Способ получения энтеротоксина еSснеRIснIа coLI Советский патент 1993 года по МПК A61K39/108 

Изобретение относится к биотехнологиии касается способа получения конюъгированно- го термостабильного энтеротоксина кишечной палочки и может быть использован в производстве вакцинных препаратов против колибакте- риоза и смешанной инфекции (колибактериоз, рота-, коронавирусная инфекция).

Целью изобретения является значительное упрощение, ускорение способа получения конъюгированного иммуногенноактивного термрстабильного энтеротоксина E.coll, а также повышение его биологической активности.

Поставленная цель достигается тем, что культуру E.coli, продуцирующую термостабильный энтеротоксин, высевают на среду Альдерете, инкубируют в течение 20-24 часов при 37°С в условиях аэрации. Отделяют бакмассу центрифугированием при 6000- 8000 об/мин в течение 30-40 мин при 2-4°С. Надосадочную жидкость, содержащую нативный энтеротоксин сливают в стерильную посуду и подвергают концентрированию и очистке.

К 1 мл раствора нативного термостабильного энтеротоксина приливают 4 мл метанола, перемешивают и центрифугируют 30-40 мин при 6000-8000 об/мин на холоду. Добавляют 1 мл хлороформа. Верхний слой отбрасывают, а к нижней хлороформсодер- , жащей фазе приливают 0,3 мл метанола, перемешают и центрифугируют 30-40 мин при 6000-8000 об/мин, при 2-4°С. Отделяют супернатант и высушивают осадок в потоке воздуха.

Проводит фракционирование суммарной белковой фракции термостабильного энтеротоксина E.col на хроматографиче- еских колонках с сефадексом G-25. Элюцию проводят 0,16 н NaCf. Концентрацию белка в выделенных фракциях определяли с помощью спектрофотометра СФ-26 при 260 и 280 нм по методу Варбурга и Христиана.

Для электрофоретического контроля гомогенности выделенного материала его растворяют в 50 мкл фосфатно-солевого буфера, содержащего 5% ДСН.

(Л

с

со со ся ю

SQ

Биологическую активность выделенных фракций определяют путем постановки проб на мышатах-сосунах по методу Дина. Белковую фракцию обладающую максимальной биологической активностью концентрируют против ПЭГ, высушивают в потоке воздуха и используют для конъюгации.

1,0 г термостабильного энтеротоксина E.coll разводят в 4-6 мл дистиллированной воды. (рН 7,0-7,2), Добавляют 10 мл 1 М МаСОз(рН 10,2-10,4) и 10гбензилпеницил- лина-К-соли. Доводят рН до 9,6 5 М NaOH и если необходимо, добавляют дистиллированную воду для полного растворения пенициллина. По 5-6 г бензилпенициллина добавляют через 12- и 24 часа. После каждого добавления рН доводят до 11,0. Через 5-6 часов после последнего внесения пенициллина проводят диализ против 0,002 М фосфатно-солевого буфера с рН 8,0-8,2 в течение 20-24 часов, в 20-100 кратном объеме при 2/3 кратной смене буфера.

Концентрацию белка устанавливают с помощью спектрофотометра СФ-26 при 280 нм по методу Варбурга и Христиана.

Процент термостабильного энтеротоксина в конечном конъюгате определяют по разнице концентраций белка до и после диализа. Полученный материал при необходимости концентрируют до 1/10 объема против ПЭГ,

Сопоставительный анализ заявляемого решения с прототипом показывает,что заявляемый способ отличается от известногр тем, что культивирование токсигенного штамма E.coli проводят на одной питательной среде, а не на трех, как в прототипе. Это существенно не влияет на активность термостабильного энтеротоксина E.coll, но значительно сокращает время его получения. Термостабильный энтеротоксин концентрируют и очищают быстрым и легкодоступным способом, в отличие от громоздкого трех-этап- ного процесса, что позволяет максимально сохранить его активность и специфичность. Термостабильный энтеротоксин после концентрирования и очистки сохраняет свою целостность, в отличие от его производных в прототипе, что позволяет полностью сохранить активность и специфичность его антигенных детерминант. При увеличении времени и усложнении методов очистки активность и специфичность термостабильного энтеротоксина значительно снижается, или требуется создание дополнительных условий для их стабилизации. В предлагаемом способе разработаны условия и подобраны оптимальные условия для конъюгации термостабильного энтеротоксина с бензилпе- нициллин - К - солью.

Однородность полученного конъюгата подтверждают результатами диск-электрофореза в полиакриламидном геле.

Сравнение заявляемого технического решения с прототипом позволило установить соответствие его критерию новизна.

При изучении других известных технических решений в данной области признаки., отличающие заявленное изобретение от прототипа, не были выявлены и потому они обеспечивают заявляемому техническому решению соответствие критерию существенные отличия,

о

5Способ осуществляется следующим образом.

Пример, Культуру кишечной палочки выделенную от павшего животного, продуцирующую термостабильный энтеротоксин

0 высевают на питательную среду Альдерете и культивируют в течение 24 часов при 37°С в условиях аэрации. Жидкую культуру центрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 мин при 2°С и получают надосадочную жид5 кость содержащую энтеротоксин. Надосадочную жидкость сливают в стерильную посуду и подвергают концентрации и очистке.

К 1 мл раствора нативного термостабильного энтеротоксинэ приливают 4 мл

0 метанола, перемешивают и центрифугируют 30 мин при 6000 об/мин «a холоду (2°С), добавляют 1 мл хлороформа. Верхний слой отбрасывают, а к нижней хлороформсо- держзщей фазе приливают 0,3 мл метанола,

5 перемешивают и цинтрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 мин при 2.QC. Отделяют супернатант и высушивают осадок в потоке воздуха.

