенольных соединений растворяли в 10 мл 96%-ного этилового спирта, к раствору добавляли небольшое количество (30-50 мг) цинковой пыли. Раствор нагревали на водяной бане до кипения и оставляли на 10 мин. Раствор окрашивался в красный цвет, что свидетельствовало о наличии флавонои- дов.

2. Реакция на катехины 0.50 г полученной суммы фенольных соединений растворяли в 20 мл воды.

а) к 10 мл приготовленного раствора приливали 5 мл 2%-ного раствора хлорного железа, появляется зелено-черное окрашивание (катехины),

б) к 10 мл приготовленного раствора добавляли 5 мл 2%-ного раствора ванилина в соляной кислоте, появляется малиновое, окрашивание (катехины).

3) Реакция на антоцианы

0,4 г суммы фенольных соединений растворяли Б 10 мл 96%-ном этанола.

а) к 5 мл приготовленного раствора добавляли 3 мл 2%-ного раствора ацетата свинца. Появление красного осадка свидетельствовало о наличии антоцианов.

б) к 5 мл приготовленного раствора добавляли 3 мл 5%-ного раствора карбоната натрия. Появление фиолетового окрашивания свидетельствовало о наличии антоцианов,.

4. Реакция на антраценпроизводные 0,5 г суммы фенольных соединений рас5 творяли в 5 мл 10%-ного раствора едкого натра, кипятили 5 мин. После остывания смесь разбавляли 5 мл воды и фильтровали. 3 мл фильтрата помещали в пробирку, добавляли 3 мл 10%-ного раствора соляной

0 кислоты и 10 мл бензола. Осторожно перемешивали и после расслоения жидкости сливали бензольный слой, фильтруя его через небольшой комочек ваты. Фильтрат встряхивали с 3 мл 10%-ного раствора ам5 миака. Аммиачный слой приобретал вишневое окрашивание, что свидетельствовало о наличии антраценпроизводных.

5. бумажная хроматография для идентификации флавоноидов и их гликозидов.

0 0,5 г суммы фенольных соединений растворяли в 20 мл воды и этиловым эфиром извлекали флавонолы. Эфирный слой отделяли от водного раствора, упаривали. В водном растворе содержались гликозиды

5 флавонолов.

а) флавонолы в эфирном слое анализировали методом бумажной хроматографии (восходящий способ хроматографирования) в системе растворителей: н-бутанол-уксус0 ная кислота-вода (4:1:5). Пятна на хроматог- рамме были идентифицированы по их окраске в УФ-свете и по значениям Rf в сопоставлений с известными стандартными образцами. На хроматограмме было обна5 ружено 3 пятна с Rf 0.78; 0,55; 0,58. пятно с ,78 имело в УФ-лучах желтую окраску, два других пятна - коричневые окраски. Пятна в сравнении со свидетелями идентифицированы как кверцетин (,78); гипер0 озид (Rf 0.55), изокверцитрин (Rf 0,58).

б) Флавоноловые гликозиды, содержащиеся в водном растворе анализировали методом бумажной хроматографии (нисходящий способ хроматографирования) в систе5 ме растворителей: этилацетат-пиридин-вода (2:1:2), проявителем служил кислый анилин- фталат. На хроматограмме было обнаружено 1 пятно с Rf 0,175, которое в сравнении с достоверным образцом свидетеля было

0 идентифицировано как галактоза.

Выделенная сумма фенольных соединений подвергалась изучению острой токсичности и аналептическому действию.

Острая токсичность изучалась по мето5 ду Кербера на белых мышах при внутри- брюшинном введении исследуемых

соединений в объеме 1 мл водного раствора. Максимальная доза исследуемых соединений, возможная для введения, составившая 6000 мг/кг массы тела животного, не вызывала гибели животных, что позволило считать LDso 6000 мг/кг. Согласно классификации токсичности по Сидорову К.К. (1973) исследуемые соединения следует отнести к группе относительно безвредных веществ.

Аналептическзя активность изучалась на модели нембуталового сна. Известно, что большие дозы барбитуратов, в частности, нембутала (25 мг/кг массы тела) вызывают угнетение дыхания и сердечно-сосудистого центра в продолговатом мозге, в внутривен- ное введение приводит к остановке дыхания и резкому снижению артериального. давления.

Эталонным препаратом для сравнения аналептической активности был выбран ко- феин-бензоат натрия в дозе 10 мг/кг массы тела (внутрибрюшинное введение). По современным данным этот препарат относится к группе как психотропных, так и к группе аналептичёских средств. Кофеии-бензоат

натрия оказывает анэлептическое.действие: ослабляет действие снотворных и наркотических средств, повышает рефлекторную возбудимость спинного мозга, возбуждает дыхательный и сосудодвига .тельный центры. Это лекарственное средство предложено использовать в качестве стандарта при изучений а налептиче- ской активности.

Эксперименты были проведены на кры. сах-самцах массой 190-240 г. Одновременно ставилось . несколько серий экспериментов. В каждой серии по шесть животных (). Первая серия - контроль (внутрибрюши-нир вводили физиологический раствор). Вторая серия -стандартная

- {внутрибрюшинно вводили кофеин-бензо- ат-натрия в. дозе 10 мг/кг). Третья серия - опытная .(внутрибрюшмнно вводили исследуемые соединения - сумму фенольных соединений молочая грузинского - s дозе 10 мг/кг). Физиологический, рзствор, стандарт и исследуемую сумму фенольных соединений сводили за 30 мин до введения нембу- тал а, Дозы стандарта и исследуемых фенольных соединений подбирались по эффекту LD.50. Результаты- экспериментов представлены в табл. 4.

Таким образом, в результате проведен- ных экспериментов установлено, что ксфэ- ин-бензоатнатрия снижает продолжительность сна крыс на 26,82% по

сравнению с контролем, а исследуемая сумма фенольных соединений молочая соответственно - на 50,07%, т.е. сумма фенольных соединений молочая проявляет аналептическую активность, превышающую на 23,25% (50,07 - 26,82 23,25%) активность стандартного препарата - кофеина-бензоата натрия. Полученные результаты являются достоверно значимыми,

Итак, описанный способ обеспечивает:

1. Упрочнение процесса получения суммы фенольных соединений. Способ прост в выполнении, исключает многостадийность. В то время как способ-прототип включает в себя шестикратную экстракцию, четырехкратную обработку остатка.

2. Продолжительность способа 2 ч, способа-прототипа 48 ч, т.е. продолжительность данного способа в 24 раза меньше продолжительности известного.

3. Повышение выхода целевого продукта. В данном способе выход суммы фенольных соединений составляет 27,65% к исходному сырью, что в 3 раза превышает выход продукта в способе-прототипе (9,17%)при использовании в качестве сырья молочая грузинского.

4. Повышение активности целевого продукта. Фенольныа соединения из молочая, полученные предлагаемым способом, проявляют зиалептическую активность, превышающую на 23,25% таковую активность эталонного препарата - кофеина-бензоата натрия. Кроме того, фзиольные соединения молочая являются относительно безвредны- . ми веществами.

Формула изобретения

Способ получения сурьмы фенольных со- единений из растительного сырья путем-экстракции хлороформом, спиртом, упзрмаания и сушки экстракта, отличаю- щ м и с я тем, что, с целью упрощения и сокращения продолжительности процесса, 5 увеличения выхода и повышения активности целевого продукта, надземную часть мо- лочая грузинского Euphorbia Iberlca одновременно измельчают и экстрагируют 96%-ным этиловым спиртом при соотноше- 0 кии сырье: з.кстрагент 1:15 1:20 методом змхревой экстракции, затем экстрагируют методом непрерывной экстракции горячим 96%-ным этанолом. не менее 30 мин,

Таблица 1

Использование: в фармацевтической промышленности, касается производства лекарственных средств из растительного сырья. Сущность изобретения: наземную часть молочая грузинского Euphorbia Ibeiica обезжиривают хлороформом в аппарате Со2 кслета до исчезновения зеленой окраски хлороформа, вытекающего из аппарата, и подсушивают сырье. Затем осуществляют одновременное измельчение и экстрагирование 96%-ным этиловым спиртом при соот- ношении сырья: -экстрагент 1:15-1:20 методом вихревой экстракции, затем экстрагируют методом непрерывной экстракции горячим 96%-ным этанолом для менее 30 мин. Полученный экстракт отделяют от шрота фильтрованием, фильтрат упаривает под вакуумом и высушивают. Положительный эффект: упрощение и сокращение продолжительности процесса, увеличение выхода и повышение активности целевого продукта.

Влияние соотношения сырья:экстрагент на выход суммы фенольных соединений

Таблица2 Влияние концентрации этилового спирта на выход суммы фенольных соединений

.ТаблицаЗ

Влияние продолжительности экстрагирования горячим этанолом в аппарате Сокслета на

выход суммы фенольных соединений

Т а б л и ц а 4

Влияние суммы фенольных соединений молочая грузинского на продолжительность нембуталового сна (мин)