Проводят фракционирование суммар0 ной белковой фракции термостабильного энтеротоксина E.coli на хроматографиче- ских колонках с сефадексом G-25. Элюцию проводят 0,15 н NaCI. Концентрацию белка в выделенных фракциях определяют с по5 мощью спектрофотометра СФ-26 при 260 и 280 нм по методу Варбурга и Христиана.

Для электрофоретического контроля гомогенности выделенных фракций их разводят в 50 мкл фосфатно-солевого буфера,

0 содержащего 5% ДСН.

Биологическую активность выделенных белковых фракций определяют путем постановки проб на мышатах-сосунах по методу Дина.

5 Белковую фракцию обладающую максимальной биологической активностью концентрируют против ПЭГ и высушивают в потоке воздуха.

Растворяют 1 г термостабильного энтеротоксина E.coli в 5 мл дистиллированной

воды рН 7,0. Добавляют 10 мл 1 М МаСОз рН 10,4 и 10 г бензилпенициллина-К-соли. Доводят рН до 9.6 5 М NaOH и если необходимо, добавляют дистиллированную воду для полного растворения пенициллина. Через 6 часов проводят диализ против 0,002 М фос- фатно-солевого буфера с рН 8,0 в течение 20 часов в 60 кратном объеме при 2-х кратной смене буфера.

Концентрацию белка в конъюгате устанавливают по методу Варбурга и Христиана.

Процент термостабильного энтеротоксйна в конечном конъюгате определяют по разнице концентраций белка до и после диализа. Полученный препарат при необходимости концентрируют до 1/10 объема против ПЭГ.

Однородность полученного конъюгата подтверждают результатами диск-электрофореза в полиакриламидном геле.

Контроль стерильности и безвредности полученного препарата осуществляют по общепринятой методике.

Иммуногенность препарата вместе с адъ- ювантом (раствор гидроокиси алюминия)проверяют на белых мышах. Вакцинирующий препарат вводят двукратно, подкожно, в дозе 0,3 и 0,5 мл с интервалом в 7 дней. Через 20 дней после второй прививки животных заражают летальными дозами термостабильного энтеротоксйна и культурами гомологичного и гетерологичнцх штаммов E.coli.

Вакцинированные животные в 95% случае проявляют устойчивость против 2 ДЛМ токсинов и ЛДбо культур гомологичного штамма и в 80% случае защита составила против 2 ДЛМ токсинов и ЛДбо культур ге- терологичных штаммов E.coli.

В контрольных группах мыши, которых заражают 2 ДЛМ токсинов и ЛДзо культур, пали в 90% случаев.

Сенсибилизирующую активность препарата исследуют в тесте активной системной анафилаксии на морских свинках по методу Немова.

0

5

0

5

0

5

0

5

Предложенный способ получения энте- ротоксина E.coli проще известного способа более чем в 20 раз сокращает время получения иммуногена, значительно уменьшает необходимые объемы реактивов и оборудования для получения препарата и существенно увеличивает биологическую активность термоетабиль- ного энтеротоксйна E.coli.

Полученный препарат обладает хорошо выраженными защитными свойствами против летальных доз термостабильного энте- ротоксика как гомологичного так и гетерологичных штаммов E.coli, Препарат безвреден и нетоксичен для лабораторных животных, не анафилактогенен. Технология его приготовления сравнительно проста и значительно коротка по времени, не требует дорогостоящего оборудования и реактивов.

Формула изобретения

Способ получения энтеротоксйна Escherichlacoll, включающий культивирование штамма-продуцента в жидкой питательной среде Альдерете, отделение токсиносодержа- щего суперматанта от бакмассы центрифугированием, концентрирование и очистку энтеротоксйна обработкой супернатанта метанолом и хлороформом, высушивание очищенного энтеротоксина, растворение его в воде, конъюгацию и диализ, отличающийся тем, что, с целью ускорения способа и увеличения биологической активности целевого продукта, центрифугирование проводят при 6000-8000 об/мин в течение 30-40 мин, обработку осуществляют путем последовательного добавления метанола, хлороформа и затем повторно метанола с центрифугированием при 2-4°С в течение 30-40 мин после каждого добавления, конъюгацию ведут калиевой солью бензилпенициллина при соотношении 1:10- 1:30 при р-Н 9,6 в течение 20-24 ч, диализуют против 0,002 М фос- фатно-солевого буфера с рН 8,0-8,2 и концентрируют до 1/10 объема против по- лиэтиленгликоля.

Использование: биотехнология, получение пенициллоил-термостабильного энтеротоксина Е.coil-вакцины против колибакте- риоза и смешанной инфекции, колибактери- оз, рота-, коронавирусная инфекция. Сущность изобретения; культуру E.coll, продуцирующую термостабильный энтероток- син, культивируют на среде А льде рете, Далее отделяют бакмассу, а энтеротоксин осаждают из жидкой фазы культуральной жидкости метанолом. Полученный осадок концентрируют и очищают. Очищенный энтеротоксин конъю- гируют с бёнзилпенициллин -К-солью. Энтеротоксин защищает животных как от гомологичного так и гетерологичных штаммов E.coli, продуцирующих термостабильный знтеротоксин. 1 пр. 2 табл.

Таблица 1

Влияние соотношения бензилпенициллин/термостабильный энтеротоксин на процент термостабильного энтеротоксина в конечном конъюгате и его иммуногенная активность

Иммуногенная активность энтеротоксина Б;соИ ft сравнении с термостабильным энтеротоксином E.coli и прототипом

Продолжение табл. . 1

Таблица 2